一种用于关节软骨修复的PLGA细胞支架及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种关节软骨修复材料及其制备方法和应用，特别涉及一种通过使用具有机械强度、组织相容性、生物降解性兼备的复合材料支架与成体细胞结合，制成的plga细胞支架，可用于临床治疗各种原因导致的软骨损伤。本发明属于医药技术领域。

背景技术：

软骨损伤是临床上的常见病与多发病，尤其在50岁以上的群体中关节损伤非常普遍。病变关节发生于身体不同部位，可单发也可多发，伴有不同程度的功能障碍。关节镜下能够发现不同程度的炎症反应，以及软骨缺损。一般情况下，医生会对症治疗，例如止痛、抗炎、理疗等；如果病变持续加重，软骨变薄，甚至软骨损失殆尽，活动时骨组织之间直接硬性摩擦,导致关节疼痛、肿胀、变形、骨刺增生等多种症状，此时会考虑手术治疗、甚至人工关节置换。软骨损伤治疗从最初的微骨折技术到近期的软骨修复技术，几十年的发展，走过了几个时代，概述如下：

微骨折手术。微骨折手术是一种骨髓刺激技术，也就是通过在关节面软骨缺损的部位钻出直径2mm、深度8mm、间隔2-3mm的微孔。骨髓血从这些微孔流出凝固形成血块，血块中的骨髓干细胞在关节内形成血痂，最后形成纤维软骨组织填补缺损。这种技术简单有效，短期效果好。但是，新形成的修复组织不是真正的关节透明软骨，几年后退化为骨组织，失去软骨的功能。

骨膜—软骨细胞移植术。该技术将软骨组织分离出来的软骨细胞，进行体外培养、扩增，然后再把细胞悬液注射至缺损处，以骨膜覆盖并严密缝合。缺点包括软骨组织样本量小、细胞数量少、培养周期长、细胞渗漏、骨膜增生、骨膜供区受损等等。

胶原膜—软骨细胞移植术。由于摘取骨膜而使供区受损，为了克服此不足，采用胶原膜替代前述骨膜的技术应运而生，但是伴随着与骨膜—软骨细胞移植术同样的弱点，比如周期长、细胞渗漏、细胞去分化等。

基质诱导软骨细胞移植术。以不同基质材料制备生物支架，诱导软骨细胞增殖的一种软骨损伤修复技术。它将软骨细胞种植于过渡性支架上，支架为细胞提供了三维生长空间，有利于软骨细胞表型维持和生长，然后再将含有增殖细胞的支架植入关节软骨缺损处，修复软骨损伤。其缺点包括细胞数量少、培养周期长、细胞去分化、基质材料残留毒性、基质细胞识别信号弱、材料单一及仿生效果差等。

目前市场上，有一款德国专利产品—关节面软骨缺损修复胶原膜，它是水解胶原蛋白后重新制备的蛋白膜，已经在欧盟、澳洲、日本、美国等地临床应用。鉴于该产品仅为胶原蛋白成分，无任何活细胞和生长因子，虽然可以广泛应用，但是与我们申报的产品不是同一类别，仅作参考。

软骨细胞移植技术修复软骨损伤，近年来已经有了长足进步，遗憾的是由于初始取材的软骨组织样本小，增殖缓慢的软骨细胞必须经过长时间的扩增才能达到一定的数量，治疗周期长，以及诱导基质吸收过快、基质材料细胞识别信号差、仿生效果不佳、细胞去分化等不利因素，导致治疗结果仍不尽人意。现在临床上亟需一种能够克服上述弱点的修复材料，治疗关节软骨损伤。组织学上，关节透明软骨呈现“洋葱”样多层次结构，每一层次包裹形态各异、不同数量的细胞。基于上述生物学特点，本发明结合干细胞技术、细胞三维(3d)培养技术，使用能够促进细胞增殖、调节多功能间充质细胞向软骨细胞表型特征分化的细胞生长因子，提出了一种新的软骨修复材料制备技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服既往软骨材料制备中的不足，提供了一种可用于关节软骨修复的plga细胞支架及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种用于关节软骨修复的plga细胞支架，所述的plga细胞支架包括plga多孔支架以及种植于该plga多孔支架中的软骨细胞、骨髓间充质干细胞以及脂肪干细胞；

其中，所述的plga多孔支架是由不同聚合比例聚乳酸(pla)和聚羟基乙酸(pga)的聚合产物组成的多层次复合支架；plga多孔支架分为外侧区、中间区、内侧区三个区域，向plga多孔支架的外侧区孔隙注射接种软骨细胞，向中间区孔隙注射接种软骨细胞与脂肪干细胞，向内侧区孔隙注射plga支架接种软骨细胞与骨髓间充质干细胞；

其中，外侧区是由聚乳酸(pla)：聚羟基乙酸(pga)聚合比例分别为100:0、85:15、75:25的聚乳酸(pla)和聚羟基乙酸(pga)的聚合产物依次叠加组成的三层结构；

其中，中间区是由聚乳酸(pla)：聚羟基乙酸(pga)聚合比例分别为50:50、25:75的聚乳酸(pla)和聚羟基乙酸(pga)的聚合产物依次叠加组成的两层结构；

其中，内侧区是由聚乳酸(pla)：聚羟基乙酸(pga)聚合比例分别为15:85、0:100的聚乳酸(pla)和聚羟基乙酸(pga)的聚合产物依次叠加组成的两层结构。

