微小型昆虫幼虫唾液的采集装置及方法与流程

本发明涉及农业植保领域，具体地说是一种微小型昆虫幼虫唾液的采集装置及方法。

背景技术：

昆虫为了有效获得营养、对付食物中的有毒成分、以及开拓新的食物资源，其口器伴随着外部内部形态的适应特征，其生理生化功能也做了相应的调整。昆虫唾液成分相当复杂,其中含有许多重要的生理功能因子。昆虫唾液具有许多功能和特性，如消化，口腔维持，水平衡，病原体传播，作为信息素的载体，提供反捕食者防御，具有抗微生物活性，并且可以帮助规避动物宿主防御和植物宿主防御。所以研究昆虫唾液对于害虫防治等方面具有重要意义，现在对于昆虫幼虫唾液一般采用解剖唾液腺或用毛果芸香碱诱导刺激，但对于一些幼虫而言其操作难度及效果不佳。

因此，需要对现有技术进行改进。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种高效的微小型昆虫幼虫唾液的采集装置及方法。

本发明提供一种微小型昆虫幼虫唾液的采集装置：包括电板；

所述电板上设置有正极和负极，电板上设置有与正极连接的正极竖板以及与负极连接的负极竖板；

所述正极竖板在朝向负极竖板一侧等距设置有至少三个正极横板，负极竖板在朝向正极竖板一侧等距设置有至少三个负极横板；

所述正极横板伸入到相邻两个负极横板之间；所述负极横板伸入到相邻两个正极横板之间。

作为对本发明微小型昆虫幼虫唾液的采集装置的改进：

所述正极横板伸入到相邻两个负极横板正中间；所述负极横板伸入到相邻两个正极横板正中间。

作为对本发明微小型昆虫幼虫唾液的采集装置的进一步改进：

所述正极竖板和负极竖板相互平行。

作为对本发明微小型昆虫幼虫唾液的采集装置的进一步改进：

所述正极横板与正极竖板相互垂直，负极横板与负极竖板相互垂直。

作为对本发明微小型昆虫幼虫唾液的采集装置的进一步改进：

相邻正极横板之间的间距与相邻负极横板的间距相等；所述正极横板与负极横板的数量相同。

本发明还提供一种昆虫幼虫唾液的采集方法，包括以下步骤：

步骤1)、将昆虫幼虫放置在相邻两个正极横板和负极横板上，

步骤2)、以频率为50赫兹和电流为2毫安的连续波工作模式对正极横板和负极横板供电，直至昆虫幼虫产生肉眼可见的卷缩的反应为止；

步骤3)、然后将电流保持在50赫兹和2毫安半分钟，昆虫幼虫的口器产生唾液小液珠；

步骤4)、先用移液器吸取0.4ul的含有蛋白酶抑制剂的pbs溶液，然后再吸取唾液小液珠。

作为对本发明昆虫幼虫唾液的采集方法的改进：

昆虫幼虫为口器一端向上放置。

本发明微小型昆虫幼虫唾液的采集装置及方法的技术优势为：

本发明可以简单便捷使用电流刺激实现单个或者多个昆虫幼虫的唾液采集，本发明可以用于采集一些个体较小且对毛果芸香碱无明显反应的昆虫幼虫，可以弥补现有技术的缺陷。本发明实现结构上的改进。如果将结构改成如同本发明所述的电路电板，能带来高通量及快速取样的技术优势。反之，如果不改进，如同现有的常规技术那样，那么会导致取样速度较慢效率低的不利后果。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明微小型昆虫幼虫唾液的采集装置的结构示意图；

图2为图1实际应用时放置有昆虫幼虫4的结构示意图；

图3为图2中昆虫幼虫4放置在相邻正极横板22和负极横板32之间的放大结构示意图；

图4为对比例1中分别在1ma、2.5ma、4ma条件下，收集同等数量的小液珠的示意图；

图5为对比例2中分别在5s、15s和25s条件下，收集同等数量的小液珠的示意图；

图6为对比例3中在2.5ma条件下，在未含有pic的磷酸盐缓冲液中，收集同等数量的小液珠的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、微小型昆虫幼虫唾液的采集装置，用于昆虫幼虫4，如图1-3所示，包括一个可稳定提供电流电压的装置(本发明中采用的是华佗牌的sdz-ii型电子针疗仪)，一块由穿插电路组成的可提供稳定电流和电压的电板1，电板1为pcb单面线路板。该电板采用fr4材质制作，1.6mm厚，其电路采用半工艺裸铜设计，其线路宽度为0.25mm。

