淫羊藿总黄酮提取物在制备防治桥本甲状腺炎的药物或保健品中的应用的制作方法

本发明涉及一种中药新用途，特别涉及一种淫羊藿总黄酮提取物在制备防治桥本甲状腺炎的药物或保健品中的应用，属于中医药
技术领域：
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背景技术：
：桥本甲状腺炎(hashimotothyroiditis)亦称慢性淋巴细胞性甲状腺炎，是一种以自身甲状腺组织为抗原的慢性自身免疫性疾病。因由日本九州大学Hashimoto根据组织学特征首先报道,故又命名为桥本甲状腺炎，为临床中最常见的甲状腺炎症。多见于中年女性，好发年龄为40～50岁。儿童中也有不少病例。目前，西医治疗本病主要是采用甲状腺素代替治疗法、免疫治疗法及手术等治疗手段来缓解甲状腺局部症状，但对患者的全身症状疗效不佳。其中，最常规疗法为激素替代疗法，而激素没有免疫调节作用，不能降低甲状腺自身抗体滴度，并且患者需要终身服药。其次，患者需要不断的体检，根据甲状腺功能的指标调整服用激素的剂量，不良反应多，停药易反复。因此，寻求新的桥本甲状腺炎有效的药物具有明显的社会和经济价值。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种淫羊藿总黄酮提取物在制备防治桥本甲状腺炎的药物或保健品中的应用。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种淫羊藿总黄酮提取物在制备防治桥本甲状腺炎的药物或保健品中的应用。药理研究表明，发明人用淫羊藿总黄酮提取物预防和治疗桥本甲状腺炎，取得了满意的效果，发现了淫羊藿总黄酮提取物的新用途。本发明淫羊藿总黄酮提取物是根据本领域的常规方法从中药淫羊藿中提取纯化。所述的提取加工工艺，可以使用现有技术公知的中药黄酮提取方法进行制备，例如但不限于冷浸、渗漉、超声波、索氏提取、热回流提取、超临界萃取等，以及进行组合如冷浸-渗漉，冷浸-超声波，冷浸-索氏提取，冷浸-热回流提取等提取方法。所述淫羊藿总黄酮提取物的纯化主要根据公知中药黄酮纯化方法，例如但不限于柱层析、溶剂萃取、固相萃取、离子交换等方法。作为优选，所述防治桥本甲状腺炎的药物或保健品是以淫羊藿总黄酮提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。本发明所述淫羊藿总黄酮提取物可以直接或与药学上可接受的药物载体按本领域的常规方法制成各种中药内服常规药剂用于预防和治疗桥本甲状腺炎中。所述的药物制剂形式可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂；优选口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。所述的口服剂型可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适宜的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠等。经动物实验结果证明，本发明淫羊藿总黄酮提取物对桥本甲状腺炎大鼠具有明显的治疗桥本甲状腺炎的作用；淫羊藿总黄酮提取物安全性好，疗效佳，能有效地治疗桥本甲状腺炎。该淫羊藿总黄酮提取物是一种改善临床症状效果好，毒副作用小，具有良好的临床应用前景的中药提取物。附图说明图1是HE染色观察桥本甲状腺炎模型大鼠甲状腺病理学照片(HE染色，200倍)；图2是HE染色观察桥本甲状腺炎模型大鼠甲状腺病理学照片(HE染色，400倍)；图3是淫羊藿总黄酮提取物对HT大鼠血清中FT3，FT4，TOP-Ab，ATGA，T3和T4的含量的影响曲线(x±s，n＝6)；图4是淫羊藿总黄酮提取物对HT大鼠血清中IFN-γ，IL-17，IL-6，IL-10，IL-23和TGF-β的含量的影响曲线(x±s，n＝6)；图5是各组大鼠外周血Treg细胞流式散点图，注：A空白对照组；B模型组；C淫羊藿总黄酮提取物低剂量组；D淫羊藿总黄酮提取物中剂量组；E淫羊藿总黄酮提取物高剂量组；F左旋甲状腺素钠片阳性药组；图6是各组大鼠外周血Th17细胞流式散点图，注：A空白对照组；B模型组；C淫羊藿总黄酮提取物低剂量组；D淫羊藿总黄酮提取物中剂量组；E淫羊藿总黄酮提取物高剂量组；F左旋甲状腺素钠片阳性药组；图7是淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织FoxP3表达照片(n＝6，×200倍)；图8是淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织FoxP3表达照片(n＝6，×400倍)；图9是淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织RORγt表达照片(n＝6，×200倍)；图10是淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织RORγt表达照片(n＝6，×400倍)；图11是淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IL-17表达照片(n＝6，×200倍)；图12是淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IL-17表达照片(n＝6，×400倍)；图13是淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IL-23表达照片(n＝6，×200倍)；图14是淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IL-23表达照片(n＝6，×400倍)；图15是淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IL-6表