α-NETA在诱导细胞死亡中的应用的制作方法

本发明涉及细胞死亡诱导领域，具体地，本发明涉及α-neta在诱导细胞死亡，尤其是肿瘤细胞死亡中的应用。
背景技术：
：细胞死亡是指生命现象不可逆停止及生命的结束，正常存活组织中会发生细胞死亡，是维持组织机能和形态所必须的。而来自外界的因素往往会引起细胞非正常性死亡。细胞死亡的结果大多为细胞的终结。无论是正常细胞的程序性死亡，还是基于外界诱导因素造成的细胞非正常死亡，细胞的死亡与机体的代谢和健康状况息息相关。事实上，当正常机体内细胞死亡与新生的平衡机制一旦被打破，则会给机体带来各种不同情况的病理状态。例如肿瘤，即为细胞丧失了正常凋亡的能力，从而成为了恶性生长的细胞。而基于缺血缺氧或其它诱因造成的细胞死亡又会导致各种严重的疾病，例如神经退行性病变或局部坏死性病变。由于细胞死亡的机制复杂，虽然目前有很多药物开发针对细胞死亡，但往往效果不良或肿瘤细胞死亡速度较慢，因此本领域仍需对各种细胞死亡的机制及其干预的方法进行研究和调控，从而有助于解决细胞死亡引起的各种疾病。技术实现要素：本发明提供了一种α-neta的用途，用于：(a)制备诱导细胞死亡的药物组合物；(b)体外非治疗性诱导细胞死亡。在另一优选例中，所述细胞死亡为直接死亡。在另一优选例中，所述细胞死亡包括细胞焦亡、细胞凋亡、或细胞坏死。在另一优选例中，所述细胞包括肿瘤细胞。在另一优选例中，所述药物组合物含有α-neta和药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述药物组合物中α-neta的浓度为1×10-4μmol/ml-1μmol/ml。在另一优选例中，所述药物组合物中α-neta的浓度为1×10-3μmol/ml-0.1μmol/ml。在另一优选例中，所述肿瘤包括来自泌尿生殖系统和/或消化系统的肿瘤。在另一优选例中，所述的肿瘤为恶性肿瘤。在另一优选例中，所述的肿瘤恶性实体肿瘤。在另一优选例中，所述肿瘤细胞包括来源于下组一种或多种的细胞：肾癌、肾母细胞瘤、膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌、尿道癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、睾丸癌、阴茎癌、前列腺、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、小肠癌、结直肠癌、或肛门癌。在另一优选例中，所述细胞死亡具有以下一种或多种特征：(i)细胞质肿胀；(ii)细胞核浓缩、溶解和/或崩解；(iii)细胞分泌炎性因子；在另一优选例中，所述炎性因子包括tnf-ɑ、ifn、趋化素、il-2、il-16、il-18和/或il-1β中的一种或多种。在另一优选例中，所述细胞死亡还具有以下一种或多种细胞焦亡的特征：(iv)细胞整体形态呈煎蛋样表现(v)细胞膜表面出现气泡和/或细胞膜破裂；(vi)24小时细胞死亡率至少为30％、50％，较佳地至少60％，更佳地至少70％，最佳地至少90％；和/或(vii)48小时细胞死亡率至少为50％，较佳地为60％、70％、80％、90％或100％。本发明第二方面，提供了一种细胞死亡诱导剂，所述细胞死亡诱导剂含有α-neta，和药学上可接受的载体，其中，所述α-neta的浓度为。在另一优选例中，所述α-neta的浓度为1×10-3μmol/ml-0.1μmol/ml。本发明第三方面，提供了一种药盒，所述药盒含有单元剂型的α-neta和药学上可接受的载体，其中，所述单元剂型的α-neta的浓度为1×10-4μmol/ml-1μmol/ml，优选为为5×10-4-0.8μmol/ml、6×10-4-0.6μmol/ml、8×10-4-0.5μmol/ml，更佳地，为1×10-3-0.1μmol/ml、或1×10-2μmol/ml-5×10-2μmol/ml。在另一优选例中，所述单元剂型可用于按单元剂型的量于单位时间内向需要的对象施用。在另一优选例中，所述单元剂型的α-neta，用于小鼠时的单元剂量为0.01-1mg/kg/d；优选为0.02-0.08mg/kg/d，更佳地为0.03-0.05mg/kg/d。在另一优选例中，所述单元剂型的α-neta，用于人时的单元剂量为0.001-0.1mg/kg/d；优选为0.002-0.008mg/kg/d，更佳地为0.003-0.005mg/kg/d。在另一优选例中，所述药盒还含有说明书。在另一优选例中，所述细胞死亡诱导剂还包括一种或多种化疗剂；或所述药盒还含有单元剂型的化疗剂。在另一优选例中，所述化疗剂包括选自下组的一种或多种：5-fu、顺铂、卡铂、紫杉醇、丝裂霉素、多烯紫杉醇、培美曲赛、奈达铂、洛铂、奥沙利铂、和伊立替康。本发明第四方面，提供了一种制备细胞死亡诱导剂的方法，包括步骤：提供α-neta和药学上可接受的载体；混合α-neta和药学上可接受的载体，从而制成细胞死亡诱导剂。在另一优选例中，所述药学上可接受的载体包括药学上主要的靶向药物载体是小分子纳米颗粒，依靠epr效应，纳米颗粒会向肿瘤细胞聚集。主要载体有普通纳米颗粒，靶向定位纳米颗粒，磁性纳米颗粒。本发明第五方面，提供了一种体外非治疗性诱导细胞死亡和/或制备细胞死亡模型的方法，包括步骤：在α-neta存在的情况下培养细胞，从而体外非治疗性诱导细胞死亡和/或获得细胞死亡模型。在另一优选例中，所述的细胞为肿瘤细胞。在另一优选例中，所述细胞死亡为直接死亡。在另一优选例中，所述细胞死亡包括细胞焦亡、细胞凋亡、或细胞坏死。