其中，优选的，所述的plga多孔支架表面采用多聚赖氨酸、明胶蛋白以及ⅱ型胶原蛋白进行修饰。

其中，优选的，所述的plga多孔支架是通过冷冻干燥方法或氯化钠盐颗粒方法制备。

其中，优选的，所述的plga多孔支架是通过以下方法制备得到：

plga多孔支架的制备：

a)将聚乳酸(pla)与聚羟基乙酸(pga)分别按照聚合比例100:0、85:15、75:25、50:50、25:75、15:85、0:100得到的pla/pga聚合产物(plga)，依次命名为plga1(pla：pga＝100:0)、plga2(pla：pga＝85:15)、plga3(pla：pga＝75:25)、plga4(pla：pga＝50:50)、plga5(pla：pga＝25:75)、plga6(pla：pga＝15:85)、plga7(pla：pga＝0:100)，将上述plga1-7分别称重，置于合适容器中，分别加入有机溶剂溶解plga1-7，得到含有plga1-7的有机溶液，plga1-7聚合物重量百分比终浓度为1～30％，在温度45℃条件下，低速搅拌1.5～2小时，直至完全溶解；

b)将溶解的plga1倾倒于锡纸造型的模具中，依需要铸成不同形状、高度，置-18～-20℃2～4小时；

c)在-20～-80℃，真空度10^-1mbar下，干燥17～36小时；

d)释放真空之前，将冷冻干燥容器内的plga1干燥物缓慢恢复至室温；

e)释放真空，将溶解的plga2倾倒于含有plga1干燥物的锡纸造型的模具中，使其位于plga1上方，置-18～-20℃2～4小时；

f)重复上述步骤c)-d)，将冷冻干燥容器内的plga1/plga2干燥物缓慢恢复至室温；

g)重复上述步骤e)-f)，分别将溶解的plga3、plga4、plga5、plga6、plga7依次倾倒于模具中，制备得到含有7种不同聚合比例pla/pga产物(plga)的多层次plga多孔支架；

h)从锡纸模具上小心地取下plga多孔支架，存放于干燥器中备用；

plga多孔支架的碱化处理：

a)配制浓度为3.0～5.0％w/v氢氧化钠溶液，取适量体积上述氢氧化钠溶液浸泡plga多孔支架，氢氧化钠体积要确保整个支架被液体完全覆盖；

b)低速磁力搅拌约1小时；

c)弃掉溶液，用高纯水洗涤plga多孔支架，低速磁力搅拌1小时，该步骤重复两次；

d)真空干燥plga多孔支架；干燥时间不少于24小时，然后存放plga多孔支架在密封容器中，以避免阳光紫外线分解作用；

多聚赖氨酸包被plga多孔支架：

a)多聚赖氨酸储液制备：poly-l-lysine用去离子水稀释，制备成浓度为15％w/v的储液；

b)将多聚赖氨酸储液稀释成工作浓度为0.2～5％w/v的l-多聚赖氨酸溶液用于包埋plga多孔支架，37℃恒温孵育4小时或常温过夜，4℃冰箱保存；

c)去除l-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗plga多孔支架，冷冻干燥备用；

plga多孔支架的蛋白包埋修饰：

a)制备蛋白包被液：配制浓度为4～10％w/v的明胶蛋白溶液，加入ⅱ型胶原蛋白使其终浓度为0.4～1.0％w/v，制备明胶蛋白—ⅱ型胶原蛋白包被液；

b)蛋白交联反应：放置plga多孔支架于含30～70mm2-吗啉乙磺酸的30～50％w/v的乙醇溶液中(ph4.8～5.2)平衡20-40分钟，接着进行交联反应，交联反应使用含有edc、nhs、透明质酸、硫酸软骨素以及l-多聚赖氨酸的蛋白包被液进行，其中edc的质量百分比浓度为0.6％～11％，nhs的质量百分比浓度为0.15％～0.275％，透明质酸的质量百分比浓度为0.1％，硫酸软骨素的质量百分比浓度为5％，l-多聚赖氨酸浓度为2～10mm/l，反应时间为4～6小时；

c)用0.1m的na2hpo4溶液清洗plga支架0.5小时，重复一次。去离子水反复清洗3次，置-20℃1小时，-80℃1小时，真空冷冻干燥72小时后备用；

d)京尼平交联反应：plga多孔支架浸泡在100ml的含有l-多聚赖氨酸以及京尼平的蛋白包被液中，其中，l-多聚赖氨酸浓度为2～10mm/l、京尼平浓度为5～15mm/l，室温下放置18～30小时；

e)再用pbs溶液冲洗步骤d)得到的plga多孔支架1小时，去离子水反复清洗3次,置-20℃1小时，-80℃1小时，真空冷冻干燥72小时后备用。

其中，优选的，步骤a)中所述的有机溶液为二恶烷。

其中，优选的，采用软骨细胞与脂肪干细胞共培养、软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养的方式获得软骨细胞、脂肪干细胞以及骨髓间充质干细胞。

其中，优选的，所述的plga细胞支架通过以下方法制备得到：

plga多孔支架预处理：

a)根据软骨损伤创面形状修整plga多孔支架，将plga多孔支架剪成适宜大小，用75％v/v酒精浸泡消毒、干燥；

b)用dmem完全培养基润洗plga多孔支架；

plga多孔支架上的细胞接种：

a)调整细胞浓度为5×10⁷/ml，用于接种plga多孔支架；向plga多孔支架的外侧区孔隙注射接种软骨细胞，向中间区孔隙注射接种共培养的软骨细胞与脂肪干细胞，向内侧区孔隙注射plga支架接种共培养的软骨细胞与骨髓间充质干细胞；每立方毫米支架细胞植入量为0.8～2×10⁵个；

b)将接种细胞的plga多孔支架置于含8～15％v/v血清的dmem培养基中，放入37℃、5％co2细胞培养箱中培养，72小时后换第一次培养基，之后每隔48小时更换培养基1次，得到所述的plga细胞支架。

其中，优选的，对plga细胞支架施加负载进行细胞的3d培养，在plga多孔支架上进行细胞3d培养时，通过增加培养基液面高度，施以静态压力，同时旋转培养容器使冲击压力达到1～2pa/cm²。给plga多孔支架施加一定的负载压力，不但增加了ⅱ型胶原表达水平，而且模拟了生理状态下软骨组织受力的实际情况。

进一步的，本发明还提出了所述的plga细胞支架在制备关节软骨修复材料中的应用。

关节软骨修复材料制备，需要三个主要条件：(a)合适的支架材料。需要兼顾到细胞毒性、降解速率、机械强度等要素；(b)功能正常、足够数量的种子细胞。该方案使用成体软骨细胞、多功能骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞等；(c)促进细胞增殖、调节多功能细胞向软骨细胞表型特征分化的细胞因子。本发明的技术方案概述如下：