达照片(n＝6，×200倍)；图16是淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IL-6表达照片(n＝6，×400倍)；图17是淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IL-10表达照片(n＝6，×200倍)；图18是淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IL-10表达照片(n＝6，×400倍)；图19是淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IFN-γ表达照片(n＝6，×200倍)；图20是淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IFN-γ表达照片(n＝6，×400倍)；图21是大鼠甲状腺相关基因相对表达量统计曲线图22是大鼠甲状腺相关蛋白表达图图23是大鼠甲状腺相关蛋白相对表达情况统计曲线图24是大鼠甲状腺原代细胞照片(100×)；图25是含药血清对大鼠甲状腺细胞活性照片，注：A空白对照组；B模型组；C淫羊藿黄酮低剂量组；D淫羊藿黄酮中剂量组；E淫羊藿黄酮高剂量组；F左旋甲状腺素钠片阳性药组；图3，图4，图21，图23，注:与正常组比较，▲P<0.05,▲▲P<0.01；与模型组比较：★P＜0.05，★★P＜0.01。具体实施方式下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。以下实施例用到的主要试剂来源如下：实施例1本发明淫羊藿总黄酮提取物对桥本甲状腺炎大鼠的疗效作用淫羊藿总黄酮提取物的制备：炙淫羊藿：取淫羊藿原药材，除去杂质，摘取叶片，喷淋清水，稍润，切丝，干燥。取炼羊脂油加热熔化，加入淫羊藿丝，文火炒至表面显均匀的油亮光泽，呈微黄色时，取出，放凉。淫羊藿每100kg用炼羊脂油20kg。总黄酮提取物的制备：取炙淫羊藿适量，分别加70％乙醇，10倍量，提取2次，每次2h。将药液浓缩至1mL药液含1g生药，采用HPD300大孔树脂纯化淫羊藿总苷的工艺通过考察确定为：药液加水稀释成每1mL药液含0.1g生药，以4BV/h流速通过HPD300大孔吸附树脂柱(树脂柱径高比为1:11)，先5倍柱体积水洗，继以7倍柱体积50％乙醇洗脱，洗脱流速为4BV/h，收集洗脱液，减压回收乙醇，滤过，滤液加3％明胶溶液至不产生沉淀，加乙醇使含醇量达80％，放置过夜，滤过，减压回收乙醇，制得到淫羊藿总黄酮提取物(淫羊藿总苷含量约80％)。1实验目的1.HE染色观察桥本甲状腺炎模型大鼠甲状腺病理学改变；2.ELISA检测大鼠血清中FT3，FT4，TOP-Ab，ATGA，T3，IFN-γ，IL-17，IL-6，IL-10，IL-23和TGF-β和T4的水平；3.淫羊藿总黄酮提取物对HT大鼠外周血中Treg、Th17细胞影响；4.免疫组化观察桥本甲状腺炎模型大鼠甲状腺中FoxP3、RORγt、IL-17、IL-23、IL-6、IL-10和IFN-γ的表达；5.qRT-PCR检测大鼠甲状腺FoxP3、RORγt、TGF-β1、IL-17、IL-23、IL-6、IL-10和IFN-γ基因相对表达量；6.WB检测大鼠甲状腺FoxP3、RORγt、TGF-β1、IL-17、IL-23、IL-6、IL-10和IFN-γ蛋白表达情况；7.葡聚糖硫酸钠(DSS)致大鼠甲状腺上皮细胞损伤模型建立；8.药物处理及细胞增殖检测；9.大鼠甲状腺上皮细胞增殖及毒性检测；10.AnnexinV-FITC/PI法检测含药血清对细胞凋亡的影响。2实验方法2.1动物模型制备及分组给药SPF级雌性wistar大鼠，体重150-180g。由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(沪)2013-0016。饲养条件：恒温，温度22±2℃，湿度50％-60％，光照每12小时明暗交替，换风次数15-20次/小时。由浙江中医药大学动物实验研究中心饲养。实验饲养室许可证号SYXK(浙)2013-0184。取60只大鼠，适应性培养一周，按照如下分组进行处理：小鼠分为6组，每组10只，共60只：A空白对照组B模型组C淫羊藿总黄酮提取物高剂量组(240mg/kg)D淫羊藿总黄酮提取物中剂量组(120mg/kg)E淫羊藿总黄酮提取物低剂量组(60mg/kg)F阳性药组给药剂量A组给予0.4ml生理盐水，每天一次，连续14天。B组给予0.4ml生理盐水，每天一次，连续14天。C组给予240mg/kg的淫羊藿总黄酮提取物溶液，每天一次，连续14天。D组给予120mg/kg的淫羊藿总黄酮提取物溶液，每天一次，连续14天。(给药剂量：400mg/kg)E组给予60mg/kg的淫羊藿总黄酮提取物溶液，每天一次，连续14天。F组给予左旋甲状腺素钠片治疗，10μg/次，1次/d连续14天。2.2裸鼠模型制备1)初次免疫：大鼠适应性喂养1周，将制备好的甲状腺球蛋白PTG抗原用生理盐水溶解后与完全弗氏佐剂佐剂按1:1混合，终浓度为每毫升含佐剂抗原0.25mgPTg用PBS缓冲液溶解成PTg含量为1mg/mL的溶液，与完全弗氏佐剂CFA等体积混合充分乳化，首次剂量为100μg/只，在大鼠背部皮下注射。正常对照组大鼠不做任何处理。2)加强免疫：将上述PTg的PBS溶液和IFA等体积混合充分乳化，剂量为100μg/只，于初次免疫后的第2周起，每周加强免疫一次，分别在大鼠脚趾、背部等处作多点皮下注射至第6周结束。2.3HE染色观察移植肺癌细胞裸鼠肿瘤改变检测时间点：模型制备6周后解剖大鼠，取甲状腺组织放入10％中性甲醛固定，取材包埋切片。