一种人体呼出气体离线采集装置及方法与流程

本发明涉及人体呼出气体离线采集装置，具体涉及一种可以配合气相色谱串联质谱(gc-ms)、质子转移反应质谱(ptr-ms)等仪器，用于呼出气中疾病相关的挥发性有机物(vocs)组分识别的装置，属于卫生学中的样品采集领域。

背景技术：

人体呼出气中vocs成分的分析在慢性疾病诊断中的研究和应用正愈发受到社会的关注。例如，丙酮、二甲基硫醚、异戊二烯、丁醇、硝酸甲酯以及一些长链烷烃和苯系物被发现在糖尿病患者的呼出气中存在明显的水平异常；苯、丙醇、苯乙烯、戊烷等在多个研究中均被识别为肺癌的潜在标志物；庚酮、戊酮等醛酮类以及乙烷、戊烷等烷烃被证明与多种呼吸系统慢性疾病，如慢性肺阻、肺部纤维化、哮喘等存在显著的关联(vanberkel,j.j.,etal.,respirmed,2010.104(4):p.557-63；saidi,t.,etal.,sensorsandactuatorsb:chemical,2017.257:p.178-188；bajtarevic,a.,etal.,bmccancer,2009:p.9:348.)。相比于传统有创、成本极高的诊断方法，呼出气vocs用于疾病诊断的主要优势在于对于人体基本没有伤害、快速、成本低，未来很可能成为疾病早期筛查和连续监控的重要手段。然而目前为止，国内外疾病相关呼出气vocs组分相关数据的积累仍然十分有限，存在巨大的缺口(vanvliet,d.,etal.,jbreathres,2017.11(1):p.016016；bouza,m.,etal.,jbreathres,2017.11(1):p.016015.)。制作适用于vocs分析的标准化人体呼出气采集装置和流程是保证这些数据迅速和高质量积累的关键和基础。

用于vocs分析和疾病诊断的呼出气采集装置的使用目前仍存在如下几个问题：(1)虽然已经开展了大量的研究，但不同研究筛选出的同一疾病相关的呼出气vocs种类和水平具有较大差异(buszewski,b.,etal.,biomedchromatogr,2007.21(6):p.553-66.)。导致这一现象的关键原因之一是缺少统一的呼出气采集装置和操作流程，这严重影响呼出气vocs分析的可比性，也导致批量进行呼出气vocs采集和分析困难重重。(2)由于原理的差异，不同设备分析vocs的荷质比范围不同。例如gc-ms类的设备和ptr-ms类的设备分别被用于检测荷质比相对高和低的vocs。纳入疾病诊断的vocs种类和荷质比跨度极大，但目前呼出气的采集装置一般只适应于某一类vocs分析设备，分析的质量范围十分狭窄。开发可以同时适应多类vocs分析设备，并进行同步采集的采样装置，可以提升筛选出优秀疾病标志物的可能性和效率，进而提高标志物诊断疾病的准确率。(3)目前主要的呼出气离线采集系统主要有三种(vanberkel,j.j.,etal.,respirmed,2010.104(4):p.557-63；herbig,j.,etal.,jbreathres,2008.2(3):p.037008；herbig,j.,etal.,jbreathres,2009.3(2):p.027004.)：一是使用tedlar气袋直接进行被采集者的呼出气收集，这种方法装置简单，操作方便，但无法排除外界vocs吸入对于低浓度呼出气vocs的影响，无法避免呼出气中的高湿度对于分析设备精度的影响，无法用于样品的长距离运输和储存；二是使用面罩法进行被采集者的呼出气收集，但这种方法成本较高，操作耗时、复杂，并不适用于大人群的疾病诊断及呼出气vocs研究工作；三是使用固体吸附材料结合热脱附方法进行采集和分析，但这种方法对于低荷质比的vocs分析能力严重不足。(4)采集过程中被采集者可能由于采样管路压力产生不适感，无法进行舒展的主动呼吸，影响样品采集条件的一致性和被采集者的依从性。