在另一优选例中，所述直接死亡不是细胞凋亡或细胞坏死。在另一优选例中，所述的细胞为恶性肿瘤细胞。在另一优选例中，所述的细胞包括来源于下组一种或多种的细胞：肾癌、肾母细胞瘤、膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌、尿道癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、睾丸癌、阴茎癌、前列腺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、小肠癌、结直肠癌、或肛门癌。在另一优选例中，所述培养至少培养24小时，较佳地至少培养48小时。在另一优选例中，所述培养的培养条件包括：含或不含10％fbs的培养基、5％co2、室温-37℃温度下。在另一优选例中，所述细胞死亡模型中至少50％，较佳地至少60％，更佳地至少70％，最佳地至少90％的细胞为死亡细胞。在另一优选例中，所述细胞死亡模型中具有以下一种或多种细胞学特征：(i)细胞质肿胀；(ii)细胞核浓缩、溶解和/或崩解；(iii)细胞分泌炎性因子；在另一优选例中，所述炎性因子包括tnf-ɑ、ifn、趋化素、il-18和/或il-1β中的一种或多种。在另一优选例中，所述细胞死亡还具有以下一种或多种细胞焦亡的特征：(iv)细胞整体形态呈煎蛋样表现(v)细胞膜表面出现气泡和/或细胞膜破裂；(vi)24小时细胞死亡率至少为30％、50％，较佳地至少60％，更佳地至少70％，最佳地至少90％；和/或(vii)48小时细胞死亡率至少为50％，较佳地为60％、70％、80％、90％或100％。本发明第六方面，提供了α-neta的用途，用于诱导细胞死亡和/或杀死肿瘤细胞。本发明第七方面，提供了一种诱导细胞死亡和/或杀死肿瘤细胞的方法，向所需的对象施用安全有效量的α-neta和/或其药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述安全有效量指的是满足以下一种或多种条件：(i)活性成分α-neta的浓度为，1×10-4μmol/ml-1μmol/ml，优选为为5×10-4-0.8μmol/ml、6×10-4-0.6μmol/ml、8×10-4-0.5μmol/ml，更佳地，为1×10-3-0.1μmol/ml、或1×10-2μmol/ml-5×10-2μmol/ml；(ii)活性成分α-neta的单元剂量为0.01-1mg/kg/d；优选为0.02-0.08mg/kg/d，更佳地为0.03-0.05mg/kg/d；在另一优选例中，所述杀死肿瘤细胞包括在施用α-neta之后，细胞死亡满足：24小时细胞死亡率至少为30％、50％，较佳地至少60％，更佳地至少70％；和/或48小时细胞死亡率至少为50％，较佳地为60％、70％、80％、90％或100％。。在另一优选例中，所述细胞包括肿瘤细胞。在另一优选例中，所述的肿瘤为恶性肿瘤。在另一优选例中，所述肿瘤细胞包括来源于下组一种或多种的细胞：肺癌、甲状腺癌、肾癌、肾母细胞瘤、膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌、尿道癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、睾丸癌、阴茎癌、前列腺、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、小肠癌、结直肠癌、或肛门癌。在另一优选例中，所述肿瘤细胞是肺癌、甲状腺癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌、卵巢癌和/或肝癌。附图说明图1a显示了ɑ-neta在不同浓度下的整体的死亡形态(放大100倍)；ɑ-neta在浓度0-12.5μg/ml(0-3.38*10-2μmol/ml)范围内死亡程度与浓度呈正相关；图1b显示了采用流式细胞术进行死亡率测定(ɑ-neta浓度3.38*10-2μmol/ml)，结果显示与对照组48小时死亡率4.8％相比实验组48小时细胞死亡率可达72.1％，p<0.01；图1c显示了使用cck8方法对ho8910、ho8910pm、a2780细胞株进行了细胞毒性测定，结果显示24小时时间段，ho8910，ho8910pm，a2780的ic50值分别为6.27μg/ml，26.32μg/ml，45.31μg/ml(对应于1.69*10-2μmol/ml，7.11*10-2μmol/ml，0.122μmol/ml)。图2显示了ho8910经过浓度3.38*10-2μmol/mlɑ-neta处理24小时后，在倒置显微镜下观察(40倍物镜)，阴性处理组作对照，结果可以看到在黑色方框内细胞死亡相关的大泡(图2a)，在结合荧光显微镜下同时观察到了与细胞焦亡后期相关的“煎蛋样”表现(图2b)；使用透射电镜对其进行了更加细微的观察，正常卵巢癌细胞作为对照如图(图2c)黑色箭头标注所示(放大倍数5000倍)，可以看到细胞膜破裂，线粒体肿胀，内质网囊泡化扩张。图3a显示了经ɑ-neta处理后，il-18的含量测定；图3b显示了使用wb方法，将ɑ-neta处理后的ho8910pm作为实验组，将相同浓度溶媒处理后的ho8910pm作为对照组。结果表明，与对照组相比，处理组的caspase4表达升高(图3c)(p<0.05)，gsdmd表达也升高(图3d)(p<0.05)，有统计学意义。图4a显示了将细胞焦亡通路相关基因gsdmd，caspase4进行si-rna敲减后，细胞死亡率情况。