1)支架材料。既往的研究证实，尚无一种单一材料或单一制备技术，制造出适合软骨组织特征的生物工程支架，细胞支架一定是复合材料，而且是应用综合技术制备的多层次复合材料，模拟透明软骨组织学上多层次生物学特点。

2)支架材料的组成成分、支架形貌结构对引导细胞增殖方向，以及诱导组织形成起到重要作用。支架的设计需要仿生软骨基质的结构特征，即“洋葱”样多层次结构。人工合成材料聚乳酸(pla)具备一定的机械强度,又有弹性,选用其作为生物材料中的基本成分,为了增加它的可降解性,将它与聚羟基乙酸(pga)复合,两者随机聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)已在美国通过fda认证，被正式作为药用辅料收录于美国药典。作为可降解的高分子有机化合物，具有较好的成膜性能与良好的生物相容性。在生物工程材料领域，它已经作为心脏支架材料得以在临床上广泛应用。然而，plga材料本身存在着疏水性，细胞识别位点弱等不足，亟待于克服。

3)增加细胞粘附性提高支架的生物兼容性。为了改善有机高分子材料的生物相容性,利用天然生物成分如多聚赖氨酸、胶原蛋白等，对支架进行表面修饰。

4)透明软骨组织的基质中，蛋白多糖则可控制其中的水分渗透，使占总重量80％的水分保存于软骨组织中。透明质酸与硫酸软骨素的蛋白交联对引导细胞增殖方向,诱导组织形成起到关键作用，这样制备的支架能够很好地仿生软骨组织的细胞外基质结构。

5)功能正常足够数量的软骨种子细胞以及辅助细胞(脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞)，其中软骨细胞体外扩增和间充质干细胞分离提取，细胞的三维(3d)培养等内容是关键的技术环节。软骨组织有很高的硬度和耐冲击力。因此，组织培养过程中，接种了细胞的支架要承载一定的机械压力，才能更好地模拟体内生理环境。

6)细胞培养过程中，使用能够促进软骨细胞增殖、调节辅助细胞向软骨细胞表型特征分化的细胞因子，例如细胞生长因子、转化生长因子等。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明制备得到的新型软骨修复材料(plga细胞支架)努力克服既往的技术不足之处，具有以下优势：(a)构建多层次复合支架。通常用于制备生物支架的基本材料，包括天然高分子材料如蚕丝蛋白、胶原蛋白、壳聚糖等，有机高分子材料聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸等。考虑到机械强度、组织相容性、生物降解性等相关因素，需要将不同材料的优点整合，期待获得优良的复合支架。已被fda认可的人工合成材料pla、pga、plga具有不同特点。相对于pla而言，pga降解快，体内第四周时质量损失率达到近60％，力学强度也下降迅速。使用不同比例的pla/pga(100:0、85:15、75:25、50:50、25:75、15:85、0:100)，可以调节细胞支架机械强度与降解速度。(b)分层设计的理念。组织学上关节软骨排列为四层，即表层、中间层、辐射层和钙化层。软骨基质中的胶原纤维大致排列为“拱型结构”，使其具有一定的强度和弹性。而蛋白多糖则可控制基质中的水分渗透，使占总重量80％的水分保存于软骨组织中，使软骨有很高的硬度和耐冲击力。透明软骨组织的基质与细胞并不是均匀分布的。依据其生物学特点，制备的软骨组织采取分层设计。通过层层组装方法获得具有类似“洋葱”结构的多层软骨移植体。(c)不同类别细胞之间的协同作用。多层软骨基质材料中包裹不同比例的软骨细胞、骨髓间充质干细胞(bm)、脂肪干细胞(svf)。软骨细胞如同种子一样，起着中坚作用，svf可以分泌ii型胶原强化软骨细胞的作用，同时受bm细胞分泌的生长因子刺激而加快增殖速度，而且bm细胞加入提高了细胞粘附率。此外骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞也能够在细胞因子诱导下，具有分化为软骨细胞的趋势。(d)特殊培养条件。多种细胞生长因子、机械压力在内的特殊培养条件,增加了细胞ii型胶原蛋白表达，充分模拟了软骨细胞生理状况下的生长条件；(e)令人满意的实验动物结果。贯彻分层设计的理念制备的软骨修复材料，采用不同类别细胞共培养技术，模拟了生理状态下软骨细胞承重的生物学特点。实验动物研究中，利用大鼠模型进行了关节损伤修复的初步探讨，结果显示尽管不同程度的损伤创面，在手术修复后的一年时间里，几乎所有的实验大鼠，其损伤都得到了满意的修复效果。

附图说明

图1为制备的plga多孔支架中聚乳酸(pla)和聚羟基乙酸(pga)的比例关系；

支架用聚乳酸-羟基乙酸(plga)作为基质材料，它是由有机高分子聚乳酸(pla)和聚羟基乙酸(pga)，按照一定梯度比例(100:0、85:15、75:25、50:50、25:75、15:85、0:100)的聚合反应产物。

图2表示支架材料分层组装示意图；

图3为骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养提高软骨细胞粘附率；

图4为对plga细胞支架采取负载加压，进行细胞3d培养。该图表示细胞支架材料在机械压力下的内部构造示意图；

图5为不同培养时间内plga支架上的细胞dna含量；

图6为甲苯胺蓝染色观察软骨细胞；

图7为阿利辛蓝染色观察软骨细胞；

图8为westernblotting技术显示细胞共培养过程中ⅱ型胶原蛋白表达水平；

注：ch-软骨细胞；svf-脂肪干细胞；bm-骨髓间充质干细胞；

图9为软骨修复复术改良icrs组织学评分；

图10为软骨修复术后ⅱ型胶原蛋白表达水平比较；

图11为软骨修复术后病理组织学观察。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：plga多孔支架的制备

1.制备plga多孔支架。关节软骨修复材料的支架部分用聚乳酸-羟基乙酸(plga)作为基质材料，它是由有机高分子聚乳酸(pla)和聚羟基乙酸(pga)，按照一定梯度比例(聚乳酸(pla)：聚羟基乙酸(pga)＝100:0、85:15、75:25、50:50、25:75、15:85、0:100)的聚合反应产物(图1)。