下面对已有的呼出气vocs采集的几项代表性技术进行描述。

vanberkel等人开发的呼出气采集与检测方法操作流程如下(vanberkel,j.j.,etal.,respirmed,2010.104(4):p.557-63)：(1)样品采集。使用氮气吹洗过2次的5ltedlar气袋收集受试者憋气5秒后全力呼出的气体，并将该气体随后转移至气体吸附管中。(2)样品检测。将(1)过程得到的吸附管转移至热脱附单元并快速升温至270℃，热脱附所得部分气体进入gc-ms检测m/z为35-350的vocs。该方法仍存在以下问题：首先，在该法中受试者需憋气5秒并用力呼出气体，这种方法降低了人群的适应性和可重复性，得到的呼出气vocs可能存在较大差异；其次，该方法先使用气袋采集，再转入吸附管，通过热脱附处理进行质谱检测，增加了采样时间，影响了检测结果的准确性，也不适合于多地区、大人群的采样；第三，该方法只配套gc-ms检测呼出气vocs，对低核质比vocs的检测能力非常有限。

中国发明专利申请公开文本cn109009236a中提供了一种潮式无创的呼出气vocs采集方法，能够非受迫地采集人体呼出气vocs，避免外界环境的干扰。但该法仅能使用气袋进行气体收集，无法实现样品的长距离运输和储存，难以应用于需要统一进行样品分析的多地区采样。

段忆翔等在实用新型专利cn207779768u中将bio-voc采样器与tedlar气袋联用，实现了一段时间末端呼出气的采集。但该装置未考虑高湿度和环境中的vocs对于后续分析的影响。此外，该专利中使用的装置均只能与单一种类的vocs分析仪器配合使用，检测的vocs种类受到仪器的限制，严重影响关键vocs组分的筛选。其他已有的方法同样存在上述之一或多个问题。

当前需要能够适用于大人群规模化采样的，多设备宽谱系vocs分析的简单、快速、准确、无创、低成本的标准化呼出气采集装置和方法。

技术实现要素：

本发明涉及的部分术语如下表所示：

本发明的目的是提供一种适用于中国地区大范围人群的，可联用多类型质谱仪器进行呼出气vocs检测的，简便、快速、全面、准确、被采集者负担小的呼出气采集装置，及对应采集方法。

本发明的技术方案如下：

一种呼出气离线采集装置，包括气体吸入管路、呼出气采集管路和稀释管路，其中：气体吸入管路包括依次通过管路连接的抽气泵、空气vocs过滤器、吸入缓冲气袋和吸气用呼嘴，空气由抽气泵抽入，经空气vocs过滤器过滤后进入吸入缓冲气袋，吸入缓冲气袋中的洁净空气经吸气用呼嘴被受试者吸入；呼出气采集管路包括呼气用呼嘴、管路a、采样缓冲气袋、管路b、vocs吸附管和恒流采样器，呼气用呼嘴通过管路a连接采样缓冲气袋，采样缓冲气袋通过管路b连接vocs吸附管的一端，恒流采样器连接vocs吸附管的另一端；受试者呼出的气体经管路a进入采样缓冲气袋，再在恒流采样器的作用下经管路b进入vocs吸附管进行吸附采样；稀释管路包括一质量流量控制器，质量流量控制器将气体吸入管路中经过滤处理后的空气导入采样缓冲气袋，对呼出气进行定量稀释。

上述呼出气离线采集装置中，各部件之间的连接管路以及吸入缓冲气袋、采样缓冲气袋的材料为聚四氟乙烯或其它便于成型的低吸附材料，以最大化降低装置材料对vocs的吸附。

上述呼出气离线采集装置中，所述空气vocs过滤器可以采用活性炭罐，可以是一个或多个活性炭罐串联在一起。在本发明的实施例中采用了两个串联的椰壳活性炭罐作为空气vocs过滤器。