采用流式细胞仪进行细胞生存率检测，结果证明，与对照组相比经过相关si-rna敲减后的卵巢癌细胞在ɑ-neta处理24小时后细胞生存率升高。图4b显示了对流式细胞检测结果进行的数据统计分析，p<0.01。图5a显示了小鼠移植瘤实验的具体实施过程图；图5b-c显示通过瘤内注射施用ɑ-neta，与对照组相比，用ɑ-neta处理的肿瘤体积(p＝0.007)显著缩小，肿瘤重量(p＝0.004)显着减少。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，抗胆碱酯酶的抑制剂α-neta对于肿瘤细胞有非常强烈的杀死作用。具体地，发明人发现，α-neta对于肿瘤细胞，尤其是生殖系统以及消化系统的肿瘤细胞，例如卵巢癌和肝癌，具有非常良好的诱导死亡的效果，其能够在短时间内诱导细胞采用焦亡的方式进行快速死亡，且所需要的剂量非常低，与目前常规α-neta的计量相比相差数十倍。此外，发明人还发现，在该极低的剂量下(例如低于现行最低剂量的1/100-1/1000)，α-neta并不具有明显的毒副作用，因此，可以用于后期临床开发作为新的高效的诱导肿瘤细胞(即癌细胞)死亡并从而杀灭肿瘤细胞的药物。在此基础上，完成了本发明。α-netaα-neta，即n,n,n-三甲基-γ-氧代-1-萘丙胺碘化物，(n,n,n-trimethyl-y-oxo-1-naphthalenepropanaminiumiodide)，结构式如下：α-neta是一种乙酰胆碱转移酶chat抑制剂(ic50＝9μm)。这种天然荧光化合物是胆碱酯酶和肉毒碱乙酰转移酶的不良抑制剂。ɑ-neta为一种稳定的、非竞争性的、缓慢可逆的天然荧光化合物，不同浓度α-neta发挥不同作用：可作为乙酰胆碱转移酶(chat)抑制剂(ic50＝9μm)；显示抗胆碱能作用(ec50＝70-80μm)；激活乙酰胆碱酯酶(ec50＝360μm)；抑制胆碱酯酶(ic50＝1100μm)。主要产生肌肉放松效应。如本文所用，术语“α-neta”包括α-neta化合物本身以及采用α-neta作为活性成分的任何修饰、变体、异构体、或其改进形式的衍生物，也包括其药学上可接受的盐或酯。α-neta化合物本身是具有上述式i化学结构式的化合物。可以根据本领域常规技术，对α-neta进行结构改造和优化，例如对其稳定性、生物利用度毒性等进行优化的改造。本发明化合物还可以由药学上或生理学上可接受的酸或碱的衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下的酸形成的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸或羟乙磺酸。其它盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钙、钾或镁)形成的盐，以及酯、氨基甲酸酯或其他常规的形式。本发明所述α-neta来源没有特殊限制，可以为任何市售可得的α-neta，例如购自abcam，货号ab144314。细胞死亡率如本文所用，术语细胞死亡率是指在细胞和干预化合物同时存在(或培养)单位时间内，实验组相对阴性对照组的细胞死亡百分比。煎蛋样凸起如本文所用，术语“煎蛋样凸起”是指细胞死亡(尤其是细胞焦亡)情况下，细胞核位于细胞体中心和死亡细胞平面之上的细胞学形态。通常，死亡细胞(如焦亡细胞)在晚期出现细胞的煎蛋样凸起。气泡如本文所用，术语“气泡”是指细胞死亡(尤其是细胞焦亡)情况下，细胞发生肿胀，细胞膜破裂形成于细胞膜表面的气泡状物质。在细胞死亡中，可以出现或不出现气泡状凸起，优选在细胞焦亡的情况下形成气泡状凸起。通常形成的气泡体积大小不一，散布于细胞表面。(或横截面积)大于细胞器的大小，并占所述细胞原大小的10-50％。炎性因子如本文所用，术语“炎性因子”或“炎症因子”可互换使用，均是指参与炎症反应的各种细胞因子。通常，炎性因子包括由免疫细胞或非免疫细胞激活的各种细胞因子。例如tnf-ɑ、ifn、趋化素、白介素(il，如il-1、il-2、il-16、il18等)。细胞死亡如本文所用，术语“细胞死亡”指的是细胞(尤其是肿瘤细胞)的不可逆的细胞生命终结状态，在细胞死亡的状态下，细胞不再进行能量代谢。细胞死亡通常包括细胞的凋亡、细胞坏死、细胞焦亡等。死亡的细胞通常会产生各种细胞形态学变化，包括细胞质的肿胀、细胞核的浓缩、崩解或溶解，细胞器水肿，空泡形成，凋亡小体形成；死亡的细胞还通常会释放出一种或多种炎性因子。所述的炎性因子包括tnf-ɑ、ifn、趋化素、白介素(il，如il-1、il-2、il-16、il18等)。在另一优选例中，本发明所述的细胞死亡尤其包括细胞焦亡。细胞焦亡是一种广泛参与到感染性疾病、神经系统性疾病、血管性疾病中的细胞死亡方式，由cookson于2001年首次提出，是比其它细胞死亡方式更加快捷有效的细胞死亡方式。形态学上具有典型的细胞肿胀、来自质膜的特征性的大气泡，以及煎蛋样表现。细胞焦亡可以在巨噬细胞/树突状细胞中发生，也可发生在非巨噬细胞中。然而，细胞焦亡与其激活途径之间的具体引发机制仍未可知。在本发明中，细胞死亡是指细胞的直接或间接死亡，更典型的细胞死亡为本发明活性物质对细胞造成的直接、快速的死亡，例如细胞焦亡。细胞死亡诱导剂本发明还提供了一种细胞死亡诱导剂，而术语“细胞死亡诱导剂”、“诱导细胞死亡的药物组合物”、“本发明药物组合物”、“本发明诱导剂”均可互换使用，指的是可以在24小时之内至少诱导40％培养或施用对象的肿瘤细胞死亡的、具有α-neta作为活性成分的药物组合物。