表没食子儿茶素没食子酸酯联合酪氨酸激酶抑制剂在制备癌症治疗药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体的说，涉及一种抗癌组合物及其应用。

背景技术：

酪氨酸激酶类受体（TKR）表皮生长因子受体(EGFR)广泛表达在除悬浮细胞外的各类细胞膜上，EGFR蛋白的过度激活与肿瘤的发生、发展、恶性程度及预后有着非常密切的关系，可以引起肿瘤细胞增殖，促进肿瘤组织血管生成和肿瘤细胞的转移，EGFR是靶向治疗人类肿瘤的主要靶点之一。酪氨酸激酶抑制剂（TKI）是靶向治疗药物开发的主要领域。针对野生型EGFR肿瘤开发的吉非替尼（Gefitinib）是第一代TKI型EGFR抑制剂，但上市后在临床上发现Gefiitnib对EGFR高度活化的病人没有显著效果。研究发现， Gefitinb对发生L858R突变的EGFR亲和力是野生型EGFR的5-6倍，其对携带该突变的病人有效率高达80%以上，成为这些肿瘤患者的特效药。携带EGFRL858R的病人仅占全部肿瘤患者的6%，而总数60%以上的EGFR野生型病人临床上尚无有效的TKI类抑制剂可以应用。因此，针对野生型EGFR开发新的治疗策略具有重要意义。

技术实现要素：

为了克服背景技术中存在的问题，即到目前为止，针对野生型EGFR的肿瘤患者，目前没有有效的抑制剂。本发明提供了一种将表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）及以EGCG为先导化合物部分或全部设计合成的化合物与一种或多种酪氨酸激酶抑制剂联合用药的治疗方法，通过二者联用，提高野生型EGFR对原有的酪氨酸激酶抑制剂的敏感性，拓宽了原有抑制剂的适用范围，为EGFR野生型的癌症患者提供了一个有效的治疗策略。

本发明是通过如下技术方案实现：

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）联合酪氨酸激酶抑制剂在制备癌症治疗药物中的应用。所述表没食子儿茶素没食子酸酯：包括EGCG及以EGCG为先导化合物部分或全部设计合成的化合物，所述酪氨酸激酶抑制剂包括一种或多种酪氨酸激酶抑制剂的组合。

作为优选，所述癌症为表达野生型EGFR的肿瘤。

具体优选，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）联合吉非替尼（Gefitinib）表在制备EGFR野生型肿瘤治疗药物中的应用。

一种治疗癌症的药物组合物，包括有效量的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和一种或多种酪氨酸激酶抑制剂的组合，或包括以EGCG为先导化合物部分或全部设计合成的化合物和一种或多种酪氨酸激酶抑制剂的组合。

作为优选，所述的药物组合物在制备、治疗EGFR野生型肺癌药物方面的应用。

具体优选，治疗癌症的药物组合物包括表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和吉非替尼（Gefitinib）。当制备针对EGFR野生型肿瘤的药物时，化合物用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病类型和严重程度等进行调整，gefitinib的剂量为0.1-5mg/kg体重，EGCG的剂量为0.1 -8mg/kg体重。

本发明的有益效果：

本发明公开了EGCG及以EGCG为先导化合物部分或全部设计合成的化合物与酪氨酸激酶抑制剂联合，特别是EGCG与Gefitinib联合制备药物组合物，可用于EGFR野生型肿瘤患者的治疗，体外可看到显著抑制肿瘤细胞的生长，体内可抑制EGFR野生型肿瘤细胞异种移植的肿瘤体积的增大，二者联合减少了较大剂量下抗癌药物所致的治疗风险和毒副作用。

本发明不但为EGFR野生型肿瘤病人提供了有效的治疗策略，而且扩大了原有酪氨酸激酶抑制剂的适用范围。

附图说明

图1是EGCG与Gefitinib联合使用对EGFR野生型和突变型细胞增殖的影响；

图2是EGCG与Gefitinib联合使用对EGFR野生型和突变型细胞中EGFR信号通路中相关蛋白的影响；

图3是EGCG与Gefitinib联合使用对A431荷瘤小鼠体重的影响；

图4是EGCG与Gefitinib联合使用对A431移植瘤裸鼠肿瘤生长影响的直观图；

图5是EGCG与Gefitinib联合使用对A431移植瘤裸鼠肿瘤体积的影响（移植瘤生长曲线）；

图6是 EGCG与Gefitinib联合使用对A431移植瘤裸鼠肿瘤重量的影响；

图7是EGCG与Gefitinib联合使用对NCI-H1975荷瘤小鼠体重的影响；

图8是EGCG与Gefitinib联合使用对NCI-H1975移植瘤裸鼠肿瘤生长影响的直观图；

图9是EGCG与Gefitinib联合使用对NCI-H1975移植瘤裸鼠肿瘤体积的影响（移植瘤生长曲线）；

图10是EGCG与Gefitinib联合使用对NCI-H1975移植瘤裸鼠肿瘤重量的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