上述呼出气离线采集装置中，在连接空气vocs过滤器和吸入缓冲气袋的管路中设置了石英过滤膜，避免vocs过滤器中的材料进入吸入缓冲气袋。

上述呼出气离线采集装置中，所述vocs吸附管可以是一个或多个串联在一起，常用的vocs吸附管例如tenax管。由于呼出气中部分vocs含量极高，vocs吸附管的串联设计避免了因为吸附饱和导致的测量结果偏低。

为了便于vocs吸附管的接入和替换，将vocs吸附管安装于一个吸附管适配器中。所述吸附管适配器包括一框架，在框架的两个相对面上设有一对或多对用于固定vocs吸附管两端的接口，vocs吸附管两端通过接口与框架内的管路连接。进一步的，框架上还设置有用于固定vocs吸附管中部的吸附管固定器，所述吸附管固定器可以是与vocs吸附管粗细适配的凹槽结构。所述吸附管固定器和接口保证了vocs吸附管可以快速更换和稳定采样。

优选的，呼出气采集管路中的管路a、采样缓冲气袋、管路b和vocs吸附管置于一温控箱内，避免待测呼出气中的vocs液化损失。

进一步的，在管路a上设有单向阀，在管路b上设有开关，控制气流的断通。

所述稀释管路中的质量流量控制器的一端连通空气vocs过滤器到吸入缓冲气袋的管路，另一端连接采样缓冲气袋，将净化后的空气导入采样缓冲气袋，对呼出气进行定量稀释，可避免高湿度对采样缓冲气袋内vocs分析准确性的影响。

进一步的，所述呼出气离线采集装置还包括一个连通头，在对整个装置的管路进行清洗时，取下吸气用呼嘴和呼气用呼嘴，通过连通头将气体吸入管路和呼出气采集管路连通。

基于上述呼出气离线采集装置，本发明还提供了一种呼出气离线采集方法，包括以下步骤：

1)控制呼出气采集管路中的管路a、采样缓冲气袋、管路b和vocs吸附管的温度在40-45℃；

2)对整个管路进行清洗，然后将气体吸入管路和呼出气采集管路直接接通，打开抽气泵一段时间，然后取下vocs吸附管和采样缓冲气袋作为空白对照；

3)将吸气用呼嘴和呼气用呼嘴分别接到气体吸入管路和呼出气采集管路上，将管路a和管路b直接连接，打开抽气泵，待吸入缓冲气袋半满之后，受试者以正常速度从吸气用呼嘴吸气，再快速用力呼气入呼气用呼嘴，排空呼出气采集管路中的气体；

4)将管路a、管路b和质量流量控制器都与采样缓冲气袋连接，安装上未填充的干净的vocs吸附管，受试者以正常速度从吸气用呼嘴吸气，在快速用力呼气入呼气用呼嘴，打开恒流采样器采样一段时间，然后关闭恒流采样器，取下vocs吸附管保存；

5)打开质量流量控制器，对采样缓冲气袋中的气体进行适当稀释，然后取下采样缓冲气袋保存；

6)对整个管路进行清洗，重复步骤3)至5)再次采样，直至采样完毕。

上述步骤4)中，在恒流采样器开启期间，优选的，让受试者适当停止呼气，维持采样缓冲气袋为半满状态。取下vocs吸附管后，在步骤5)将采样缓冲气袋呼至半满，停止呼气，打开质量流量控制器，将采样缓冲气袋9充满，取下采样缓冲气袋保存。

上述步骤2)和步骤6)中对整个管路进行清洗的方法是：将吸气用呼嘴和呼气用呼嘴与管路的连接处用连通头进行连接，使管路a和管路b直接连接，打开抽气泵冲洗整个管路一定时间。

对上述方法采集的样品进行运输储存和检测，可以使用气相色谱-质谱法(gc-ms)分析vocs吸附管中的vocs质量，使用质子转移反应质谱(ptr-ms)分析采样缓冲气袋中的vocs质量。