本发明所述的细胞死亡诱导剂是由低浓度α-neta及药学上可接受的载体构成的药物组合物。具体地，本发明提供的细胞死亡诱导剂包括低浓度α-neta作为活性成分，用于直接杀死细胞(尤其是肿瘤细胞)。本发明提供的细胞死亡诱导剂可以造成肿瘤细胞在体外细胞培养或局部施用24小时之内，所培养或施用对象的肿瘤细胞至少具有40％、50％、55％、60％、65％或70％的死亡率，和/或48小时之内，所培养或施用对象的肿瘤细胞至少具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％的死亡率。在本发明中，“低浓度”是指这样的一种浓度范围：在细胞死亡诱导剂或诱导细胞死亡的药物组合物中，α-neta化合物本身的浓度为，优选为0.8-1.2μmol/ml，更优选为0.9-1.0μmol/ml。本发明人通过动物实验发现，在施用于小鼠时，采用低浓度、低剂量的本发明诱导剂可以以非常快速的死亡方式(如焦亡)诱导肿瘤细胞死亡。具体地，本发明所述低剂量指的是α-neta剂量为0.01-1mg/kg/d；优选为0.02-0.08mg/kg/d，更佳地为0.03-0.05mg/kg/d。而本领域技术人员可以根据常规技术(如小鼠与人的体表面积换算)，计算得出应用于人的本发明诱导剂的剂量。在一种优选的实施方式中，应用于人时，剂量为0.001-0.1mg/kg/d；优选为0.002-0.008mg/kg/d，更佳地为0.003-0.005mg/kg/d。而本领域技术人员(如临床医师)可以根据本领域常识对所施用的剂量进行调整，从而适应施用对象所需的诱导剂剂量。此外，本发明诱导剂(药物组合物)除α-neta化合物本身和药学上可接受的载体，还可以含有一种或多种化疗剂或肿瘤靶向剂。通常，所述化疗剂包括一种或多种本领域常用的恶性肿瘤化疗药物，例如烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤抗生素、激素、免疫抑制剂或肿瘤特异性抗体等。而肿瘤靶向剂包括一种或多种与肿瘤细胞具有靶向结合能力的化合物或蛋白，例如肿瘤细胞表面特异性抗原的识别性抗体等。本发明诱导剂(药物组合物)还可与多种靶向于肿瘤细胞并与其结合的靶向物质进行偶联或联用，例如与特定抗体偶联制成抗体偶联药物(adc)，又如制成载药脂质体、微粒(微囊)载体或磁性药物载体等。本发明还提供了一种药盒。所述药盒含有单元剂型的α-neta和药学上可接受的载体，其中，所述单元剂型的α-neta的浓度为1×10-4μmol/ml-1μmol/ml，优选为为5×10-4-0.8μmol/ml、6×10-4-0.6μmol/ml、8×10-4-0.5μmol/ml，更佳地，为1×10-3-0.1μmol/ml。在另一优选例中，所述单元剂型的α-neta用于小鼠的单元剂量为0.01-1mg/kg/d；优选为0.02-0.08mg/kg/d，更佳地为0.03-0.05mg/kg/d。在另一优选例中，所述单元剂型中，α-neta用于人的单元剂量为0.001-0.1mg/kg/d；优选为0.002-0.008mg/kg/d，更佳地为0.003-0.005mg/kg/d。药学上可接受的载体如本文所用，属于“药学上可接受的”是使用于人和/或哺乳动物而无过度不良反应(如毒性、刺激和变态反应)的物质。术语“药学上可接受的载体”是指用于活性成分给药的无毒载体，包括各种赋形剂和稀释剂。本发明的药物组合物(或诱导剂)含有安全有效量的本发明活性成分以及药学上可接受的载体，这类载体包括(但不限于)：水、盐水、缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇、脂质体、蛋白、抗体、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶或其组合。另外，这些载体中还可能存在辅助性物质，如润湿剂、乳化剂、ph调节剂、崩解剂、粘合剂、稀释剂、等渗剂、防腐剂、分散剂、稳定剂、助溶剂、润滑剂、着色剂、或风味剂等，且配置过程可根据常规方式进行。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的ph以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明药物组合物(诱导剂)的剂型包括注射剂、口服制剂、透皮剂等。通常，这些剂型可以有溶剂、悬浮剂、乳剂、片剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、药丸、糖浆、气雾剂、栓剂、膏剂、滴剂、霜剂或贴剂等。本发明还可以通过缓释剂型的给药方式给药。术语“安全有效量”指的是足以向施用该化合物的对象提供有益效果且不会引起过渡不良反应的化合物的量，药学上可接受的载体的“安全有效量”是指足以将本发明化合物进行递送的量。在另一优选例中，所述安全有效量指的是满足以下一种或多种条件：(i)活性成分α-neta的浓度为1×10-4μmol/ml-1μmol/ml，优选为为5×10-4-0.8μmol/ml、6×10-4-0.6μmol/ml、8×10-4-0.5μmol/ml，更佳地，为1×10-3-0.1μmol/ml；(ii)应用于小鼠时，活性成分α-neta的单元剂量为0.01-1mg/kg/d；优选为0.02-0.08mg/kg/d，更佳地为0.03-0.05mg/kg/d；(iii)应用于人时，活性成分α-neta的单元剂量为0.001-0.1mg/kg/d；优选为0.002-0.008mg/kg/d，更佳地为0.003-0.005mg/kg/d。