1)切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至蒸馏水洗：二甲苯(I)5min→二甲苯(II)5min2)无水乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇lmin→75％乙醇lmin→蒸馏水洗2min3)苏木素染色5min，自来水冲洗5min4)盐酸乙醇分化30s5)自来水浸泡15min6)置伊红液2min，自来水冲洗7)常规脱水，透明，封片：95％乙醇(I)1min→95％乙醇(II)3min→无水乙醇(I)5min→无水乙醇(II)5min→二甲苯(I)透明5min→二甲苯(II)透明5min→中性树脂封固8)图像采集和分析：通过显微镜拍照(200倍和400倍镜下观察)，采集分析样本相关部位。2.4ELISA检测大鼠血清FT3，FT4，TOP-Ab，ATGA，T3，T4，IFN-γ，IL-17，IL-6，IL-10，IL-23和TGF-β的水平检测时间点：于给药2周后，空腹禁食12h(不禁水)，心脏取血，静置30min后，3000r/min离心10min，制备血清备用。(1)准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡20min。(2)配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。(3)加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍)；空白对照孔不加。(4)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL。(5)温育：用封版膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。(6)洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。(7)显色：每孔先加入显色剂A液50μL，再加入显色剂B液50μL，平板混匀器混匀30s(或用手轻轻震荡混匀30s)，37℃避光显色15min。(8)终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应。(9)测定：以空白孔调零，在终止后15min内，用450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)。2.5淫羊藿总黄酮提取物对HT大鼠外周血中Treg细胞影响给药3天后，取各组大鼠外周血每只100μL注入试管中，每管注入25μL肝素钠溶液，然后各管中分别加入CD4-FITC(5μg/mL)、CD25-ApC(2μg/ml)各10μl，放入4℃冰箱中孵育20min，取出各管加入红细胞裂解液各2ml，充分混合(37℃下5min)，然后离心(1500r/min)5min，弃上清，Hanks洗涤2次，加入20μLPE-Foxp3，4℃孵育50min，避光。PermBuffer(200μL)清洗两次，接着用400μLHanks缓冲液重悬。在各管中取400μL上机终体积(上机终浓度5×106个细胞)重悬细胞注入标记好的流式管重悬于Hanks液中，在各管中取100μL重悬细胞注入标记好的流式管中，上流式检测各组大鼠外周血中Treg数量的变化。2.6淫羊藿总黄酮提取物对HT大鼠外周血中Th17细胞的影响给药3天后，取新鲜肝素抗凝血100μL，加入860μL，IRPMI1640培养基混匀，再加人10μLIPMA工作液，10μLIonomycin工作液，20μLBFA工作液，体系中PMA、Ionomycin、BFA浓度分别为50ng/mL，750ng/mL，10μL/mL。在37℃，5％CO2培养箱中刺激培养3h；将培养后的细胞悬液轻轻混匀，加入1个流式试管中，离心；弃上清，振荡混匀，加人2μLFITC-Antirat-CD4，避光孵育15min；加100μL固定液，避光放置15min；加2mL1×PBS洗涤，离心；弃上清，振荡混匀，加100μL破膜剂，避免振荡，轻轻混匀，避光5min；管中再加入2μLPE-Antirat-IL-17，轻轻混匀，避光孵育15min；加2mL1×PBS洗涤一次，离心，弃上清，上流式细胞仪检测。2.7免疫组化观察桥本甲状腺炎模型大鼠甲状腺中FoxP3、RORγt、IL-17、IL-23、IL-6、IL-10和IFN-γ的表达。石蜡切片经60℃烘片1小时，经二甲苯脱蜡(二甲苯I10min，二甲苯II10min)、梯度酒精(100％3min，100％3min，95％3min，90％3min，85％3min，75％3min，蒸馏水3min，蒸馏水3min，PBS3min)。抗原修复：将切片置于0.1mol/L且PH＝6.0的枸橼酸液修复液中，用微波炉100火力三分钟至微微沸腾，再用50火力维持7分钟，停止加热后自然冷却20-30分钟。用PBS漂洗5min×3/次。免疫杂交：3％H2O2孵育10分钟以消除内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗，5分钟×3次。滴加封闭液(5％BSA)，在湿盒中室温30分钟。用滤纸擦去封闭液，勿洗。滴加适宜浓度的FoxP3、RORγt、IL-17、IL-23、IL-6、IL-10和IFN-γ一抗置湿盒中4℃孵育过夜，再用PBS5分钟×3次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS。滴加生物素化二抗工作液，室温置湿盒中孵育20分钟，用PBS5分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温置湿盒中孵育20分钟，用PBS5分钟×3次洗去，用滤纸擦去标本外的PBS。DAB显色剂显色，自来水充分冲洗。再进行苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。切片在10×20倍和10×40倍显微镜下随机选取甲状腺不重复6个视野。