枸杞多糖在制备抑制新生血管药物或保健品中的应用的制作方法

本发明涉及医药领域，具体为枸杞多糖在制备抑制新生血管药物或保健品中的应用。
背景技术：
：枸杞子是茄科植物宁夏枸杞的干燥成熟果实，主要分布在我国新疆、宁夏、青海等地区。枸杞子不仅是一味名贵的中药材，因其独特的滋补作用，也是众多的营养和保健食品之一。药典记载，枸杞具有益精明目、滋补肝肾的功效。枸杞多糖（lbp）是枸杞提取物的主要化学成分，是由葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、木糖和半乳糖6种单糖组成的水溶性多糖类化合物。枸杞多糖具有调节机体免疫、清除氧自由基、延缓衰老、降血脂、降血糖和抗疲劳等作用，具有广阔的开发应用前景。枸杞多糖对调节机体免疫、清除氧自由基、抑制肿瘤、延缓衰老、降血脂、降血糖和抗疲劳的报道较多，但枸杞多糖对抑制新生血管方面的报道较少。技术实现要素：本发明的目的在于提供枸杞多糖在制备抑制新生血管药物或保健品中的应用，该药物或保健品具有抑制各种疾病导致的血管新生的功能。为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：本发明用枸杞的提取物—枸杞多糖为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药剂或保健品。本发明所述的枸杞多糖与药学上可接受的辅料或辅助性成分混合制备成各种形式的片剂、粉剂、颗粒、丸剂、膏剂、胶囊或滴眼液。进一步的，所述枸杞多糖为成分为中性糖含量≥30％，糖醛酸含量≥5％，蛋白含量22-38%的粉末。进一步的，由枸杞多糖与药学上可接受的辅料或辅助性成分混合制备而成的各种形式的片剂、粉剂、颗粒、丸剂、膏剂、胶囊或滴眼液，按照其制药工艺所属的制药单位计，每单位中枸杞多糖的含量为20-200mg。本发明的有益效果在于：由枸杞多糖组成的药物或保健品，具有抑制因糖尿病、肿瘤等疾病引起的血管新生的作用，药效明确，安全性高，为临床提供了一种新的用药选择。附图说明图1为mtt法测定各组吸光度值（×100）；图2为各组各时间点（×100）迁移面积；图3为各组24h血管形成情况；图4为huvecs经试验浓度lbp作用后细胞内部结构变化（×200）；图5为生理盐水、vegf和苏拉明对鸡胚尿囊膜血管生成情况的影响。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1：lbp对人脐静脉血管内皮细胞的增值、迁移及血管形成的影响；1、实验材料（1）药品与试剂枸杞多糖（lbp）由宁夏天仁枸杞生物科技股份有限公司生产，胰蛋白酶〔含乙二胺四乙酸(edta)〕、二甲基亚砜(dmso)由美国sigma公司生产，优级胎牛血清由美国gibco公司生产，dmem高糖型培养基由美国hyclone公司生产，噻唑蓝(mtt)由美国genview公司生产（2）细胞系：人体静脉血管内皮细胞（huvecs）由辽宁医学院附属第一医院普外科肿瘤中心实验室提供。2、实验方法（1）huvecs培养方法：由37℃体积分数5%co2孵育箱中取出t25培养瓶，倒置相差显微镜下见huvecs贴壁生长,生长状态良好，平铺培养瓶底部，未见细胞重叠现象，当细胞铺满细胞瓶壁80%～90%时，出现生长抑制，进行细胞传代。具体过程如下:①将培养瓶内培养液倒掉，用5ml移液枪将瓶内剩余培养液吸出，磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗2～3遍，动作轻柔，加入25%胰蛋白酶消化液3ml，以胰蛋白酶铺满培养瓶底部为准，放回孵育箱中，消化1min;倒置相差显微镜下可见细胞回缩、变圆，细胞间隙变宽，少数贴壁细胞悬浮，随后加入3mldmem高糖培养液终止胰酶消化，同时用5ml移液枪反复吹打瓶壁，倒置相差显微镜下见细胞均无贴壁，呈单个漂浮培养液;②将细胞悬液移15ml离心管中，1200r/min，离心3min后，见离心管底部灰白色细胞沉积，用3ml吸管吸弃上清液，加入3mldmem高糖培养液后反复吹打成单细胞混悬液;③将3ml细胞混合悬液分别置于3个t25培养瓶中，再将每个t25培养瓶内加入含10%胎牛血清的dmem高糖溶液4ml，放入37℃体积分数为5%co2孵育箱中继续培养。（2）细胞计数：用10μl移液枪抽取内皮细胞培养第2步中3ml单细胞悬液用于计数，轻打入细胞计数板中，操作轻柔，勿产生气泡，然后置于倒置相差显微镜下计数，取平均值。计数操作重复两次。细胞数目:4象限细胞数总和4×107/l。