本发明选取EGFR野生型并且高表达的细胞系和EGFR双突变的细胞系作为研究对象，主要针对EGFR的一代抑制剂gefitinib和EGCG 联合使用对EGFR野生型的肿瘤细胞增殖的抑制作用以及对异种抑制的裸鼠肿瘤生长的抑制作用，并且阐明了该效果的作用机制。

实施例1 EGCG与Gefitinib联用对EGFR野生型和突变型细胞体外增殖效应的影响

1.实验材料

细胞株：人表皮鳞状细胞癌A431，人肺癌细胞株NCI-H1666，NCI-H1975。

2.检测原理：MTT法检测细胞活性

MTT 检测细胞的活力实验： MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，配制完成后分装放入放4℃避光保存。容器最好用铝箔纸包住。

试验步骤：A:我们采用贴壁细胞操作方法，首先收集对数期细胞调整细胞悬液浓度，使待测细胞调密度至3×10⁴/孔，每孔加入200μl，（边缘孔用无菌PBS填充）。同时设置调零孔（二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质(酸性培养基)、MTT、二甲基亚砜）在5%CO2、37℃的温箱中培养。

B:细胞贴壁后，可以看到细胞单层铺满孔底（96孔平底板），先用PBS清洗细胞，弃PBS，即可以开始加药，按照每孔200μl，设置4-6个复孔，否则难以反应真实情况。处理完成后，同样边缘孔用酸性培养基填充。防止样品挥发。

C:5%CO2，37℃孵育24小时，倒置显微镜下观察细胞状态。

D:每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS洗一遍后，再加入含MTT的培养液。

E：终止培养，小心吸去孔内培养液。

F：每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。630nm为参考处检测吸光度值(OD值)。

G:细胞活力计算公式为:活力=实验组OD平均值-空白组OD平均值/1)X100%，得出的数据，在excel里面求出柱形图。

3.实验结果

结果如图1所示，Gefitinib单独处理组对A431细胞的存活率没有影响，对NCI-H1666细胞有显著的抑制效果，但是与我们预期结果一致的是Gefitinib分别联合EGF和EGCG处理组对两个野生型EGFR的细胞株生长没有出现显著的抑制效应。但是当Gefitinib在同时存在EGCG、EGF能够显著抑制EGFR野生型细胞细胞的生长，而对双突变的NCI-H1975细胞没有效果。初步说明这种联合处理细胞的方式对细胞生长有选择性的抑制效应，对野生型EGFR的细胞A431和NCI-H1666表现出非常明显的抑制效应，而对双突变的NCI-H1975细胞没有效应。

实施例2 在EGCG、EGF同时存在时，Gefitinib对野生型和突变型细胞中EGFR信号通路相关蛋白磷酸化的影响

1.实验材料

细胞株：人表皮鳞状细胞癌A431，人肺癌细胞株NCI-H1975。

2.检测原理：Western Blot 检测细胞中相关蛋白的变化情况

3.实验方法：a：处理细胞，细胞完成贴壁后，进行饥饿处理，过夜处理后进行EGCG、EGF的处理。按照具体的实验分组进行实验，空白对照组直接加入酸性培养基，其余实验组加入10mL酸性培养基，使得EGCG终浓度为20μg/mL，EGF母液稀释成20ng/mL加入到酸性培养基中加药完成后置于细胞培养箱中，根据实验组设置相应的处理时间。

b：提蛋白

c：蛋白定量：蛋白质测定原理采用BCA蛋白定量法

d：SDS-PAGE 原理根据不同的蛋白质所带的电荷量不同，通过电场强度将不同分子量的蛋白质分开。然后将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，通过非共价键的形式吸附蛋白质，并不会破坏蛋白质多肽的生物学活性。然后将转移到膜上的蛋白作为抗原，将对应的抗体与抗原结合过夜或者室温两小时即可，然后在与HRP标记的第二抗体室温结合1小时，经过底物显色可检测到目的蛋白的表达。

4.实验结果

结果如图2所示：在野生型EGFRA431细胞中，同时存在EGCG和EGF的情况下，Gefitinib能够显著抑制EGFR家族及其下游蛋白ERK的磷酸化。但是在双突变的EGFR NCI-H1975细胞中没有看到这种结果。与细胞存活率实验表现出一致的实验结果。