聚乳酸(pla)、聚羟基乙酸(pga)、聚乳酸-羟基乙酸(plga)单体化学结构式如下所示：

聚乳酸[poly(lacticacid)，pla]：

聚羟基乙酸[poly(glycolicacid),pga]：

聚乳酸-羟基乙酸[poly(lactic-co-glycolicacid)，plga]：

通过冷冻干燥技术制备plga多孔支架，步骤如下：

a)将不同比例(聚乳酸(pla)：聚羟基乙酸(pga)＝100:0、85:15、75:25、50:50、25:75、15:85、0:100)的pla/pga聚合产物—多聚乳酸-羟基乙酸(plga)，依次命名为plga1(pla：pga＝100:0)、plga2(pla：pga＝85:15)、plga3(pla：pga＝75:25)、plga4(pla：pga＝50:50)、plga5(pla：pga＝25:75)、plga6(pla：pga＝15:85)、plga7(pla：pga＝0:100)，将上述plga1-7分别称重，置于合适容器中，分别加入有机溶剂，例如二恶烷(dioxane，别名二氧六环)溶解plga，得到含有不同比例的pla/pga聚合产物(plga1-7)的有机溶液。plga1-7与有机溶剂的重量体积分数可根据孔隙率及密度要求调整，plga1-7聚合物重量百分比终浓度为1～30％。在温度45℃条件下，低速搅拌固体颗粒plga1-7约1.5～2小时，直至完全溶解。

b)将溶解的plga1倾倒于锡纸造型的模具中，可以依需要铸成不同形状、高度，置-18～-20℃约2～4小时。

c)在-20～-80℃，真空度10^-1mbar下，干燥17～36小时。

d)释放真空之前，将冷冻干燥容器内的plga1干燥物缓慢恢复至室温。

e)释放真空，将溶解的plga2倾倒于锡纸造型的模具中，使其位于plga1上方，置-18～-20℃约2～4小时；

f)重复上述步骤c)-d)，将冷冻干燥容器内的plga1/plga2干燥物缓慢恢复至室温；

g)重复上述步骤e)-f)，分别将溶解的plga3、plga4、plga5、plga6、plga7依次倾倒于模具中，制备得到含有7种不同聚合比例pla/pga产物(plga)的多层次plga多孔支架。plga多孔支架材料分层组装示意图如图2所示。

h)从锡纸模具上小心地取下plga多孔支架，存放于干燥器中备用。通过扫描电镜直接观察孔隙是否存在，以及孔隙形状、大小，进行孔隙计数，计算平均孔径，结果发现制得的plga支架，其内部贯穿范围在50～400μm相互连通的孔隙，益于粘附细胞，而且酯键易于水解具有较好的生物相容性。不同聚合比例plga的组合有效改善了plga支架的力学性能及其降解速率。

除了通过冷冻干燥技术制备plga多孔支架外，也可以通过氯化钠盐颗粒方法制备。在步骤b)plga1-7溶解后，加入不同大小的氯化钠盐颗粒，脱盐即可获得不同孔隙率的支架。经过比较后，冷冻干燥技术优于脱盐方法制备的plga多孔支架。

2.plga多孔支架碱化处理。

该操作在通风柜内完成，最好是带有负压管道装置的ii类生物安全柜内进行，以保护样品不受污染。

a)配制浓度为3.0～5.0％w/v氢氧化钠溶液。取适量体积上述氢氧化钠溶液浸泡plga多孔支架，氢氧化钠体积要确保整个支架被液体完全覆盖。

b)低速磁力搅拌约1小时。

c)弃掉溶液，用高纯水洗涤plga多孔支架，低速磁力搅拌1小时，该步骤重复两次。

d)真空干燥plga多孔支架。干燥时间不少于24小时，然后存放plga多孔支架在密封容器中，以避免阳光紫外线分解作用。

除了应用氢氧化钠碱化处理plga多孔支架外，也可以使用盐酸进行酸化处理，但是细胞生长实验研究表明碱化优于酸化。

3.多聚赖氨酸包被plga多孔支架

a)多聚赖氨酸储液制备：一般采用分子量30000的poly-l-lysine(l-多聚赖氨酸)完成包被过程，虽然多聚赖氨酸分子量越大，黏附力越强，但完全溶解相对较困难。poly-l-lysine用去离子水稀释，制备成浓度为15％w/v的储液。15％l-多聚赖氨酸溶液的配制：称量15gl-多聚赖氨酸，溶于100ml灭菌去离子水，0.22μm正压滤器过滤分装，-20℃保存。

b)将多聚赖氨酸储液稀释成工作浓度为0.2～5％w/v的l-多聚赖氨酸溶液用于包埋plga多孔支架，37℃恒温孵育4小时或常温过夜，4℃冰箱保存。

c)去除l-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗plga多孔支架，冷冻干燥备用。包被多聚赖氨酸的plga多孔支架能够提高细胞在支架上的附着率，促进细胞增殖。细胞接种时孵育超过10分钟可以增加细胞附着率。

4.plga多孔支架的蛋白包埋修饰。

a)制备蛋白包被液。配制浓度为4～10％w/v的明胶蛋白溶液，加入ⅱ型胶原蛋白使其终浓度为0.4～1.0％w/v，制备明胶蛋白—ⅱ型胶原蛋白包被液。

b)蛋白交联反应。应用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(edc)/n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)交联液，进行明胶蛋白、ⅱ型胶原蛋白、多聚赖氨酸、透明质酸、硫酸软骨素的交联反应，对plga多孔支架进一步包埋修饰。放置plga多孔支架于含30～70mm2-吗啉乙磺酸的30～50％w/v的乙醇溶液中(ph4.8～5.2)平衡20-40分钟，接着进行交联反应。交联反应使用含有edc、nhs、透明质酸、硫酸软骨素以及l-多聚赖氨酸的蛋白包被液进行，其中edc的质量百分比浓度为0.6％～11％，nhs的质量百分比浓度为0.15％～0.275％，透明质酸的质量百分比浓度为0.1％，硫酸软骨素的质量百分比浓度为5％，l-多聚赖氨酸浓度为2～10mm/l，反应时间为4～6小时。