对于两根vocs吸附管串联的采集方法，vocs吸附管中的vocs浓度为：

公式(1)中，mx1:受试者两根vocs吸附管中的vocs质量；mx0：两根空白vocs吸附管中的vocs质量；vx：恒流采样器流速，一般为1.5l/min；tx：受试者采样期间恒流采样器的开启时间；tx0：采集空白期间恒流采样器的开启时间；tx和tx0一般均为10min。

采样缓冲气袋中的vocs浓度为：

公式(2)中，mr:受试者采样缓冲气袋中的vocs质量；mr0：空白采样缓冲气袋中的vocs质量；lall：采样气袋的体积，一般为10l；vr：质量流量控制器流速，一般为15l/min；tr：质量流量控制器的开启时间，一般为15-20s。

本发明的呼出气离线采集装置可在大人群范围批量实现人体呼出气中宽谱系vocs的标准化采集，配合多类型质谱设备可实现疾病初期筛查、患病程度的连续监测、药物治疗效果检验等。

本发明的呼出气离线采集装置和采集方法解决了疾病辅助诊断方法开发过程中呼出气vocs离线采集的多个问题：同时使用气袋和吸附管两种样品收集装置，可以匹配多种分析仪器，实现vocs的宽谱系分析，并且可以同时满足现场快速采集检测以及多地区批量采样，统一分析的需求；采用以缓冲气袋为核心的缓冲体系可以配合被采集者缓吸深呼的呼吸方式，消除过去采样方法中被采集者的压迫感和不适感，同时保证呼出气样品的可重复性；采样装置简单便携，成本较低，采样方法快速无创，受试接受程度高，适用于多地区大范围人群的标准化采样；尽量规避中国较高的vocs环境背景对于呼出气中低浓度vocs的影响。

附图说明

图1是本发明呼出气离线采集装置的结构示意图；

图2是本发明实施例的呼出气离线采集装置的设计图；

图3是吸附管适配器的一种设计的示意图，其中：(a)吸附管适配器的整体结构图，(b)a-a方向的剖面图，(c)b-b方向的剖面图。

图1至图3中：1-抽气泵，2-空气vocs过滤器，3-石英过滤膜，4-吸入缓冲气袋，5-吸气用呼嘴，6-呼气用呼嘴，7-堵头，8-连通头，9-采样缓冲气袋，10-管路a，11-管路b，12-vocs吸附管，13-吸附管适配器，14-恒流采样器，15-质量流量控制器，16-温控箱，17-吸附管固定器，18-接口，19-单向阀，20-温度控制器。

图4显示了实施例中离线检测不同受试者三次呼出气vocs的实验结果。

图5显示了储存时间对于采样缓冲气袋内残留气体水平的影响，共测试了6种vocs，其中每个受试者每组数据的3个直方图分别对应每个受试者气袋在采样后保留2、2.5、3小时测得的vocs浓度。

图6显示了清洗次数对于采样缓冲气袋内残留气体的影响。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例进一步详细描述本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。

如图1和图2所示，本发明的人体呼出气离线采集装置主要由三部分组成：气体吸入管路、呼出气采集管路和稀释管路。

气体吸入管路包括依次连接的抽气泵1、空气vocs过滤器2、吸入缓冲气袋4和吸气用呼嘴5，它们之间的连接管路以及吸入缓冲气袋4使用聚四氟乙烯材料制备以最大化降低vocs在管壁的吸附。所述空气vocs过滤器2采用两个串联的椰壳活性炭罐，在椰壳活性炭罐连接吸入缓冲气袋4的管路中还增设了石英过滤膜3。抽气泵1抽取的空气经串联的椰壳活性炭罐和石英过滤膜净化后进入吸入缓冲气袋4，吸气缓冲气袋4采用两通tedlar气袋，通过连接部件连接吸气用呼嘴5。