2.8qRT-PCR检测大鼠甲状腺FoxP3、RORγt、TGF-β1、IL-17、IL-23、IL-6、IL-10和IFN-γ基因相对表达量qRT-PCR所用引物序列信息如下：RNA提取1)样本处理：将甲状腺组织(每200mg加1ml)和甲状腺上皮细胞(每1×107个细胞加1ml)放入Trizol的匀浆管中，将裂解后样品室温放置5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离。2)置于超净台中，温育5min，12000rpm，离心10min。3)吸上清于新的1.5mL离心管中，加入200μL的氯仿，摇匀，室温静置2min，4℃，12000rpm，离心10min。4)吸取上清于新的1.5mL离心管中，加入600μL的异丙醇，混合均匀，室温静置15min，4℃，12000rpm，离心15min，弃上清。5)加入1mL75％的无水乙醇(750μL无水乙醇和250μLDEPC水)漂洗沉淀，4℃，12000rpm，离心5min，弃上清。6)加入1mL无水乙醇，漂洗沉淀，4℃，12000rpm，离心5min，弃上清，室温干燥10min。7)加入40μL的DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存备用。逆转录反应配制以下反应体系进行逆转录反应。反应条件：42℃，15min；85℃，5min。qPCR反应1)配制以下反应体系进行实时荧光定量PCR反应。用漩涡振荡器将管中溶液彻底混合均匀，短暂低速离心。反应条件：95℃，10min变性；95℃，15s；60℃，60s；40次循环。2)点样：将步骤(1)中混合好的液体加入孔板中，每个样本的每个基因保证3个复孔。3)PCR反应：RealtimePCR仪使用bio-red实时荧光定量PCR仪，PCR程序已优化。将步骤(2)中已点好样的96孔板板置于RealtimePCR仪上进行PCR反应。4)反应条件：95℃，10min变性；95℃，15s；60℃，60s；40次循环。2.9WB检测大鼠甲状腺FoxP3、RORγt、TGF-β1、IL-17、IL-23、IL-6、IL-10和IFN-γ蛋白表达情况蛋白样品制备1)将甲状腺组织(每200mg加1ml)和甲状腺上皮细胞(每1×107个细胞加1ml)RIPA裂解液(含PMSF和蛋白酶抑制剂)，采用手动匀浆器研磨。置于冰上裂解30min；2)12000rpm离心5min，取上清。药物处理后组织的总蛋白浓度测定(BCA法)1)BCA蛋白浓度测定试剂盒SolarbioCatpc00202)96测板Costow35993)BCA试剂：Cu试剂：50:1体积比，配制8ml，配制成BCA工作液；4)标准品15μL，用PBS稀释至150μL，配制浓度为0.5mg/ml；5)将样品稀释为2倍和8倍，加20μL到96孔板；6)加200μLBCA工作液，37℃20分钟，用酶标仪A562nm波长测定。SDS-PAGE电泳和转膜1)取干净的1.5mm玻璃板，按说明书在制胶架上装好。2)配制10％分离胶和5％浓缩胶加入各物质后充分混匀，灌分离胶，然后用水液封。加入各物质后混匀，灌浓缩胶。3)配制好5％浓度的的SDS-PAGE浓缩胶并注入分离胶的上端，小心插入与玻璃板厚度相适应的样品梳子，避免产生气泡。4)成层胶聚合后，小心拔去样品梳子，然后加入1×Tris-Gly的电泳缓冲液。5)吸取适量样品上清加入样品孔中，在样品旁的孔中加入预染的蛋白Marker，未添加样品上清的孔中，加入1×SDS上样缓冲液保持胶面平衡。6)打开电源，电压开始设置为80V，当蛋白样品进入分离胶后，电压可提高到120V。参照预染Marker的位置，待目的条带进入凝胶最佳分离区(大约凝胶的2/3)时，停止电泳。7)预先将转膜液4℃预冷。8)在托盘上打开转移盒，靠近阴极侧的内面铺上已经用转膜缓冲液浸湿的有孔维垫，其上放三层浸有转膜缓冲液的滤纸，注意排净气泡。9)小心撬开玻璃板，将胶放置含有转膜液的托盘内，将含有目的条带的分离胶切下，用转膜液浸泡后置于滤纸上。10)在凝胶上铺上经甲醇和转膜液浸湿的PVDF膜，胶和膜之间不能存有气泡，膜、滤纸和凝胶的大小，大致相同。11)在PVDF膜上再放三层浸过转膜液的滤纸，注意排净气泡。12)放上第二块海绵垫，使整个转印夹层依次形成“纤维垫—滤纸—凝胶—NC膜—滤纸—纤维垫”层次，关闭转印夹，放入转移槽中，槽中灌满转膜液。13)打开电源，稳流200mA，120min。14)转膜结束后，取出PVDF膜并作好标记，用TBST洗膜10min×3次。免疫印迹封闭及抗原抗体反应1)封闭：将PVDF膜放入孵育盒中，加入含5％脱脂奶粉的封闭液，摇床振荡1.5～2h；2)封闭结束后，用TBST洗膜10min×3次；3)将膜放入含一抗稀释液Anti-IL17A(1:1000)；Anti-IL6(1:50)；Anti-IL23(1:2000)；Anti-INFγ(1:1000)；Anti-RORγt(1:2000)；Anti-Foxp3(1:2000)；GAPDH(1:1000)的孵育盒中，4℃摇床振荡孵育过夜；4)第二天取出，室温振荡30min，吸弃一抗，TBST洗10min×3次；5)用5％脱脂奶粉封闭液稀释二抗，室温摇床振荡反应1～2h；6)二抗反应结束后，回收二抗。然后用TBST洗膜5～10min×3次。暗室中用X胶片感光、显影、定影1)将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。2)在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm)；3)打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；4)曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min(20～25℃)，温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间；5)显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。