施用对象本发明药物组合物(诱导剂)可以施用于所需要的对象，所需要的对象包括待培养的细胞或哺乳动物。所述待培养的细胞优选有肿瘤细胞，尤其是上皮来源的肿瘤细胞，例如来源于下组一种或多种肿瘤的细胞：肺癌、甲状腺癌、肾癌、肾母细胞瘤、膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌、尿道癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、睾丸癌、阴茎癌、前列腺、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、小肠癌、结直肠癌、或肛门癌。所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物，非人哺乳动物包括常见的实验动物、陪伴动物或家畜；例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、羊、牛、或马等。在另一优选例中，所述的哺乳动物患有以下一种或多种疾病：肺癌、甲状腺癌、肾癌、肾母细胞瘤、膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌、尿道癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、睾丸癌、阴茎癌、前列腺、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、小肠癌、结直肠癌、或肛门癌。在另一优选例中，本发明药物组合物(诱导剂)也可施用于正常细胞或未患疾病的正常人或哺乳动物，从而用作对照或预防作用。制备方法在确定了本发明药物组合物(诱导剂)的活性成分以及活性成分的量后，本发明可通过常规技术手段将特定剂量的本发明活性成分与药学上可接受的载体进行混合(或结合)，从而制备本发明药物组合物(诱导剂)。一种典型的制备方法可以参考中国药典(2015)中对于制剂通则的记录。施用方法及应用本发明所述药物组合物(或诱导剂)可胃肠内给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。通常，非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、瘤内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。本发明药物组合物(诱导剂)优选胃肠内给药或注射给药。另一种优选的给药方式为瘤内注射给药。在进行体外或离体操作中，可以将特定浓度(或剂量)的本发明活性成分直接施用于待施用的细胞。或在特定浓度(或剂量)的本发明活性成分的存在下，对待培养的细胞进行培养，从而获得诱导细胞死亡和/或细胞死亡模型。此外，本发明药物组合为还可以通过靶向药物载体给药，例如小分子纳米颗粒，依靠epr效应，纳米颗粒会向肿瘤细胞聚集。主要载体有普通纳米颗粒，靶向定位纳米颗粒或磁性纳米颗粒。对于含有单元剂型的药盒，可根据需要向所需的对象每日施用所述的药盒。本发明还提供了治疗肿瘤的方法，包括诱导肿瘤细胞和/或杀死肿瘤细胞的方法，包括向所需的对象施用安全有效量的α-neta和/或其药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的肿瘤为恶性肿瘤。在另一优选例中，所述的肿瘤为上皮来源恶性肿瘤。在另一优选例中，所述的肿瘤为来源于消化道和/或泌尿生殖系统的恶性肿瘤。在另一优选例中，所述肿瘤包括以下一种或多种：肺癌、甲状腺癌、肾癌、肾母细胞瘤、膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌、尿道癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、睾丸癌、阴茎癌、前列腺、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、小肠癌、结直肠癌、或肛门癌。在另一优选例中，所述肿瘤是卵巢癌和/或肝癌。本发明有益效果1.本发明公开了chat抑制剂α-neta的新用途，用于直接诱导细胞死亡，从而可以用于快速杀死肿瘤，并且首次公开了α-neta可以在一定浓度范围内作为抗肿瘤药的药物剂型。2.本发明发现α-neta在用于肿瘤治疗时，所需的剂量极低，在该剂量下对正常生理功能无明显毒副作用。3.本发明发现α-neta可以诱导建立细胞焦亡模型，用于细胞焦亡研究。4.本发明发现α-neta杀死上皮性卵巢癌细胞后的分泌物中有il-18因子，可在肿瘤细胞治疗中发挥积极作用。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。通用方法i.实验试剂与仪器表1ii.实验方法1.细胞株与细胞培养上皮性卵巢癌细胞株:ho8910和ho8910pm细胞株购自atcc。moody，skov3和a2780从获自上海市第一人民医院。细胞培养液采用dmem(购自gibco)加10％fbs加1％双抗生素。培养条件：放置于5％co2，37℃恒温培养箱中进行培养。2.倒置显微镜图像获取实验步骤：2.1.在直径10cm培养皿中培养细胞(如肿瘤细胞)至融合度约90％左右。2.2.使用胰酶将所需观察细胞从直径10cm培养皿中分解下来，用含血清培养基配制细胞悬液，细胞悬液浓度约2×104-2×105/ml。