实施例3 EGCG 与Gefitinib联合使用对EGFR野生型AA431细胞癌异种移植瘤模型中肿瘤的抑制作用

1. 实验材料

A431细胞及培养：人的表皮鳞状细胞癌A431培养于含10%FBS的DMEM高糖的完全培养基中，将细胞稀释到每mL培养液2ⅹ106个细胞。接种到培养皿中。置于细胞培养箱中培养。取对数生长期的细胞，用0.5%胰酶溶液消化制备成单细胞悬浮液，15000rpm离心3min，弃上清，用PBS调整细胞密度为5ⅹ10⁶ /mL。

裸鼠及其饲养：雄性BALB/C nu/nu 清洁级小鼠，6-8周，由江苏省常州卡文斯实验动物有限公司提供。裸鼠饲养于无菌通风的密闭动物房内，温度为25℃，白天定时光照，夜晚是黑暗环境，食物以及饮水自由。裸鼠的笼子和水，经过高温、高压灭菌。定时给裸鼠换干净的笼子和垫料以及饮水等，保持裸鼠生长环境清洁。

2. 实验方法

a:裸鼠移植肿瘤模型的建立 细胞复苏并传代，调整细胞状态在一周以后，细胞的生长环境趋于稳定。细胞经过消化、计数后，调整活细胞数密度为每200µL悬液含有5ⅹ10⁶个细胞备用。然后1500g离心3min。吸走培养基后，用生理盐水轻轻吹匀，制成细胞悬液备用。在无菌超净台内，将裸鼠按照体重的平均值一致的原则分组并剪耳朵标记，在每只裸鼠的背部皮下注射200µL细胞悬液（约5ⅹ10⁶个细胞）。每隔一天，用游标卡尺测量肿瘤的长径（Dmax）和短径（Dmin），计算肿瘤的体积V(V= Dmax ⅹ Dmin2/2)。

b：动物分组及给药 根据上述分分组的裸鼠进行给药（1）空白对照组：每周六天每天腹腔注射生理盐水，灌胃含有1%-Tween 80的生理盐水；（2）吉非替尼组：按照50mg/kg的剂量灌胃（一周两次）；（3）EGCG组：按照每周六天每天一次（腹腔注射）剂量分别是20mg/kg或者是40mg/kg；（4）联合给药组按照每周六天（每天一次）剂量分别是20mg/kg或者40mg/kg通过腹腔注射的给药方式， Gefitinib每周2次的50mg/kg的给药剂量进行实验。给药前测定肿瘤体积，每周三次。并且称量裸鼠体重，每周一次的频率进行，并做好实验记录。在给药完成后处死裸鼠，取出肿瘤块并拍照。按照后续的实验安排保存实体瘤。

3.实验结果

如图3所示，发现与正常对照组动物相比，各组之间没有出现明显的体重降低现象。但是 EGCG单独处理组在给药3周以后能够促进裸鼠体重的增加，和对照组相比出现了显著性。说明各组药物对动物没有明显的毒副作用。给药完成后，取出裸鼠的肿瘤。如图4所示，显示联合使用对肿瘤生长的影响。通过每隔一天对裸鼠移植瘤肿瘤的测量，绘制成的肿瘤生长曲线。如图5所示，Gefitinib联用组和单独Gefitinib处理组相比，从第29次测量肿瘤体积开始，极显著抑制肿瘤体积生长；和以往实验结果一致的是，Gefitinib在体外的选择性较体内实验有非常好的选择性。本实验同样得出Gefitinib对裸鼠肿瘤的生长有较好的抑制现象，当和EGCG联用后，能表现出非常明显的抑制效果，基本上是完全抑制了肿瘤细胞的生长。对取出肿瘤进行称量，结果如图6所示，单独Gefitinib处理组和空白对照组相比，肿瘤抑制率为52%，Gefitinib联合使用组和单独Gefitinib处理组相比，实体瘤的抑制率分别为69%、81%。在统计学上没有差异，但是联合使用组相较于单独使用，在一定程度上抑制肿瘤的生长。整个实验过程中无动物死亡。

实施例4 EGCG 与Gefitinib联合使用对EGFR双突变NCI-H1975细胞癌异种移植瘤模型中肿瘤的抑制作用

1. 实验材料

NCI-H1975细胞及培养：人的非小细胞肺癌NCI-H1975培养于含10%FBS的DMEM1640的完全培养基中，将细胞稀释到2ⅹ10⁶/mL。接种到培养皿中。置于细胞培养箱中培养。取对数生长期的细胞，用0.5%胰酶溶液消化制备成单细胞悬浮液，15000rpm离心3min，弃上清，用PBS调整细胞密度为5ⅹ10⁶ /mL。