2.10IL-23对HT大鼠外周血单个核细胞分泌IL-17及IFN-γ的影响(6组*3只*2指标*2时间点)给药前后，取大鼠外周血，分离外周血单个核细胞后，两个细胞培养皿中各加入1mL细胞悬液(细胞浓度约为2×106个/mL)，其中1个加入5μLIL-23(50ng/mL)充分混匀，另1个不加并清楚标记。37℃、5％CO2无菌培养箱培养72小时。收集培养上清液，加和不加IL-23的上清分别各装于2个无菌EP管中，-20℃冻存备用。采用ELISA试剂盒检测培养上清液的IL-17、IFN-γ含量。2.11大鼠甲状腺上皮细胞悬液的制备1.取正常SD大鼠的甲状腺上皮组织，立即用37℃含青、链霉素的Hank’s液反复洗刷5次，洗净血液和其他附着的物质。2.将组织放入含青、链霉素的PBS溶液的培养皿中，用眼科剪剔净脂肪结缔组织，分离出甲状腺上皮组织。3.将甲状腺上皮组织放入另一无菌培养皿中，再次用含双抗的PBS冲洗3次后，移入无菌的含双抗溶液瓶中，将甲状腺上皮组织剪成1-2mm大小的碎块，整个操作过程中标本要浸泡于PBS中。4.将剪碎后组织块经无菌70μm细胞筛过滤，并用PBS反复冲洗，以尽量去除混有的血液细胞和小的脂肪细胞。5.收集小碎块组织放入一无菌培养皿中，加入0.2％胶原酶II完全覆盖剪碎的滑膜组织，置于37度细胞培养箱中孵育2.5h，加入0.25％胰蛋白酶，培养箱孵育0.5h。6.加入含10％FBS的培养基终止消化，将消化后的小组织块经70um细胞筛过滤，反复用PBS淋洗小组织块。用PBS冲洗附着于滤器及皿底的细胞，过滤液移入10ml无菌离心管。1000rpm离心，弃上清，取沉淀。(中间可用PBS重悬离心3次，尽量降低胰酶浓度)7.用含10％FBS的1640重悬，计数并种于培养瓶中。3-4天进行培养基换液。8.利用有限稀释单克隆培养法使纯化。9.将细胞分为5组：分别为正常对照组、模型对照组、淫羊藿总黄酮提取物低剂量、淫羊藿总黄酮提取物中剂量、淫羊藿总黄酮提取物高剂量组。用台盼蓝液计数活细胞。2.12葡聚糖硫酸钠(DSS)致大鼠甲状腺上皮细胞损伤模型建立大鼠甲状腺上皮细胞培养至对数生长期后，全量换液，分别加入1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml五种不同浓度的葡聚糖硫酸钠(DSS)，给药时间作用12-72h(12、24、36、72h)。全量换液后继续培养24h。采用CCK-8比色法检测上皮细胞生长情况，以确定葡聚糖硫酸钠(DSS)液损伤的最佳浓度和最佳给药时间。细胞活力＝(加药细胞OD-空白组OD/对照细胞-空白组OD)*100％。2.13大鼠甲状腺上皮细胞增殖及毒性检测采用CCK-8比色法检测淫羊藿总黄酮提取物含药血清，对正常大鼠甲状腺上皮细胞增殖的影响，采用LDH检测试剂盒检测淫羊藿总黄酮提取物含药血清对大鼠甲状腺上皮细胞毒性的影响。2.14药物处理及细胞增殖检测取对数生长期的大鼠甲状腺上皮细胞，第一组加入最佳浓度和的淫羊藿总黄酮提取物含药血清共孵育最佳作用时间，然后加入最佳浓度的DSS液共孵育最佳时间；第二组加入10％正常胎牛血清，然后加入最佳浓度的DSS液共孵育最佳时间(根据的实验结果确定)；第三组细胞正常培养，不做处理。采用CCK-8检测细胞增殖情况。2.15AnnexinV-FITC/PI法检测含药血清对细胞凋亡的影响各组(正常对照组、模型对照组、淫羊藿总黄酮提取物低剂量组、淫羊藿总黄酮提取物中剂量组、淫羊藿总黄酮提取物高剂量组和左旋甲状腺素钠组)细胞加含药血清培养48h后，离心收集悬浮细胞，离心机转速2000rpm，离心5min，弃培养基(贴壁细胞用胰酶消化时间不宜过长，约lmin，以防引起假阳性)。用冷PBS洗涤细胞两次(2000rpm，离心5min收集细胞)，实验使用Annexin-VFITC/PI双染试剂盒。细胞悬浮液(细胞浓度约为1×106个/mL)中加入5μLAnnexin-VFITC染色液，10μLPI染色液后轻轻混匀于4℃避光条件下孵育30min，在lh内用流式细胞仪检测细胞凋亡。3结果与分析3.1HE染色观察甲状腺组织改变从图1，2可知，正常组：正常大鼠甲状腺结构完整，甲状腺滤泡细胞(TEC)排列整齐，滤泡呈圆形或椭圆形，大小均匀一致，滤泡腔内含胶质丰富，染色淡红色，未见淋巴细胞及浆细胞浸润；模型组：小鼠甲状腺形态结构，与正常组比较，大鼠甲状腺滤泡结构破坏严重，部分滤泡萎缩或消失，萎缩滤泡形态不完整，腔内胶质稀少，染色淡红色，滤泡周围见显著淋巴细胞浸润，滤泡内见浆细胞浸润；淫羊藿总黄酮提取物高剂量组：大鼠甲状腺结构大部分较完整，滤泡形态基本规则，大小较一致，TEC间偶见淋巴细胞浸润，滤泡内未见浆细胞，胶质含量略少；淫羊藿总黄酮提取物中剂量组：大鼠甲状腺结构较完整，滤泡形态基本规则，大小不一致，滤泡内及TEC间有部分淋巴细胞及浆细胞，被破坏者少，胶质含量较少；淫羊藿总黄酮提取物低剂量组：大鼠甲状腺结构有所破坏，甲状腺滤泡大小不一致，胶质含量少，胞核染色深，滤泡内及TEC间有淋巴细胞及浆细胞浸润；阳性药组：大鼠甲状腺结构完整，滤泡形态基本规则，大小不一致，TEC间偶见淋巴细胞浸润，滤泡内未见浆细胞，胶质含量略少，未见淋巴细胞及浆细胞浸润。3.2ELISA检测大鼠血清FT3，FT4，TOP-Ab，ATGA，T3，T4，IFN-γ，IL-17，IL-6，IL-10，IL-23和TGF-β的水平变表1淫羊藿总黄酮提取物对HT大鼠血清中FT4，ATGA，T3，T4，FT3和FT4的含量的影响(x±s，n＝6)注:与正常组比较，▲P<0.05,▲▲P<0.01；与模型组比较：★P＜0.05，★★P＜0.01由表1和图3可知，造模后，模型组相比于正常组，血清中ATGA、TPO-Ab、T3含量明显上升，指标T4、FT3、FT4含量明显下降，具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。