2.3.取单孔直径4cm六孔板，将细胞培养液进行铺板，每孔2ml细胞悬液，铺板完毕后放置培养箱中进行培养24小时。2.4.24小时后取出六孔板，配制α-neta工作液，采用空白dmem培养基稀释α-neta母液至所需工作浓度。弃除六孔板内培养液，将六孔板分为上下两组，实验组与对照组。实验组采用α-neta工作液培养，对照组采用空白dmem加同样浓度α-neta溶媒培养。2.5.培养箱内培养24小时后取出六孔板。放于倒置显微镜下进行观察。2.6.每个孔内至少随机挑选三处视野拍照。3.wb检测实验步骤：3.1.采用凝胶试剂盒配制8-12％分离胶和5％浓缩胶，至少凝固三个小时以上。3.2.采用总蛋白提取试剂盒(含proteaseinhibitorcocktail)进行总蛋白的提取。3.3.每个孔60μg总蛋白进行上样，每孔10-15μl。3.4.电泳：浓缩胶60v电压，分离胶80v电压进行电泳2小时左右。3.5.pvdf膜甲醇中浸泡20秒，然后转移到tris-glycine转移缓冲液(含5％甲醇)中平衡至少5min；sds-page凝胶在tris-glycine转移缓冲液平衡至少30min；在冷却条件下以100v恒压全湿转膜2小时。3.6.转膜结束后，放到t-tbs(含5％脱脂奶粉或bsa)，室温封闭1小时，然后t-tbs漂洗，漂洗3次，每次5min。3.7.一抗以一定比例溶于t-tbs(含3％脱脂奶粉或bsa)，4℃冰箱孵育过夜；然后t-tbs漂洗4次，每次5min。表2：westernblot实验中的一抗信息一抗名称品牌及货号稀释度分子量(kda)pi3kabcamab867141:100085gsdmaabcamab1810271:100049cmklr1abcamab827731:50043gsdmdabcamab21007701:100053caspase1cst38661:200048.20pro-caspase3abcamab904371:100032caspase4abcamab1377301：100043β-arrestin2abcamab2069721：100046gapdhabcamab1816021:1000036β-actin(c4)(内参)santacruzsc-477781:1500433.8.二抗以一定比例溶于t-tbs(含2％脱脂奶粉)，室温1小时；然后t-tbs漂洗5次，每次5min。表3：westernblot实验中的二抗信息二抗名称品牌及货号稀释度羊抗鼠igg(h+l)二抗thermopierce货号：311601:5000羊抗兔igg(h+l)二抗thermopierce货号：312101:50003.9.采用持久性化学发光底物(westduraextendeddurationsubstrate，购自美国pierce公司)，按说明书操作，制备约1mlecl工作液，室温孵育转印膜1min，然后去除多余ecl试剂，保鲜膜密封，暗盒中放上x-rayfilm曝光5-10min后进行显影和定影。4.cck8(药物毒性试验)实验步骤：4.1.首先在大培养皿中培养细胞(如肿瘤细胞)至融合度约90％左右。4.2.采用胰酶消化细胞，含10％fbs培养液终止消化后，配制细胞悬液至合适浓度，约2×104-2×105左右。4.3.在96孔板中铺板，每孔100μl。将培养板在37℃，5％co2的培养箱预培养24小时。4.4.用dmem空白培养基配制α-neta药物浓度梯度液(5μg/ml,25μg/ml,12.5μg/ml，6.25μg/ml)，更换细胞培养液，加入药物浓度梯度液，每孔100μl。4.5.将培养板在培养箱孵育24小时。4.6.向每孔加入10μlcck8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响od值的读数)。4.7.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度，记录相关数据并统计作图。5.elisa实验对象：α-neta处理后的细胞上清液。实验步骤：5.1.试剂准备：取处理后的细胞上清，300g离心10分钟去除沉淀物，分装，放-80度冰箱备用。准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品，检测前将所有样本温度恢复至室温。5.2.打开检测板，加入300μl1×(1倍倍比)洗液静置浸泡30秒。弃掉洗液后，在吸水纸上将微孔板拍干。5.3.标准品孔加入100μl2倍倍比稀释的标准品，取两个标准品重复孔。空白孔加入100μl1×检测缓冲液。5.4.样本孔加入50μl1×检测缓冲液和50μl样本，每个孔取三个重复孔。5.5.每孔加入50μl刚刚稀释过的检测抗体。5.6.使用试剂盒封板膜进行封板。300转/分钟震荡，室温下孵育2小时。5.7.弃掉孔内液体，每孔加入300μl洗液进行洗板，洗涤6次。每次洗板后，在吸水纸上尽量拍干。5.8.每孔加入100μl刚刚稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。5.9.使用新的封板模封板。摇床上300转/分钟震荡，室温孵育45分钟。5.10.重复步骤5.7。5.11.每孔加入100μl显色底物tmb，避光，室温孵育5-30分钟。5.12.每孔加入100μl终止液。可见颜色由蓝色变为黄色。5.13.30分钟内使用酶标仪进行波长检测，测定450nm最大吸收波长od值。5.14.记录相应数据后续进行统计分析作图。6.