c)用0.1m的na2hpo4溶液清洗plga支架0.5小时，重复一次。去离子水反复清洗3次，置-20℃1小时，-80℃1小时，真空冷冻干燥72小时后备用。

d)京尼平交联反应。plga支架浸泡在100ml的含有l-多聚赖氨酸以及京尼平的蛋白包被液中，其中，l-多聚赖氨酸浓度为2～10mm/l、京尼平浓度为5～15mm/l，室温下放置18～30小时。

e)再用pbs溶液冲洗步骤d)得到的plga多孔支架1小时，去离子水反复清洗3次,置-20℃1小时，-80℃1小时，真空冷冻干燥72小时后备用。

实施例2：成体细胞原代培养

1.软骨细胞。成体软骨细胞源于非承重部位的关节透明软骨。

a)软骨取材准备。需要准备的物品包括胰蛋白酶、ⅱ型胶原酶、dmem高糖培养基、pbs缓冲液、吸管、不同容量的培养皿或培养瓶、离心管、滤网、纱布、外科器材如镊子、剪刀等消毒后用品。

b)软骨取材。麻醉后，碘伏消毒，75％酒精脱碘，于非承重部位取关节透明软骨约50～100mg，放入已盛好pbs缓冲液的培养皿中。

c)用含抗生素的冷pbs缓冲液反复吹打清洗3次。第三次洗涤后静置5分钟，弃去上层液体及漂浮组织，将软骨组织移入干净无菌器皿中。

d)用消毒剪刀将软骨剪为1mm³碎块，吸走多余pbs缓冲液，转移软骨碎块至含有0.25％胰蛋白酶的2ml离心管中，在37℃的恒温摇床上，振荡孵育20～40分钟。

e)在离心管中加入2ml含血清培养基，转速1000rpm离心3分钟，弃掉上清液

f)加入3ml浓度为0.15～0.45％ⅱ型胶原酶，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化3～6小时，加入生长培养基终止消化。

g)用200目滤网将液体滤入另一离心管，转速1000～1500rpm离心4～8分钟，弃上清，加入2mlpbs缓冲液，转速1000～1500rpm离心4～8分钟，再重复清洗一次，用dmem培养基重新悬浮细胞。

h)对软骨细胞进行台盼蓝染色计数后，转移细胞至25cm²培养瓶，放入37℃培养箱。

i)细胞培养使用含dmem高糖培养基，添加10％fbs、青霉素100u/ml、链霉素100ug/ml、血小板促生长因子(制备方法见prp部分)。软骨细胞培养条件为37℃,5％co2。培养2天后换液，以后每隔2-3天换1次液，显微镜下观察细胞形态与生长情况。

2.脂肪干细胞。取材于皮下脂肪，分离制备的脂肪干细胞，有时也称为脂肪间充质干细胞或者脂肪多功能干细胞。步骤如下：

a)脂肪取材术前准备。碘伏、酒精、利多卡因注射液、生理盐水、注射器、抽脂器械包等等。

b)麻醉后，碘伏消毒，75％酒精脱碘，取皮下脂肪组织，放入盛好pbs缓冲液的无菌培养器皿中。

c)将脂肪组织用pbs缓冲液清洗三遍后，于15ml离心管中加入终浓度为2mg/ml的ⅱ型胶原酶，封闭管口，放入37℃水浴中消化3小时。

d)转速1300rpm离心10分钟，吸去上层漂浮物和上清液，取细胞沉淀，此为脂肪间充质多功能干细胞。

e)对细胞进行台盼蓝染色计数后，转移脂肪干细胞至无菌培养瓶。培养瓶中加入含10％fbs的dmem培养基，细胞培养条件为37℃,5％co2。显微镜下观察细胞形态与生长情况，隔1～3天换液

f)细胞传代。首先用pbs缓冲液洗涤3次。吸干瓶内液体后，加入1ml的胰蛋白酶-edta消化液，在37℃培养箱内消化3分钟，然后加入1ml含血清培养基终止消化。将细胞置于15ml离心管中，转速1300r离心10分钟，弃上清，再于离心管中加入1～3ml培养基，吹打混匀。台盼蓝染色后，显微镜下进行细胞计数。细胞密度为4～6×10⁵/ml进行培养，隔日换液。

3.骨髓间充质干细胞

a)术前准备。消毒孔巾、碘伏、酒精、肝素抗凝剂、生理盐水、利多卡因制剂、注射器、骨髓穿刺包等等。

b)麻醉后，暴露穿刺部位，碘伏消毒，75％酒精脱碘，用含有肝素(500～1200u/ml)的穿刺针抽取骨髓。

c)将骨髓缓慢推入培养皿中，以1:1的比例与pbs缓冲液混合，过200目滤网除掉结缔组织。

d)在离心管中，将5ml细胞悬液小心铺于体积为5ml的percoll(密度1.073kg/l)分离液表面,转速1800rpm/min离心20分钟，取中间黄褐色环状的云雾样细胞，pbs缓冲液冲洗两遍，转速1300r/min离心5分钟，用含10％fbs的dmem培养基将细胞吹散悬浮，转移至培养瓶中。

e)将沉淀细胞吹打散开后，对细胞进行台盼蓝染色计数。细胞悬液浓度为4～6×10⁵/ml，每个25cm²培养瓶定容体积约3～5ml。间隔24小时后观察细胞贴壁情况，然后倒掉培养基，在培养瓶内加入3～4ml的pbs缓冲液，轻度摇晃去除血细胞等不贴壁细胞。细胞传至第三代时，可得到形态良好的纯净骨髓间充质干细胞。

实施例3：富血小板血浆(prp)制备及其促生长因子释放

1.使用20ml无菌注射器和含有acd-a抗凝剂的真空采血管，于室温下(22℃)，抽取血液约18ml，将血液分别放入4个5ml离心管，每管4ml。富血小板血浆液制备要在4～6小时内完成。

2.富血小板血浆液制备。采用二次离心法制备有效浓度的富血小板血浆，该方法制备的血小板血浆中细胞因子pdgf、tgf-β1活性水平增加显著(p<0.01)。

a)每管4ml对称放置于离心机，以200～400g×10min第一次离心，取离心后白膜层以上及其下血浆3mm，置于另一离心管，

b)再以200～400g×10min进行第二次离心，移去上清为贫血小板血浆，剩余约400μl为prp血浆。

3.使用氯化钙或凝血酶激活血小板(prp)释放生长因子。prp制备后10～15min，用5～15％氯化钙(凝血酶>5000u)作为激活剂。激活剂与prp以1:1(v/v)的比例混合，室温静止l0min，使血小板激活释放生长因子。上述过程也可以把氯化钙与凝血酶结合使用。