裸鼠及其饲养：雄性BALB/C nu/nu 清洁级小鼠，6-8周，由江苏省常州卡文斯实验动物有限公司提供。裸鼠饲养于无菌通风的密闭动物房内，温度为25℃，白天定时光照，夜晚是黑暗环境，食物以及饮水自由。裸鼠的笼子和水，经过高温、高压灭菌。定时给裸鼠换干净的笼子和垫料以及饮水等，保持裸鼠生长环境清洁。

2. 实验方法

a:裸鼠移植肿瘤模型的建立 细胞复苏并传代，调整细胞状态在一周以后，细胞的生长环境趋于稳定。细胞经过消化、计数后，调整活细胞数密度为每200µL悬液含有3ⅹ10⁶个细胞备用。然后1500g离心3min。吸走培养基后，用生理盐水轻轻吹匀，制成细胞悬液，在无菌超净台内，将裸鼠按照体重的平均值一致的原则分组并剪耳朵标记，在每只裸鼠的背部皮下注射200µL细胞悬液（约3ⅹ10⁶个细胞）。每隔一天，用游标卡尺测量肿瘤的长径（Dmax）和短径（Dmin），计算肿瘤的体积V(V= Dmax ⅹ Dmin2/2)。

b：动物分组及给药 从接种完肿瘤细胞第二天起，根据分组的裸鼠进行给药（1）空白对照组：每周六天按照每天腹腔注射生理盐水，灌胃含有1%-Tween 80的生理盐水；因为Gefitinib溶解在1% Tween-80里边制备成悬液；（2）Gefitinib按照一周两次进行灌胃，按照50mg/kg或者100mg/kg Gefitinib进行给药；（3）EGCG组按照每周六天，每天一次的频率进行给药，腹腔注射的剂量是EGCG 40mg/kg；（4）联合给药组按照每周六天，每天一次的EGCG 40mg/kg以及Gefitinib每周两次的50mg/kg或者100 mg/kg的剂量进行给药。肿瘤体积测量频率为每隔一天进行，裸鼠体重每隔两天进行一次称量，并记录。给药完成后处死裸鼠，取出肿瘤并拍照。按照后续的实验安排保存实体瘤。建模实验中选取6-8周龄裸鼠，分为6组，每组5-6只，无菌饲料喂养。

3实验结果

注射完肿瘤细胞第二天开始给药，给药期间每隔3天对裸鼠体重进行检测，结果所图7所示：各组药物对NCI-H1975 荷瘤小鼠体重影响没有差别，整个过程中没有药物带来的裸鼠死亡，说明药物对裸鼠没有毒副作用。各组药物对NCI-H1975荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。如图8所示，从图中可见，Gefitinib和EGCG联合给药后，NCI-H1975荷瘤裸鼠的肿瘤生长并没有受到抑制，各组之间肿瘤的生长没有差异。结果表明，这种联合使用对EGFR双突变的细胞NCI-H1975移植瘤没有效应，进一步证明这种联合使用只对EGFR野生型的肿瘤有抑制作用。按照每隔一天对移植瘤裸鼠的肿瘤体积进行测量，绘制的肿瘤生长曲线，结果如图9所示，联合使用对NCI-H1975细胞抑制瘤的肿瘤体积没有影响；剥离的肿瘤进行称量重量，结果如图10所示，联合使用对EGFR双突变1975细胞的移植瘤的肿瘤重量没有影响。

本发明选取EGFR野生型并且高表达的表皮鳞状细胞系和EGFR双突变的肺癌细胞系作为对照，一系列的细胞实验（MTT、Western-blotting、）证明gefitinib和EGCG及其衍生物联合使用后，对EGFR野生型的肿瘤细胞表现出非常明显的抑制现象，而对EGFR双突变的非小细胞肺癌没有效果。说明这种联合用药是有选择性的。

体内实验更进一步证明gefitinib和EGCG联用能够显著抑制EGFR野生型肿瘤细胞移植瘤的生长，并且对机体的体重没有明显的影响，表明这种联合使用没有明显的毒副作用。

综上所述，表没食子酸儿茶素没食子酸酯（EGCG）与EGFR抑制剂gefitinib联合使用能够显著抑制EGFR野生型肿瘤细胞的生长，并且对机体不会造成伤害，二者联合减少了较大剂量下抗癌药物所致的治疗风险和毒副作用，本发明为EGFR野生型的癌症患者提供一个有效的治疗策略，提高了原有抑制剂的敏感性，拓宽原有抑制剂的适用范围。

当制备针对EGFR野生型肺癌的药物时，化合物用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病类型和严重程度等进行调整，gefitinib的剂量为0.1-5mg/kg体重，EGCG的剂量为0.1 -8mg/kg体重。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。