呼出气采集管路包括呼气用呼嘴6、采样缓冲气袋9、vocs吸附管12和恒流采样器14，它们之间通过聚四氟乙烯管依次连接。所述采样缓冲气袋9采用三通tedlar气袋，其中呼气用呼嘴6通过管路a10连接三通tedlar气袋的一通，另一通经管路b11连接vocs吸附管12。在管路a10中设有单向阀19，当气体吸入管路和呼出气采集管路连通时单向阀可避免空气中vocs对于测量结果的影响。在管路b11上设有开关，控制气流的断通。所述vocs吸附管12可以采用两个串联的tenax管。为了便于吸附管的接入和替换，vocs吸附管安装于吸附管适配器13中。

图3显示了安装有两个串联的tenax管的吸附管适配器13的结构，所述吸附管适配器13包括框架，在框架的两个相对面上设有用于固定tenax管两端的接口18，tenax管通过接口与固定在框架中的聚四氟乙烯管连接，同时框架上还设置了固定tenax管中部的吸附管固定器17，所述吸附管固定器17为与tenax管粗细适配的凹槽结构。吸附管固定器17和接口18保证了tenax管可以快速更换和稳定采样。由于呼出气中部分vocs含量极高，tenax管串联设计避免因为吸附饱和导致的结果偏低。

呼出气采集管路中的采样缓冲气袋9和vocs吸附管12及其连接管路都设于温控箱16内，由温度控制器20控制温度在一定范围内(见图2)，避免vocs液化损失。

稀释管路包括质量流量控制器15，其两端分别通过聚四氟乙烯管连接气体吸入管路和呼出气采集管路，将气体吸入管路中净化后的空气导入采样缓冲气袋9，对呼出气进行定量的稀释，避免高湿度对采样缓冲气袋9内vocs分析准确性的影响。

在进行管路清洗时，取下吸气用呼嘴5和呼气用呼嘴6，然后通过一个连通头8将气体吸入管路和呼出气采集管路连通。

本实施例中采用的关键仪器和耗材的来源列于下表：

本实施例中，抽气泵1的流量约40l/min，吸入缓冲气袋4和采样缓冲气袋9均为10l的tedlar气袋，恒流采样器14的流量为1.5l/min，质量流量控制器15控制流量为15l/min，温控箱可控制温度在40-45℃。整个呼出气离线采集装置具有如下优点：

1.除软连接处外，整个装置管路、接口、各类阀门全部使用聚四氟乙烯材料，气袋均为tedlar气袋，避免了采样装置本身对于样品的污染，并最大化降低装置对vocs的吸附；

2.为呼出气采集管路添加温控设备，保证环境温度高于呼出气本身温度，避免采集过程中的vocs液化损失；

3.气体吸入管路和呼出气采集管路可以进行连接，方便快速冲洗采集管路，保证了多人连续采样的可能性，提升了装置的使用效率；

4.受试者通过气体吸入管路吸入vocs背景极低的洁净空气，防止环境大气中的vocs影响呼出气组分；

5.气体吸入管路和呼出气采集管路设有符合人体正常深呼吸习惯的缓冲气袋，可以很好地配合被采集者完成缓吸快速深呼的呼吸模式，在保证采集肺部深部vocs的同时消除采样过程中被采集者的不适感，保证采集呼出气组分的可重复性；

6.采集过程中可以通过质量流量控制器对呼出气进行定量的稀释，避免高湿度对分析仪器准确性的影响，这一点对于ptr-ms类检测设备尤为重要；

7.在呼出气采集管路中同时配有tedlar气袋和固体吸附管两种样品采集方式，并能实现同时的定量化采集，这保证了该采样装置可以与多种质谱仪器配合使用，同步采集高荷质比和低荷质比范围的vocs。此外，tenaxgr吸附管便于运输储存，可以实现全国多地区人群的批量采样与统一分析。