4.酶联免疫分析法(elisa)测定激活前后prp中各种细胞因子例如pdgf、tgf-β1水平，elisa检测按照说明书进行。

实施例4：细胞共培养技术

1.软骨细胞与脂肪干细胞共培养。软骨细胞增殖缓慢，因此共培养时采取不同的细胞培养代数。一般情况下，软骨细胞培养至第一或第二代，骨髓间充质干细胞培养至第三或第四代后开始共培养。首先用pbs缓冲液洗涤细胞3次。吸干瓶内液体后，加入1ml的胰蛋白酶-edta消化液，在37℃培养箱内消化3～5分钟，然后加入1ml含血清培养基终止消化。将细胞置于15ml离心管中，转速1300r离心10分钟，弃上清，再于离心管中加入1～3ml的dmem培养基，吹打混匀。台盼蓝染色后，显微镜下进行细胞计数。按照软骨细胞与脂肪干细胞共培养2～4:8～6比例，取不同体积的细胞悬液于离心管中进行混合，细胞密度为4～6×10⁵/ml进行培养，培养过程中加入源于血小板(prp)促生长因子与5～15ng/ml转移生长诱导因子等。隔日换液。

2.软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养。软骨细胞培养至第一或第二代，骨髓间充质干细胞培养至第三或第四代后开始共培养。使用pbs缓冲液洗涤细胞3次。吸干瓶内液体后，加入1ml的胰蛋白酶-edta消化液，在37℃培养箱内消化3分钟，然后加入1ml含血清培养基终止消化。将细胞置于15ml离心管中，转速1300r离心10分钟，弃上清，再于离心管中加入1～3ml的dmem培养基，吹打混匀。台盼蓝染色后，显微镜下进行细胞计数。按照软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养2～4:8～6比例，取不同体积的细胞悬液于离心管中进行混合，细胞密度为4～6×10⁵/ml进行培养，培养过程中加入源于血小板(prp)促生长因子、5～7ug/ml胰岛素、5～7ug/ml转铁蛋白、5～15ng/ml转移生长诱导因子等。隔日换新培养基。

从图3结果可以看出，采用骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养，可以提高软骨细胞的粘附率。

3.细胞生长至70％覆盖率时，用胰蛋白酶-edta消化液处理细胞，转速1300r离心10分钟，弃上清，于离心管中加入1～3ml的dmem培养基，调整细胞浓度为5×10⁷/ml，用于接种plga多孔支架。

实施例5：plga多孔支架接种细胞—plga细胞支架的制备方法

1.plga多孔支架预处理

a)根据软骨损伤创面形状修整plga多孔支架，将plga多孔支架剪成适宜大小，用75％酒精浸泡消毒、干燥；

b)用dmem完全培养基润洗plga多孔支架；

2.plga多孔支架上的细胞接种

a)plga多孔支架按照pla/pga比例的不同分为外侧区、中间区、内侧区三个区域，即面向关节腔的为外侧区(第1～3层，对应于plga1-3)，然后是中间区(第4～5层，对应于plga4-5)，接触骨髓腔面的为内侧区(第6～7层，对应于plga6-7)。向plga多孔支架的外侧区孔隙注射接种软骨细胞，向中间区孔隙注射接种共培养的软骨细胞与脂肪干细胞，向内侧区孔隙注射plga支架接种共培养的软骨细胞与骨髓间充质干细胞。

b)根据plga多孔支架的体积调整接种细胞量。每立方毫米支架细胞植入量为0.8～2×l0⁵个。

c)将接种细胞的plga多孔支架置于含8～15％v/v血清的dmem培养基中，放入37℃、5％co2细胞培养箱对plga细胞支架施加负载进行加压技术3d培养(图4)。72小时后换第一次培养基，之后每隔48小时更换培养基1次。

在plga多孔支架上进行细胞3d培养时，通过增加培养基液面高度，施以静态压力，同时旋转培养容器使冲击压力达到1～2pa/cm²。给plga多孔支架施加一定的负载压力，不但增加了ⅱ型胶原表达水平，而且模拟了生理状态下软骨组织受力之实际情况(例如75公斤体重的个体在直立静止状态下，其每平方厘米关节软骨压力估计值1.5～3.0pa，漫步行走时关节软骨压力会增加10倍，跑步或上楼梯时增加更多)。

3、plga支架上细胞dna含量测定

对不同培养时间内plga多孔支架上的细胞dna含量进行测定，结果如图5所示。

4、软骨细胞的染色观察

a)甲苯胺蓝染色观察软骨细胞。甲苯胺蓝染色法的准备工作，包括配制20％乙醇即10ml无水乙醇加入到40ml去离子水中；配制体积分数1％甲苯胺蓝原液即0.5ml的甲苯胺蓝加到49.5ml的20％乙醇中；配制pbs缓冲液。实验过程首先移去培养基，用pbs缓冲液冲洗2～3次。取适量4％多聚甲醛覆盖所有细胞，固定30分钟后弃掉溶液，pbs缓冲液洗涤细胞2～3次。加入适量体积浓度为1％甲苯胺蓝以覆盖细胞，室温下染色10～30分钟，用无水乙醇洗至无色，显微镜下观察、拍照。结果如图6所示。

b)阿利辛蓝染色观察软骨细胞。阿利新蓝染色法实验过程，包括吸走培养基，用pbs缓冲液冲洗2～3次。取适量4％多聚甲醛覆盖细胞，固定30分钟后弃掉溶液，pbs洗涤2～3次。加入适量阿利新蓝酸化液(试剂盒中的a液)覆盖细胞约3分钟，再加入适量阿利新蓝染色液(试剂盒中的b液)覆盖细胞染色30分钟，流水冲洗。加入核固红染色液(试剂盒中的c液)复染约5分钟，流水冲洗1分钟，显微镜下观察、拍照。结果如图7所示。