各给药组在给药两周后，指标ATGA、TPO-Ab、T3相较于模型组均有不同程度下降，其中淫羊藿总黄酮提取物高剂量组及左旋甲状腺素钠片治疗组下降明显，具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。指标T4、FT3、FT4在给药后，各给药组相较于模型组上升，其中淫羊藿总黄酮提取物高剂量组及左旋甲状腺素钠片治疗组上升程度最大，具有显著性差异(P<0.05)。淫羊藿黄酮和左旋甲状腺素钠片给药两周后大鼠血清中ATGA、TPO-Ab、T3含量下降程度高低依次为淫羊藿总黄酮提取物低、中、高剂量组，左旋甲状腺素钠片治疗组。大鼠血清中T4、FT3、FT4含量上升程度高低依次为淫羊藿总黄酮提取物低、中、高剂量组，左旋甲状腺素钠片治疗组。表2淫羊藿总黄酮提取物对HT大鼠血清中IFN-γ，IL-17，IL-6，IL-10，IL-23和TGF-β的含量的影响(x±s，n＝6)注:与正常组比较，▲P<0.05,▲▲P<0.01；与模型组比较：★P＜0.05，★★P＜0.01由表2和图4可知，与正常组比较，模型组中血清中IFN-γ，IL-17，IL-6，IL-23和TGF-β的含量明显上升，指标IL-10含量明显下降，具有显著性差异(P<0.05)。各给药组在给药两周后，指标IFN-γ，IL-17，IL-6，IL-23和TGF-β相较于模型组均有不同程度下降，其中淫羊藿总黄酮提取物高剂量组下降明显，具有显著性差异(P<0.01)。指标IL-10在给药后，各给药组相较于模型组上升，其中淫羊藿总黄酮提取物高剂量组及左旋甲状腺素钠片治疗组上升程度最大，具有显著性差异(P<0.05)。3.3淫羊藿总黄酮提取物对HT大鼠外周血中Treg、Th17细胞影响表3和图5可知，模型组较空白对照组的Treg细胞比例明显下降，存在统计学意义(P<0.01)。淫羊藿总黄酮提取物各剂量组和左旋甲状腺素钠片阳性药组的Treg细胞比例明显升高，与模型组比较均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，随着淫羊藿总黄酮提取物给药剂量加大，Treg细胞比例上升。由表3和图6可知，模型组较空白对照组的Th17细胞比例明显升高(P<0.01)。淫羊藿总黄酮提取物各剂量组和左旋甲状腺素钠片阳性药组大鼠外周血中相应的Th17细胞比例与模型组比较显著降低(P<0.01或P<0.05)，随着淫羊藿总黄酮提取物给药剂量加大，Th17细胞比例随之下降。表3各组大鼠外周血Treg和Th17细胞比例注：与空白对照组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.013.4免疫组化观察桥本甲状腺炎模型大鼠甲状腺中FoxP3、RORγt、IL-17、IL-23、IL-6、IL-10和IFN-γ的表达由表4-10以及图7-20所示的免疫组化结果表明，各组大鼠甲状腺组织均有FoxP3、RORγt、IL-17、IL-23、IL-6、IL-10和IFN-γ阳性表达。相比于正常组，模型组大鼠RORγt、IL-17、IL-23、IL-6和IFN-γ阳性表达明显升高(P<0.01)。在给药后，相对于模型组，各给药组大鼠RORγt、IL-17、IL-23、IL-6和IFN-γ阳性表达、阳性染色面积和累积光密度值均明显降低，降低程度从高到低依次为左旋甲状腺素钠片阳性药组、淫羊藿黄酮高剂量组、淫羊藿黄酮中剂量组、淫羊藿黄酮低剂量组。FoxP3及IL-10指标，相比于正常组，模型组阳性表达明显降低(P<0.01)，给药后，各给药组表达明显升高。表4淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织FoxP3表达的影响(n＝6)注：与正常对照组相比，▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；与模型对照组相比，★：P<0.05，★★：P<0.01。表5淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织RORγt表达的影响(n＝6)注：与正常对照组相比，▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；与模型对照组相比，★：P<0.05，★★：P<0.01。表6淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IL-17表达的影响(n＝6)注：与正常对照组相比，▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；与模型对照组相比，★：P<0.05，★★：P<0.01。表7淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IL-23表达的影响(n＝6)注：与正常对照组相比，▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；与模型对照组相比，★：P<0.05，★★：P<0.01。表8淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IL-6表达的影响(n＝6)注：与正常对照组相比，▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；与模型对照组相比，★：P<0.05，★★：P<0.01。表9淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IL-10表达的影响(n＝6)注：与正常对照组相比，▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；与模型对照组相比，★：P<0.05，★★：P<0.01。