（3）mtt法测定细胞增殖实验：实验分为6组，即a～f组，lbp浓度依次为0、20、50、100、200、500μg/ml，每组均设6个复孔，以减小误差。（4）细胞甩片技术：应用200μg/mllbp常规培养huvecs24h，取处于对数期生长的huvecs，通过上述细胞培养技术及细胞计数方法，利用d-pbs溶液配置huvecs单细胞悬液，调整细胞浓度至2×105/ml，应用100μl移液枪抽取单细胞悬液100μl，加入甩片槽中，调整甩片离心机1200r/min，离心3min，取出细胞载玻片，利用吉姆萨染液覆盖细胞涂片，染色2min之后应用清水冲洗掉粉红色背景染色，放置于倒置相差显微镜下观察。（5）划痕实验：利用上述细胞培养技术及细胞计数方法，取对数生长期血管内皮细胞配制单细胞悬液，调整细胞个数为每孔1.5×105个，接种于12孔板，待细胞贴壁，生长成单细胞层时，用200μl枪头于板孔底面中轴划一道划痕，同时进行划痕部位拍摄，设空白对照组及实验组，每组4个复孔，常规培养24h。以划痕剩余面积测定lbp对huvecs迁移能力影响。（6）血管生成实验：于实验前一天，将matrigel基质胶(bd公司)放于4℃融化。将100μl枪头及96孔板冷藏备用。开始实验时，由冰箱中取出冷藏好的100μl枪头及96孔板，首先分组，设空白对照组及实验组，每组4个复孔，目的为减少实验误差，然后将matrigel基质胶加入96孔板(空白对照组及实验组)中，每孔50μl，共8孔。在加入基质胶时应注意保持枪头垂直于孔板中间位置，其中matrigel基质胶应一直保持放在冰上，避免凝固。铺胶完毕后，将含有matrigel基质胶的96孔板放入37℃孵育箱中孵育30min，使基质胶凝固。在此过程中，开始准备huvecs悬液，通过利用上述细胞培养技术及细胞计数方法配置huvecs单细胞悬液，并调整细胞浓度为2×106/ml。空白对照组为含10%胎牛血清dmem高糖单细胞溶液，对照组为含lbp200μg/ml单细胞溶液，细胞密度相同，均为2×106/ml。从孵育箱中取出96孔板，可见基质胶凝固完好，无气泡产生，随后将实验组细胞悬液及空白对照组细胞悬液分别加入96孔板中，每100μl，含huvecs20000个。随后将96孔板放入37℃体积分数为5%co2孵育箱中培养，每隔6h记录实验结果，最终取24h血管形成图片。（7）实验溶液配置：①配置lbp母液，首先利用电子天平取35%含量lbp10mg，称量精确到小数点后两位，将称取的lbp粉末轻倒15ml离心管中，随后加入10mld-pbs稀释，使lbp粉末充分溶解，置于离心机中，500r/min，后于超净台下应用0.22μm微孔滤菌膜滤过沉淀物质及细菌，此时母液含量1μg/ml，母液配置完成。配置lbp实验溶液，以500μg/ml浓度为例，首先应用1ml移液枪抽取母液1ml置于2mleppendorf管中，按1∶1加入10%胎牛血清dmem高糖溶1ml，反复震荡混匀，做好标记后存放于4℃冰箱。20，50，100，200μg/ml浓度依次按上述方法成比例配置。②配取mtt溶液，利用电子天平称取50mgmtt，称量精确到小数点后两位，置于15ml离心管中，加入d-pbs10ml，使其溶解，反复震荡混匀，后于超净台内应用0.22μm微孔滤膜除菌，分装冻存于－20℃冰箱中贮存。③实验细胞培养，取处于对数生长期的huvecs，利用上述细胞培养技术及细胞计数方法，配置单细胞悬液，调整细胞浓度为4×104/ml，接种于96孔培养板中，每孔100μl(约含huvecs4000个)，四周边孔应用d-pbs隔离，每孔100μl，从而减少细胞趋向运动，放入37℃体积分数为5%co2孵育箱中常规孵育6～9h，使细胞完全附壁同步，备用。（8）mtt法测定细胞吸光度值：观察细胞贴壁良好后，将各实验组如前分组所示加入含不同浓度lbp培养基，空白对照组利用含10%胎牛血清dmem高糖培养基代替。继续放入孵育箱中培养24h，然后每孔加入5g/l的mtt溶液10μl，37℃孵育4h，然后吸弃各孔中上清液，加入dmso150μl/孔，振荡混匀，室温放置10～15min，使结晶充分溶解混匀，于全自动酶标仪570nm测定各组吸光度值。（9）统计学方法：采用spss17.0软件进行t检验和单因素方差分析。3、实验结果（1）各组mtt检测结果：如图1所示，与a组(1.488±0.051)比较，c、d、e、f组对huvecs生长抑制作用逐渐增强，吸收值分别为1.334±0.048、1.040±0.068、0.765±0.051、0.479±0.052(p＜0.01)，b组1.490±0.015。