5、ⅱ型胶原表达。

应用westernblotting技术ⅱ型胶原蛋白表达水平。在含有蛋白酶抑制剂的冷ripa缓冲液中裂解细胞，转速12000g离心20分钟提取总蛋白，用bca检测试剂盒测定总蛋白浓度。取20μg细胞裂解蛋白溶液通过8～10％sds—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移蛋白至immobilon-p膜(bio-rad)。在室温下，蛋白转移膜与tbst盐水缓冲液(含有5％牛血清白蛋白和0.1％tween-20)杂交1小时后，洗膜三次。加ⅱ型胶原蛋白抗体于4℃过夜，用tbst洗涤杂交膜4次后，室温下与horseradishperoxidase(hrp)结合的第二抗体(1:3000稀释)孵育1小时。使用强化发光试剂盒(ecl)检测ⅱ型胶原蛋白/抗体结合的信号强度。结果如图8所示。

实施例6：软骨缺损修复的实验动物研究

为了探索本发明制备的关节软骨修复材料，在关节软骨损伤治疗中的效果，设计了如下软骨缺损修复的动物实验。实验动物为大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(beijingvitalriverlaboratoryanimaltechnologyco.,ltd.)。首先对动物称重，在全麻状态下抽取骨髓，通过percoll密度梯度离心法获取骨髓间充质干细胞。在腹部获取脂肪组织，通过酶消化与离心技术，制备脂肪多功能干细胞(svf)。通过手术方式于膝关节股骨外侧髁处取关节软骨组织，同时制备直径2～3mm的全厚软骨缺损模型。一部分软骨缺损动物经历修复手术归为修复治疗组；另外未经修复治疗的软骨缺损大鼠作为损伤对照组。修复术后12个月实验终止，通过大体观察、修复组织ⅱ型胶原蛋白表达水平分析及病理切片观测，检验修复结果。此项大鼠实验研究，通过探索软骨缺损修复材料的治疗效果，验证该修复策略的可行性，为后期的临床运用奠定基础。

1.实验方法如下：

按照随机法将大鼠分为损伤对照、修复治疗两组，其中损伤对照组6膝，修复治疗组10膝。损伤对照组动物仅造成单纯软骨缺损；而实验组则实施软骨损伤修复术。于术后8个月，分别从实验组与对照组各取一只动物进行观察、检测及评价；12个月后获取剩余动物标本，评估实验结果。

a)骨髓间充质干细胞获取：大鼠称重、麻醉后，剃毛，置于手术台上，取仰卧位，对穿刺区碘伏消毒，酒精脱碘，铺孔巾。使用骨髓穿刺针旋转刺入，直到有落空感后再取出针芯，使用肝素(500～1000u/ml)或者10％枸橼酸钠预湿的注射器抽取骨髓血，调整穿刺针的位置及深度抽吸适量的髓血，进行骨髓间充质干细胞分离。将抗凝骨髓液注入离心管中，再加入等体积的无菌pbs缓冲液，过200目滤网除掉结缔组织。将滤过后的骨髓-pbs液，缓慢注入到含等体积的percoll(1.073kg/l)分离液中。注入过程沿离心管壁缓慢进行，保持分离液与骨髓混合液体之间界面的完整，防止因速度过快使骨髓液与分离液混合，影响分离效果。转速1600～2200rpm/min离心18～25分钟，可见液体分层，自上至下分别为血浆、云雾状骨髓间充质干细胞、分离液及红细胞层。取中间黄褐色环状的云雾样细胞，pbs缓冲液冲洗两遍，转速1200～1600rpm/min离心3～8分钟，用培养基将细胞吹散悬浮，转移至培养瓶中。将沉淀细胞吹打散开后，对细胞进行台盼蓝染色计数。细胞悬液浓度为4～6×10⁵/ml，每个25cm²培养瓶定容体积约3～5ml。间隔24小时后观察细胞贴壁情况，然后倒掉培养基，在培养瓶内加入3～4ml的pbs缓冲液，轻度摇晃去除血细胞等不贴壁细胞。细胞传至第三代时，可得到形态良好的纯净骨髓间充质干细胞。

b)脂肪干细胞获取：于腹部取材脂肪组织后，放入盛好pbs缓冲液的无菌培养器皿中。用pbs缓冲液将脂肪组织清洗三遍后，于15ml离心管中加入终浓度为2mg/ml的ⅱ型胶原酶，封闭管口，放入37℃水浴中消化3小时。转速1300rpm离心10分钟，吸去上层漂浮物和上清液，取细胞沉淀。用培养液散开沉淀细胞，对细胞进行台盼蓝染色计数，转移脂肪干细胞至无菌培养瓶。培养瓶中加入含10％fbs的dmem培养基，细胞培养条件为37℃,5％co2。显微镜下观察细胞形态与生长情况，隔1～3天换液。细胞传代前，先用pbs缓冲液洗涤3次，吸干瓶内液体后，加入1ml的胰蛋白酶-edta消化液，在37℃培养箱内消化3分钟，然后加入1ml含血清培养基终止消化。将细胞置于15ml离心管中，转速1300rpm/min离心10分钟，弃上清，再于离心管中加入1～3ml培养基，吹打混匀。台盼蓝染色后，显微镜下进行细胞计数。细胞密度为4～6×10⁵/ml进行培养，隔日换液。