表10淫羊藿黄酮对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺组织IFN-γ表达的影响(n＝6)注：与正常对照组相比，▲：P<0.05，▲▲：P<0.01；与模型对照组相比，★：P<0.05，★★：P<0.01。3.6qRT-PCR检测大鼠甲状腺FoxP3、RORγt、TGF-β1、IL-17、IL-23、IL-6、IL-10和IFN-γ基因相对表达量从图21和表11可以看出，与对照组比较，模型组中基因RORγt、IL-17、IL-23、IL-6和IFN-γ的表达量显著升高且IL10，TGF-β和Foxp3的表达量显著降低(P<0.01)；与模型组比较，淫羊藿总黄酮提取物低剂量组，淫羊藿总黄酮提取物中剂量组，淫羊藿总黄酮提取物高剂量组和阳性药组RORγt、IL-17、IL-23、IL-6和IFN-γ基因的表达量逐渐降低，且IL10、TGF-β和Foxp3基因的表达量逐渐升高(P<0.01或P<0.05)，呈现剂量依赖性。表11大鼠甲状腺相关基因相对表达量统计表注：▲▲表示与正常对照组比较p<0.01；★表示与模型组比较p<0.05；★★表示与模型组比较p<0.013.7WB检测大鼠甲状腺FoxP3、RORγt、TGF-β1、IL-17、IL-23、IL-6、IL-10和IFN-γ蛋白表达情况从图22、图23和表12可以看出，与对照组比较，模型组中RORγt、IL-17、IL-23、IL-6和IFN-γ的蛋白表达量显著升高且IL10，TGF-β和Foxp3的蛋白表达量显著降低(P<0.01)；与模型组比较，淫羊藿总黄酮提取物低剂量组，淫羊藿总黄酮提取物中剂量组，淫羊藿总黄酮提取物高剂量组和阳性药组RORγt、IL-17、IL-23、IL-6和IFN-γ的蛋白表达量逐渐降低，且IL10、TGF-β和Foxp3的蛋白表达量逐渐升高(P<0.01或P<0.05)，呈现剂量依赖性。表12大鼠甲状腺相关蛋白相对表达量统计表注：▲▲表示与正常对照组比较p<0.01；★表示与模型组比较p<0.05；★★表示与模型组比较p<0.013.8IL-23对HT大鼠外周血单个核细胞分泌IL-17及IFN-γ的影响由表13、14可知，未给药前，未经IL-23刺激的模型组和各给药组较空白对照组的IL-17和IFN-γ表达水平均明显上升，存在统计学意义(P<0.01)；经过IL-23刺激后，模型组和各给药组较空白对照组的IL-17和IFN-γ表达水平均明显上升，存在统计学意义(P<0.01)。经IL-23刺激后，各组IL-17和IFN-γ表达水平均高于未经IL-23刺激的同组细胞。给药后，未经IL-23刺激的模型组与空白对照组相比，IL-17和IFN-γ表达水平均明显上升，存在统计学意义(P<0.01)，各给药组与模型组比较，IL-17和IFN-γ表达水平均明显降低，左旋甲状腺素钠组表达最低，IL-17和IFN-γ表达水平随着含药血清的给药浓度加大而逐渐降低，均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。经过IL-23刺激后，各给药组与模型组比较，IL-17和IFN-γ表达水平均明显降低，左旋甲状腺素钠阳性药组表达最低，IL-17和IFN-γ表达水平随着含药血清的给药浓度加大而逐渐降低，均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。表13各组大鼠给药前经IL-23刺激后对外周血单个核细胞IL-17及IFN-γ表达水平的影响(pg/ml，n＝3)注：与空白对照组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01表14各组大鼠给药后经IL-23刺激后对外周血单个核细胞IL-17及IFN-γ表达水平的影响(pg/ml，n＝3)注：与空白对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.013.9大鼠甲状腺上皮原代细胞制备大鼠甲状腺组织经消化后纯化得到铺路石状的不规则贴壁细胞，如图24。细胞经过台盼蓝染色后得细胞成活率为(97.43±5.62)％。3.10葡聚糖硫酸钠致大鼠甲状腺上皮细胞损伤模型建立与空白对照组比，大鼠甲状腺上皮细胞经过不同浓度DSS和不同作用时间诱导后，各给药组细胞后OD值均降低。由表15可知，DSS在浓度大于15μg/ml且作用24h以上时出现统计学差异(p<0.05,p<0.01)，其中，20μg/ml的DSS在作用24h时，差异最显著(p<0.01)。表15不同浓度DSS作用于大鼠甲状腺细胞不同时间的OD值(n＝4)注：与空白对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.013.11大鼠甲状腺上皮细胞增殖及毒性检测不同浓度的淫羊藿总黄酮提取物含药血清组用于细胞后，与空白对照组相比，各给药组的细胞OD值略有降低，但无统计学差异(P>0.05)。与空白对照组比，各组细胞的LDH活性随着给药浓度的增加而增加，其中淫羊藿总黄酮提取物高剂量组显著增加，有统计学差异(P<0.05)。淫羊藿总黄酮提取物给药组间相比无统计学差异(P>0.05)。表16不同浓度含药血清对大鼠甲状腺细胞增殖性及毒性作用(n＝4)注：与空白对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01与淫羊藿总黄酮提取物低剂量组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。3.13药物处理及细胞增殖检测与空白对照组比，模型组细胞OD值显著性降低，存在统计学差异(P<0.01)；与模型组比，淫羊藿总黄酮提取物组细胞OD值显著性上升，有统计学差异(P<0.05)。表17含药血清作用于大鼠甲状腺细胞活性影响(n＝4)注：与空白对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.013.14药血清对细胞凋亡的影响由表-18和图25可知，模型组较空白对照组的细胞凋亡率明显上升，存在统计学意义(P<0.01)。