依据半数致死量(ld50)，现选取200μg/ml作为实验浓度。（2）各组相对剩余面积比较：实验组与空白对照组相对剩余面积具有统计学差异(p＜0.05)，如表2、图2所示，实验浓度lbp可抑制新生血管形成，如图3所示。表1各组划痕愈合剩余面积的比较（x±sn=4）组别0h(μm2)24h(μm2)相对比（%）空白对照组42.26±1.4813.45±1.2868.22±2.07实验组43.19±1.0325.65±1.5640.63±2.81（3）细胞甩片技术大部分细胞萎缩、碎裂，部分细胞内可见凋亡小体形成，如图4所示。由此推断lbp很可能是通过促进细胞凋亡，缩短细胞生存周期而达到抑制血管内皮细胞生长作用。本实施例表明，200μg/mllbp对huvecs的增殖及迁移具有明显的抑制作用，其机制很可能是缩短血管内皮细胞周期，促进其凋亡，从而达到抑制细胞增殖。同时血管内皮生长因子作为新生血管最为关键的刺激因子，推测lbp能够降低其血清中含量，从而达到对huvecs形成新生血管明显的抑制作用。实施例2、lbp对鸡胚尿囊膜血管生成的影响1、实验材料枸杞多糖（lbp）由宁夏天仁枸杞生物科技股份有限公司生产，新鲜白皮种蛋购自北京农业大学，无菌明胶海绵购自中日友好医院；血管内皮细胞生长因子vegf（peprotech公司）、苏拉明（sigma公司），乙醇、甲醇、丙酮均为分析纯，购自北京化学试剂公司。2、实验方法（1）lbp工作液的配置：运用实施例1的方法，按比例依次配置浓度为6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的lbp工作液备用。（2）实验模型的建立：①选择受精率大于90%、生长良好的白皮种蛋，用浸有新洁尔灭的脱脂棉擦拭鸡蛋表面，消毒后置于恒温培养箱中培养，温度37℃，培养箱内放入水盘以保持60%～70%相对湿度，并保持一定的通风换气条件。鸡蛋气室向上，每天转蛋2次，转蛋角度以水平位置前俯后仰各45°为宜。鸡胚孵育6d后，用照蛋灯照蛋，挑选出发育良好的鸡胚。用75%酒精消毒后晾干。用牙科钻小心磨切lcm2的外壳，轻轻揭除开窗处卵壳，小心揭除白色卵壳膜暴露有丰富血管的透明尿囊膜。②加药将无菌明胶海绵剪成1cm2的小块，分别加入到30μl上述过滤过的lbp工作液，置于窗口中央位置的尿囊膜上，用无菌透明胶带封住窗口后，放回孵育箱中继续孵育48h。并设置对照组（无菌生理盐水）、具有血管生成作用的vegf组（4.69mg/个鸡胚）和具抑制血管生成作用的苏拉明组（60mg/个鸡胚）,每组均做10个鸡胚。③取膜48h后揭开鸡胚小窗上的透明胶带，滴加固定液（甲醇：丙酮=1:1）固定15min后，小心地将尿囊膜取下，敷贴在滤纸上，照相并在解剖镜下计数。计数以给药为中心在直径1.0cm的范围内，根据血管的直径分为大、中、小血管在解剖镜下进行血管根数的计数。（3）统计学方法：采用spss17.0软件进行t检验和单因素方差分析。3、实验结果lbp对鸡胚尿囊膜血管生成的影响，首先肉眼观察加人lbp后的明胶海绵周围血管生长情况，与生理盐水组进行比较。凡是新生细小血管减少、已有血管变细、或血管避开明胶生长者视为有抑制作用；反之，细小血管增加、血管变粗或血管趋向于明胶海绵生长者视为有促进作用。观察结果表明对照组明胶海绵周围新生血管生长良好，分支适中；vegf组出现血管生长旺盛、血管变粗的现象，尤其是大、中血管数显著增加；苏拉明组则出现明显血管减少、变细的抑制作用（见图5）,说明造模成功。如表2所示，为各浓度组分的lbp工作液对鸡胚尿囊膜血管生成的作用的计数结果。表2lbp对鸡胚尿囊膜血管生成的作用的计数结果总血管数量大血管数量中血管数量细血管数量对照组88.25±9.393.00±1.776.37±1.0678.87±8.95lbp100μg/ml75.28±1.384.28±1.385.43±2.3766.29±16.14lbp50μg/ml77.43±7.23*4.57±1.405.57±0.9767.42±9.67*lbp25μg/ml70.40±9.30*3.7±2.454.00±1.5562.70±9.67*lbp12.5μg/ml69.25±14.51*4.63±1.305.52±1.9359.12±8.03*lbp6.25g/ml71.33±14.513.83±2.935.5±2.4362.00±13.58注：*p＜0.05本实施例表明，lbp减少了局部鸡胚尿囊膜的微血管，呈现出抑制血管新生整体效应的趋势。当前第1页1 2 3