下面利用上述呼出气离线采集装置对四名受试者进行呼出气vocs的离线采集与检测。

本实施例招募4名受试者，连续采集他们的呼出气，用于验证使用该装置的合理性，过程如下：

a.采样准备

采样前24小时要求受试者不要进药、进食、运动。采样开始前要求受试者漱口，用鼻夹夹住鼻子。指导受试者按照要求进行缓慢吸气和用力快速呼气，有不适感后马上停止。

打开设备的温控装置，控制温控箱温度在40-45℃。

b1.管路清洗

将吸气用呼嘴5和呼气用呼嘴6连接处的三通用连通头9进行连接；将管路a10(φ3/4)和管路b11(φ1/4)通过一转接头进行直接连接；打开管路b上的开关；将吸附管适配器13中的tenax管替换成未填充的干净tenax管，打开抽气泵1冲洗整个管路10min；关闭抽气泵1。

b2.收集空白

将管路a10和管路b11与采样缓冲气袋9(三通tedlar气袋，10l)连接；在吸附管适配器13上安装好两根tenax管；打开抽气泵1，10min后取下tenax管盖好，取下采样缓冲气袋9关好，作为空白tenax管和空白气袋对照；关闭抽气泵1。

c.采样

c.1取下连通头9，安装好吸气用呼嘴5和呼气用呼嘴6；将管路a10和管路b11通过转接头进行连接；打开抽气泵1。

c.2待吸入缓冲气袋4(两通tedlar气袋，10l)半满之后，指导受试者以正常速度从吸气用呼嘴5吸气，快速用力呼气入呼气用呼嘴6，排空采集管路中的气体。

c.3将管路a10、管路b11、质量流量控制器15连接的管路与采样缓冲气袋9(三通tedlar气袋)连接；在吸附管适配器13上安装好两根tenax管；指导受试者以正常速度从吸气用呼嘴5吸气，快速用力呼气入呼气用呼嘴6；打开恒流采样器14采样10min。

c.4恒流采样器14开启期间，适当停止呼气，维持采样缓冲气袋9(三通tedlar气袋)半满。

c.5关闭恒流采样器14和管路b11上的开关，取下两根tenax管盖好。

c.6将采样缓冲气袋9呼至半满，停止呼气，打开质量流量控制器15，将采样缓冲气袋9充满；取下采样缓冲气袋9关好。

c.7重复b1过程进行管路清洗，重复c.1-c.6过程完成后面受试者的采样。4位受试者依次各完成3次采样。

d.样品运输储存和检测

tedlar气袋运输过程需要避光和x射线；使用gc-ms分析3次共12根tenax管中的vocs质量；使用ptr-ms在样品采集后2、2.5、3小时分析气袋中的vocs质量。

tenax管中的vocs浓度为：

mx1:同一受试者两根采样tenax管中的vocs质量；

mx0：两根空白tenax管中的vocs质量；

vx：恒流采样器流速，一般为1.5l/min；

tx和tx0：采样和采集空白期间恒流采样器的开启时间，一般均为10min。

tedlar气袋中的vocs浓度为：

mr:采样tedlar气袋中的vocs质量；

mr0：空白tedlar气袋中的vocs质量；

lall：气袋体积，一般为10l；

vr：质量流量控制器流速，一般为15l/min；

tr：质量流量控制器的开启时间，一般均为15-20s。

图4展示了4名受试者3次采样样品中部分vocs的浓度。由图可知，不同受试者的呼出气vocs水平差异较大，且同一受试者的重复样本中vocs水平差异较小，表明离线方法的可靠性。图5展示气袋储存时间对部分vocs浓度的影响。采样后2-3小时之间测量单一气袋中vocs浓度的变化均在±10％以内，表明该时间段测量气袋中vocs的可靠性。

e.耗材回收

e.1新的和重复利用的tenax管使用前分别需使用老化仪老化60和30min，老化温度为300℃。

e.2气袋的清洗回收。如图6所示，使用高纯氮气清洗tedlar气袋，比较清洗气袋3次、5次、7次、9次后残余vocs的浓度，可以看出，清洗气袋7次以上残余vocs浓度很低且下降缓慢，故确定7次为气袋回收清洗的最小次数。