电板1的一端设置有正极2和负极3，电板1上设置有与正极2连接的正极竖板21以及与负极3连接的负极竖板31，正极竖板21和负极竖板31相互平行，正极竖板21在朝向负极竖板31一侧等距设置有若干个正极横板22，负极竖板31在朝向正极竖板21一侧等距设置有若干个负极横板32。正极横板22与正极竖板21相互垂直，负极横板32与负极竖板31相互垂直。

相邻正极横板22之间的间距与相邻负极横板32的间距相等，且正极横板22与负极横板32的数量相同。正极横板22(除其中一个边缘的正极横板22外)伸入到相邻两个负极横板32正中间，负极横板32(除其中一个边缘的负极横板32外)伸入到相邻两个正极横板22正中间。在电板1上，正极横板22和负极横板32交替设置，相邻正极横板22和负极横板32之间的间距可根据需要检测的昆虫幼虫4大小调节，相邻正极横板22和负极横板32之间的间距相等。在本实施例中间距为0.3mm，可用于蝶蛹金小蜂和丽蝇蛹集金小蜂幼虫的唾液收集。使用时昆虫幼虫4两端放置在相邻正极横板22和负极横板32上，使得昆虫幼虫4两端分别与正极横板22和负极横板32接触。

本发明的使用过程为：

将昆虫幼虫4两端放置在邻正极横板22和负极横板32上，正极2和负极3与sdz-ii型电子针疗仪连接，电流依次从正极2通过正极竖板21、正极横板22、昆虫幼虫4、负极横板32和负极竖板31后进入负极3，电流刺激到昆虫幼虫4，昆虫幼虫4会在电击后吐出唾液，在口器周围形成唾液小液珠，此时使用枪头靠近唾液小液珠收集，将昆虫幼虫4的唾液储存于含有蛋白酶抑制剂(proteinsafephosphataseinhibitorcocktail(100×)，transgenbiotech,china)的磷酸盐缓冲液(ph7.0)中，-80℃保存。

在使用过程中，例如我们实验室收集蝶蛹金小蜂和丽蝇蛹集金小蜂幼虫唾液时，具体包括以下步骤：

步骤1、将电子针疗仪调至频率为50赫兹和电流为2.5毫安的连续波工作模式，直至昆虫幼虫4产生肉眼可见昆虫幼虫卷缩的反应，

步骤2、然后将电流保持在50赫兹和2.5毫安大约15s，在看到幼虫口器周围出现透明的小液滴时，然后用枪头收集获得唾液小液珠。

步骤3、在收集唾液小液珠时，我们一般先用移液器吸取0.4μl左右的含有1x蛋白酶抑制剂(proteinsafephosphataseinhibitorcocktail(100×)，transgenbiotech,china)的磷酸盐缓冲液(ph7.0)溶液，然后再吸取唾液小液珠。

此方法可以避免少量的唾液小液珠不易被枪头吸取，也可避免唾液小液珠因为量小而挥发。昆虫幼虫4在放置时需要注意将口器一端向上放置，避免吐出的唾液小液滴沾到下面的电板。

以丽蝇蛹集金小蜂幼虫唾液收集为例。

对比例1：将实施例1的步骤1和步骤2中“电流2.5毫安”其中的电流改成“1毫安或者4毫安”，其余等同于实施例1。

thedataareexpressedasmean±standarderror(n＝5).one-wayanovaandtukey’stest(p<0.05).

图4：分别在1ma、2.5ma、4ma条件下，收集同等数量的小液珠,唾液样品经4-20％sds-page后，染色拍照，得到图4。我们可知，在不同条件下所取的唾液蛋白种类是一致的，但蛋白含量而言1ma条件下所取的蛋白含量较低。

对比例2：将实施例1的步骤2中“保持电流15s”改成“5s或者25s”，其余等同于实施例1。

thedataareexpressedasmean±standarderror(n＝5).one-wayanovaandtukey’stest(p<0.05).

图5：分别在5s、15s和25s条件下，收集同等数量的小液珠,唾液样品经4-20％sds-page后，染色拍照，得到图5。我们可知，在不同条件下所取的唾液蛋白种类是一致的，但蛋白含量而言5s条件下所取的蛋白含量较低。

对比例3：取消步骤3中的蛋白酶抑制剂，其余等同于实施例1。

如取消步骤3中的蛋白酶抑制剂，我们所取的唾液中的蛋白可能会被唾液中或外界的蛋白酶分解，影响后期实验。

图6：在2.5ma条件下，收集同等数量的小液珠，分别存放在在含有蛋白酶抑制剂(简写为“pic”)和未含有pic的磷酸盐缓冲液,唾液样品经4-20％sds-page后，染色拍照，得到以下图片。由图6可知，在未含有pic的磷酸盐缓冲液中，唾液样品会因为蛋白酶而降解，影响后期的实验结果。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。