c)软骨细胞获取及软骨损伤模型制备步骤：取膝关节外侧髌旁入路，纵行切开皮肤长约0.6～1.0cm，逐层切开皮下组织，将髌骨推向内侧使其脱位，显露股骨外侧髁关节软骨，用套筒取材软骨组织，同时制备直径2～3.0mm的全厚软骨缺损模型。软骨缺损深度与关节软骨层厚度一致，确保无髓血渗出，修整缺损底部及边缘。复位髌骨后，生理盐水冲洗创面及关节腔，逐层缝合皮下及皮肤，创面敷红霉素软膏。术后即刻施用止痛剂及青霉素钾肌注预防感染。术后膝关节不固定，每日术区敷红霉素软膏，肌注抗生素1次，连续3天。常规饮食饲养，每日观察动物基本情况、伤口愈合情况及行走步态等。软骨取材后，放入已盛好pbs缓冲液的培养皿中。用含抗生素的冷pbs缓冲液反复吹打清洗3次。第三次洗涤后静置5分钟，弃去上层液体及漂浮组织，将软骨组织移入干净无菌器皿中。用消毒剪刀将软骨剪为1mm³碎块，吸走多余pbs缓冲液，转移软骨碎块至含有0.25％胰蛋白酶的2ml离心管中，在37℃的恒温摇床上，振荡孵育20～40分钟。在离心管中加入2ml含血清培养基，转速1000rpm离心3分钟，弃掉上清液，加入3ml浓度为0.15～0.45％ⅱ型胶原酶，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化3～6小时，加入生长培养基终止消化。用200目滤网将液体滤入另一离心管，转速1000～1500rpm离心4～8分钟，弃上清，加入2mlpbs缓冲液，转速1000～1500rpm离心4～8分钟，再重复清洗一次，用dmem培养基重新悬浮细胞。对软骨细胞进行台盼蓝染色计数后，转移细胞至25cm²培养瓶，放入37℃培养箱。细胞培养使用含dmem高糖培养基，添加10％fbs、青霉素100u/ml、链霉素100ug/ml、血小板促生长因子(制备方法见实施例3)。软骨细胞培养条件为37℃,5％co2。培养2天后换液，以后每隔2-3天换1次液，显微镜下观察细胞形态与生长情况。此后，软骨细胞共培养与支架接种请分别参照实施例1、实施例3-5。

d)软骨损伤修复术：plga细胞支架制备后，需要手术修复损伤软骨。按照常规程序进行麻醉、消毒、皮肤切开、暴露创面等系列操作。利用眼科剪与手术刀进行关节软骨损伤创面清理与修整，用生理盐水冲洗造模区清除组织碎削。用针头刺破造模创面的钙化软骨层，直至骨髓血渗出，将适宜形状的plga细胞支架置于损伤处，用生物胶固定。复位髌骨后，用可吸收线逐层缝合皮下及皮肤组织，创面敷红霉素软膏。术后即刻施用止痛剂及青霉素钾肌注预防感染。术后膝关节不固定，每日术区敷红霉素软膏，肌注抗生素1次，连续3天。常规饮食饲养，每日观察动物基本情况及行走步态，特别是观察伤口是否干燥，有无异常渗液等伤口愈合情况。本研究于术后8个月，分别从实验组与对照组各取一只动物进行疗效评估，术后12个月终止观察，获取各组动物标本进行实验结果的检测及评价。修复手术过程中，一只大鼠由于初始麻醉剂量不足，二次补注麻醉剂后导致死亡。其它动物术后7～10天左右切口愈合良好，没有出现术后感染及关节脱位等并发症。共13只大鼠完成了全部的手术及术后观察评估，

2.软骨损伤修复实验结果评估

a)动物的一般状况。观察术后大鼠关节切口对和是否良好，皮肤是否干燥，有无异常渗出等等。术后2天观察到关节及其周围软组织肿胀，触痛明显，膝关节活动减少，力量较弱。手术7～10天后各组切口愈合良好，周围软组织肿胀已消退，缝线已自行脱落或拆除，未发现感染，膝关节活动正常。

b)大体标本观察

损伤对照组：表面光泽度差，颜色呈暗灰色。虽然损伤周边有软骨修复迹象，表面仍有较大面积的缺损，触摸软骨面不平整、不光滑，可见损伤周围组织增生。

修复治疗组:关节面缺损部分已经被新生组织取代，光泽度正常，颜色与正常软骨无明显差异。触摸关节表面光滑平整，未见周围软组织充血或增生现象。

c)采用改良icrs组织学评分，对软骨缺损修复效果进行评价分析。该评分系统综合多项指标，涵盖了大体标本观察如修复组织颜色、新生组织与邻近软骨整合、缺损修复程度，以及修复组织力学强度等方面进行估值分析，结果如图9所示。损伤对照组及修复治疗组在术后12个月改良icrs组织学评分分别为：损伤对照组12.7±1.57(n＝5)；修复治疗组18.8±1.02(n＝8,p<0.01)。结果表明plga细胞支架修复软骨损伤效果显著优于损伤对照组。

d)ⅱ型胶原蛋白表达水平分析。软骨缺损后，即使不使用修补材料，也会刺激组织增生填补缺损部位，但是上述增生是否是真正意义上的软骨自身修复，可以用ⅱ型胶原蛋白在组织中的表达水平予以验证。软骨缺损进行plga细胞支架修复治疗一年后，检测修复组织中的ⅱ型胶原蛋白表达水平，并使用正常关节软骨ⅱ型胶原蛋白量作为参照，进行比值比较，计算相对含量(图10)。

e)病理切片观测

取材及制作标本：观察大体标本情况后，收集关节组织，进行病理学检查。将标本置于10％的中性福尔马林液中固定，遂放置于酸性脱钙液中浸泡4～5天进行脱钙，完成脱钙处理后，烘干、脱水，截取标本观察部位进行石蜡包埋，组织切片，苏木精伊红(he)染色。

光镜观察结果如图11所示：

损伤对照组:表层分离、组织缺失、有较多失染。缺损区域由大量无细胞的红染成分填充，粗糙不平，可以见到少量形态各异的细胞分布其间，软骨下骨质及骨小梁断裂，潮线消失或者模糊不清难分辨，属关节炎的中晚期表现。

修复治疗组:镜下观察苏木精伊红染色均匀，未见失染现象。表层较为平整，软骨细胞梭形排列，表层厚度基本正常，中间层有散在分布的圆形细胞组成，偶见细胞聚集排布不均匀，柱状层与钙化层分化良好，未见骨质破坏及骨小梁断裂，潮线分布清晰，无炎细胞浸润或炎性增生现象。

上述结果表明，plga细胞支架对大鼠软骨缺损具有良好的修复效果。软骨缺损区域被新生软骨样修复组织填充，新生修复组织表面平整，与邻近正常软骨整合良好。plga细胞支架中接种细胞分裂，具有自我更新能力，细胞形态与正常软骨细胞相似，多功能间充质干细胞成软骨分化。修复组织内ⅱ型胶原含量明显高于损伤对照组，其icrs组织学评分也明显优于损伤对照组，具备临床转化潜能。