淫羊藿黄酮各剂量组和左旋甲状腺素钠片阳性药组的细胞凋亡率比例明显降低，与模型组比较均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，随着淫羊藿黄酮给药剂量加大，细胞凋亡率降低。表18药血清对细胞凋亡的影响(％,n＝3)注：与空白对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01综上，淫羊藿总黄酮提取物对桥本甲状腺炎大鼠具有明显的治疗桥本甲状腺炎的作用。本发明淫羊藿总黄酮提取物经动物实验结果证明，安全性好，疗效佳，能有效地治疗桥本甲状腺炎，该淫羊藿总黄酮提取物是一种改善临床症状效果好，毒副作用小，具有良好的临床应用前景的中药提取物。实施例2淫羊藿总黄酮提取物片剂或其他保健品类淫羊藿总黄酮提取物片剂的成分是成分每片用量淫羊藿总黄酮提取物100mg微晶纤维素37.5mg微粉硅胶10.5mg硬脂酸17.5mg乳糖10.5mg硬脂酸镁1.05mg按处方量将淫羊藿总黄酮提取物(按实施例1方法制得)加入微晶纤维素、微粉硅胶、硬脂酸、乳糖混匀，制成颗粒后加入硬脂酸镁，混匀，压片，即得(每片含淫羊藿总黄酮80mg)。成人推荐口服用量2-4片/次，每日2-3次。实施例3淫羊藿总黄酮提取物胶囊或其他保健品类淫羊藿总黄酮提取物胶囊的成分是成分每片用量淫羊藿总黄酮提取物100mg微晶纤维素37.45mg微粉硅胶10.5mg硬脂酸17.5mg乳糖10.5mg按处方量将淫羊藿总黄酮提取物(按实施例1方法制得)加入微晶纤维素、微粉硅胶、硬脂酸、乳糖混匀，制成颗粒后，填装入0号硬胶囊壳，打光即制得(每粒胶囊含淫羊藿总黄酮80mg)。成人推荐口服用量2-4粒/次，每日2-3次。以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。序列表<110>浙江省人民医院<120>淫羊藿总黄酮在制备防治桥本甲状腺炎的药物或保健品中的应用<130>W-HLY19-031<160>18<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatIL6-F)<400>1ttccagccagttgccttctt20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatIL6-R)<400>2ctggtctgttgtgggtggta20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatIL17-F)<400>3gtgaaggcagcggtactcat20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatIL17-R)<400>4gggtgaagtggaacggttga20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatIL23-F)<400>5caaaggatccgccaaggtct20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatIL23-R)<400>6tggaacggagaagagaacgc20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatINF-γ-F)<400>7ggcaaaaggacggtaacacg20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatINF-γ-R)<400>8tctgtgggttgttcacctcg20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatIL10-F)<400>9aagggttacttgggttgcca20<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列(RatIL10-R)<400>10tggccttgtagacacctttgt21<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatRORγt-F)<400>11cctcctgccaccttgagtat20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatRORγt-R)<400>12tctgagccctgttctggttc20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatTGF-β-F)<400>13ctgctgacccccactgatac20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatTGF-β-R)<400>14agccctgtattccgtctcct20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatFoxp3-F)<400>15gcccacacctcctcttcttc20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列(RatFoxp3-R)<400>16ctgtcctggagaagtgcctg20<210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列(Ratβ-actin-F)<400>17cagggtgtgatggtgggtatgg22<210>18<211>22<212>DNA<213>人工序列(Ratβ-actin-R)<400>18agttggtgacaatgccgtgttc22当前第1页1 2 3