流式细胞术实验对象：α-neta处理后的肿瘤细胞以及经过gsdmd，caspase4基因的si-rna敲减后的相应细胞。实验步骤：6.1.使用六孔板，配制细胞悬液，尽量保持细胞密度约70％，放培养箱(37℃，5％co2。6.2.24小时后取出六孔板，根据ic50使用空白dmem稀释α-neta母液，实验组三孔更换加入药物的空白培养液，使用空白培养基设立三孔对照组。6.3.放回培养箱内孵育24小时。6.4.分别取两组细胞上清，装入15ml离心管。向六孔板内加入无edta胰酶消化贴壁细胞，细胞脱落之后用含10％pbs的培养基终止消化，缓慢吹打，各自加入对应离心管。6.5.300g×3分钟离心两组细胞。使用冷却pbs洗涤细胞两次，然后使用1×结合缓冲液将细胞配成悬液。将ep管标记并分装离心管内悬液。6.6.表4：按以下设计加入annexinv与核酸染料管号名称染料1阴性对照--2单阳1av-fitc—3单阳2—pi4样本av-fitcpi6.7.轻轻混匀，室温避光放置15分钟。6.8.将ep管放冰盒后1小时内上机操作检测。6.9.记录相应数据后统计分析作图。7.透射电镜观察实验对象：经过α-neta处理后的肿瘤细胞。实验步骤：7.1.贴壁细胞，倒去培养液，加入2.5％戊二醛，室温下固定2小时，用细胞刮刮下，离心收集细胞沉淀。7.2.将用戊二醛固定的细胞或组织，浸入pbs(0.1mol/l)中，漂洗3次，离心去上清，每次20min，再用4℃预冷的1％锇酸，在4℃固定2-3小时，然后用pbs(0.1mol/l)浸洗3次，每次20min。7.3.用系列梯度酒精(50％、70％、80％、85％、90％、95％、100％)脱水，每种浓度酒精通过1次，每次10-20min(一般15min)，再用100％酒精彻底脱水2次，每次10min。7.4.渗透剂依次为丙酮：环氧树脂(2：1)、丙酮：环氧树脂(1：1)、环氧树脂，每次渗透过夜12h，37度温箱。7.5.将渗透过的样品放入小胶囊中，加入包埋剂环氧树脂，需要定向的样品放入包埋板中进行，固化48h，60度温箱孵育。7.6.固化之后将样品进行修块，修成合适的大小和形状，置于切片机上切片，厚度约为60-100nm，铅和铀双染色后即可在电镜下面观察。8.瞬时转染实验步骤：根据制造商的建议程序，通过使用lipofectamine3000(invitrogen，grandisland，ny)瞬时转染细胞。8.1.配制细胞(如肿瘤细胞)悬液，将细胞以2×104个细胞/孔的密度接种到6孔板中，将细胞培养至60％-70％融合度。8.2.将细胞血清饥饿24小时以使fbs的影响最小化。8.3.通过使用lipofectamine3000用sirna转染细胞。8.4.孵育6-8小时后，将细胞在含有10％fbs的dmem/f-12中培养。gsdmd/caspase4和阴性对照sirna由ribobio(中国广州)构建。gsdmd/caspase4sirna的靶序列如下：genofftmst-h-gsdmd：gtgtcaacctgtctatcaa(seqidno:1)；genofftmst-h-caspase4：gcacaatgggctctatctt(seqidno:2)。9.体内动物实验实验步骤：动物实验得到上海市第一人民医院伦理委员会的批准。取15只雌性免疫缺陷裸鼠(balb/c)用于异种移植研究。每5只小鼠圈养在一个笼子中，每天12小时昼夜交换模式，可以随意获取食物和无菌水，尽量使小鼠生存环境更像是房子或巢穴。9.1.将α-neta溶于99.5％甲醇(上海世益化学品有限公司，中国)，用opti-mem(gibco31985070，usa)处理溶液为12.5μg/ml。9.2.使用pbs配制肿瘤细胞悬液，每只小鼠皮下(s.c.)在左腋窝注射1x107肿瘤细胞(如ho8910)细胞。9.3.称重小鼠并每隔一天测量肿瘤。肿瘤体积用以下形式进行计算：瘤体积(ml)＝长×(宽)2×0.5。9.4.两周后，将15只动物分成三组，随机分组(对照组，实验组1和实验组2)。当肿瘤达到≥0.15ml的体积时，用药物治疗小鼠。在实验组1(n＝5)中，每只小鼠每天注射50μlα-neta工作溶液(浓度为12.5μg/ml)，对照组(n＝5)皮下注射与实验组相同浓度的载体液体。实验组2(n＝5)在一周前以与对照组相同的方式进行治疗，并且在一周后进行相同的治疗。9.5.根据伦理准则，当肿瘤达到2ml体积或直径超过2cm时，处死动物，然后切除肿瘤。将肿瘤在冰箱中于-80℃冷冻。密切监测小鼠的体重减轻和其他毒性迹象。通过kruskal-wallis检验将三组的统计学(肿瘤体积，肿瘤重量和小鼠体重)用于比较分析。iii.统计学方法使用spss和graphpadprism软件进行统计分析和制作图表。数据表示使用平均值±标准偏差(sd)。通过使用t检验评估测试组和对照组之间的差异性。用kruskal-wallis检验评估多组间的统计学意义。p值<0.05被认为具有统计学意义。实施例1ɑ-neta导致卵巢癌细胞死亡将ɑ-neta充分溶解后置于ep管中放于4度冰箱备用。母液浓度为25mg/ml。分别用不同浓度ɑ-neta(0、0.25ug/ml、0.5ug/ml、0.75ug/ml、10ug/ml、12.5ug/ml)处理skov3，在倒置显微镜下观察如图所示(图1a)(放大倍数10倍物镜)。使用cck8方法对ho8910、ho8910pm、a2780细胞株进行了细胞毒性测定(图1c)。同时，进行了ic50计算(图1c)(1μmolɑ-neta＝369.24mg；1mgɑ-neta＝2.7μmol)。使用浓度12.5ug/ml(3.38×10-2μmol/ml换算值)的ɑ-neta的空白培养液处理ho891024小时后(同样浓度不含药物溶媒作为对照组)，使用流式细胞术进行死亡率测定(图1b)。三次独立重复实验，对数据结果进行统计分析，如图所示(图1b)(p<0.01)。其中，图1a显示了ɑ-neta在浓度0-12.5μg/ml(0-3.38*10-2μmol/ml)范围内死亡程度与浓度呈正相关。图1b显示了经ɑ-neta处理的细胞再48小时后，细胞死亡率达到了72.1％，而对照组为4.8％。图1c显示了ɑ-neta对多种细胞株的ic50值都极低。实施例2ɑ-neta可引起卵巢癌细胞膜起泡及细胞质外泄ho8910经过浓度12.5μg/mlɑ-neta处理24小时后，在倒置显微镜下观察(40倍物镜)，阴性处理组作对照，如图(图2a)。可以看到在黑色方框内细胞死亡相关的大泡(图2a)，在结合荧光显微镜下同时观察到了与细胞焦亡后期相关的“煎蛋样”表现(图2b)。使用透射电镜对其进行了更加细微地观察，正常卵巢癌细胞作为对照如图(图2c)黑色箭头标注所示(放大倍数5000倍)，可以看到细胞膜破裂，线粒体肿胀，内质网囊泡化扩张。实施例3ɑ-neta可导致卵巢癌细胞分泌il-18本实验使用elisa试剂盒对ɑ-neta处理后的a2780的细胞上清进行了il-18的检测。首先，使用il-18标准品(购自中国联科)进行标准曲线的建立(公式y＝1396.6x^2+1620.1x+128.73,r^2＝0.9949)。把ɑ-neta处理后的a2780的细胞上清作为处理组，相同浓度溶媒处理后的细胞上清作为对照组。结果表明，处理组中有il-18分泌(p<0.01)(图3a)。通过计算，ɑ-neta浓度约25μg/ml(6.75*10-2μmol/ml)处理后的a2780细胞上清中il-18浓度约为293.6pg/ml。实施例4.ɑ-neta刺激卵巢癌细胞后，gsdmd,caspase4表达升高对ɑ-neta处理后的细胞蛋白进行了细胞死亡相关通路蛋白的检测。使用wb方法，将ɑ-neta处理后的ho8910pm作为实验组，将相同浓度溶媒处理后的ho8910pm作为对照组。结果表明，与对照组相比，处理组的caspase4表达升高(图3b)(p<0.05)，gsdmd表达也升高(图3b)(p<0.05)，有统计学意义。其它细胞通路，pi3k表达无差异性，无统计学意义。根据目前现有检测结果，推测ɑ-neta可能是通过gsdmd/caspase4相关通路诱导卵巢癌细胞死亡，如模型图所示(图4)。推测通路：(1)ɑ-neta处理卵巢癌细胞后促进b-arrestin2表达增高(2)激活caspase4(具体机制尚不清楚)。(3)caspase4的激活导致其下游效应器gssdmd的激活，caspase4剪切gsdmd形成gsdmd-n端。(4)gsdmd-n端在细胞膜内进行膜上打孔，导致细胞膜破裂。(5)同时，caspse4对il-18前体进行活化，导致成熟il-18通过细胞膜上的裂孔分泌出来。由此完成整个细胞死亡过程。实施例5体内移植瘤实验balb/c裸鼠(总共15只，雌性)获自第一人民医院的动物模型研究中心。所有实验均按照上海交通大学伦理委员会制定的指导方针进行。将小鼠每笼饲养5只，在温控、12/12小时光暗循环的自然光照条件下自由取水和饮食。将每只小鼠皮下(s.c.)注射左腋窝浓度为1×107/ml的ho8910细胞80μl。两周后，将15只动物分成三组，随机分组。一组(n＝5)每天用ɑ-neta(12.5μg/ml即3.38*10-2μmol/ml)肿瘤内注射约两周。一组(n＝5)治疗一周，最后一组(n＝5)用相同的pbs注射但不进行ɑ-neta治疗作为对照组，具体实施过程见图5a。然后当肿瘤达到2ml体积或直径超过2cm时处死小鼠，并在切除后将肿瘤在冰箱中于-80℃冷冻。通过kruskal-wallis检验将三组的统计学(肿瘤体积、肿瘤重量)进行比较分析。实验结果：ɑ-neta可缩小肿瘤体积为了检查ɑ-neta是否也具有体内杀灭肿瘤的作用，使用源自ho8910细胞的皮下成瘤的balb/c异种移植模型。如图5b所示，通过瘤内注射施用ɑ-neta。与对照组相比(图5b)，用ɑ-neta处理的肿瘤体积(p＝0.007)显著缩小，肿瘤重量(p＝0.004)显着减少。这些结果表明低浓度、低剂量的ɑ-neta在体内具有杀灭肿瘤的效力。药物处理小鼠未有小鼠死亡现象发生，处理组小鼠体重无明显改变。实施例7α-neta对其他癌症细胞的杀灭作用为了验证α-neta对其他癌症细胞的杀灭作用，取消化道细胞系以及泌尿生殖细胞系重复实施例1-2的步骤，并测定其对癌症细胞的杀灭作用。表5α-neta对其他癌症细胞的杀灭作用从表5可见，α-neta对于多种上皮来源的癌症，例如消化道、呼吸道、泌尿生殖系统或内分泌腺体器官来源的癌症均具有直接杀灭效果，其ic50值极低。本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>乔,联桥席,晓薇<120>α-neta在诱导细胞死亡中的应用<130>p190117-1cncna5<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>小鼠(musmusculus)<400>1gtgtcaacctgtctatcaa19<210>2<211>19<212>dna<213>小鼠(musmusculus)<400>2gcacaatgggctctatctt19当前第1页12