一种雪莲培养物中抑制肝癌细胞的提取物及其治疗肝癌的制剂的制作方法

本发明公开涉及现代医药的技术领域，尤其涉及一种雪莲培养物中抑制肝癌细胞的提取物及其治疗肝癌的制剂。

背景技术：

肝癌，是我国常见的恶性肿瘤之一，由于肝癌早期并无明显的症状，当出现症状后就诊，大多已属于晚期，导致病情的延误。

目前，关于治疗肝癌的制剂有很多，虽然可起到一定的抑制肝癌细胞作用，但均存在用药周期长等问题。

因此，如何研发一种制剂，既能达到抑制肝癌细胞的作用，又能缩短用药周期，成为人们亟待解决的问题。

技术实现要素：

鉴于此，本发明提供了一种雪莲培养物中抑制肝癌细胞的提取物及其治疗肝癌的制剂，以实现在对肝癌细胞有效抑制的基础上，缩短用药周期。

一方面，本发明提供了一种雪莲培养物中抑制肝癌细胞的提取物，该提取物按照如下方法制备获得：

以雪莲培养物为原料，采用氯仿进行回流提取两次，过滤后，合并滤液；

将所述滤液蒸干后，获得产物。

或者，

以雪莲培养物为原料，采用正丁醇进行回流提取两次，过滤后，合并滤液；

将所述滤液蒸干后，放入乙醇中溶解，过滤得残渣；

将所述残渣挥干，得产物。

优选，所述乙醇的体积浓度为50％。

进一步优选，所述肝癌细胞为Hep3B细胞和/或HepG2细胞。

另一方面，本发明还提供了一种治疗肝癌HepG2细胞的制剂，所述制剂中含有雪莲培养物的氯仿提取物和/或雪莲培养物的正丁醇提取物。

优选，所述制剂中雪莲培养物的氯仿提取物的浓度为100μg/mL～400μg/mL；所述制剂中正丁醇提取物的浓度为50μg/mL～400μg/mL。

此外，本发明还提供了一种治疗肝癌Hep3B细胞的制剂，所述制剂中含有雪莲培养物的氯仿提取物和/或雪莲培养物的正丁醇提取物。

优选，所述制剂中雪莲培养物的氯仿提取物的浓度为25μg/mL～50μg/mL；所述制剂中正丁醇提取物的浓度为25μg/mL～200μg/mL。

本发明提供的雪莲培养物中抑制肝癌细胞的提取物，是以雪莲培养物为原料，以氯仿或正丁醇为有机溶剂进行回流提取，获得的。虽然之前已有文献公开，雪莲培养物对于肝癌细胞有抑制作用，但本发明首次意外发现以氯仿或正丁醇为有机溶剂提取的提取物，对于肝癌的HepG2细胞和Hep3B细胞抑制作用极佳，而且用药周期短，可有效解决现有治疗肝癌的制剂存在用药周期长等问题。

本发明提供的治疗肝癌的制剂中含有上述的氯仿提取物或正丁醇提取物，具有肝癌细胞的抑制作用佳，用药周期短等优点。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明的公开。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同浓度的石油醚提取物、氯仿提取物以及乙酸乙酯提取物对于肝癌Hep3B细胞的抑制效果；

图2为不同浓度的正丁醇A提取物、正丁醇B提取物以及水提取物对于肝癌Hep3B细胞的抑制效果；

图3为不同浓度的石油醚提取物、氯仿提取物以及乙酸乙酯提取物对于肝癌HepG2细胞的抑制效果；

图4为不同浓度的正丁醇A提取物、正丁醇B提取物以及水提取物对于肝癌HepG2细胞的抑制效果；

图5为肝癌Hep3B细胞给药后培养48h状态图，其中，A正常组，B DMSO组，C氯仿提取物100μg/mL，D正丁醇B200μg/mL；

图6为肝癌HepG2细胞给药后培养48h状态图，其中，A正常组，B DMSO组，C氯仿提取物50μg/mL，D正丁醇B50μg/mL。

具体实施方式

下面通过具体的实验案例对本发明进行进一步的解释说明，但是并不用于限制本发明的保护范围。

1.1仪器及试剂

Olympus CX22荧光倒置显微镜用于观察细胞状态，上海闪谱酶标仪。

雪莲培养物由大连普瑞康生物技术有限公司提供；肝癌Hep3B细胞株购于沈阳鼎国生物试剂公司，肝癌HepG2细胞株由辽宁中医药大学实验室传代培养；DMEM培养基(Gibico)、小牛血清(Gibico)、双抗(Gibico)MTT(Sigma)均购于沈阳鼎国生物试剂公司；实验用所有细胞培养仪器均为无菌产品。

石油醚(30-60)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯购于北京化学试剂公司(北京，中国)。

2.2样品制备

取雪莲培养物40g，依次以10倍量石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水进行回流提取1h/2次，过滤，合并滤液，蒸干得石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物。正丁醇提取物进一步以体积浓度为50％乙醇溶解，过滤，滤液蒸干后为正丁醇A，残渣挥干得正丁醇B。上述六种不同极性物质，均根据其收率，配制成含生药12.5、25、50、100、200、400μg/mL的溶液，过滤后给予细胞。

2.3细胞培养

肝癌Hep3B细胞株于37℃，5％CO2孵箱孵育3h后，用预温的培养基轻轻洗去未黏附细胞，在贴壁细胞孔中加入DMEM培养基2ml(含10％FBS、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml)，隔2天半量换液，培养7天。

肝癌HepG2细胞株于37℃，5％CO2孵箱孵育3h后，用预温的培养基轻轻洗去未黏附细胞，在贴壁细胞孔中加入RPMI1640培养基2ml(含10％FBS、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml)，隔2天半量换液，培养7天，待细胞状态稳定后给予不同浓度制剂，继续培养48h或72h。同时设立空白组和DMSO溶剂组，计算抑制率。

溶剂抑制率＝(OD溶剂-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100％；

样品抑制率＝(OD样品-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100％；

样品扣除溶剂后抑制率即实际抑制率＝样品抑制率-溶剂抑制率。

1.4 MTT测定

上述细胞状态稳定后，接种于96孔板，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml,给予不同浓度制剂，继续培养48h或72h。同时设立空白组和DMSO溶剂组。

培养结束后离心，取出部分上清，加入MTT(5mg·ml^-1)调整体积为200μL，培养4h后于590nm下测定其OD值，并进行数据统计处理。

其中，图1为不同浓度的石油醚提取物、氯仿提取物以及乙酸乙酯提取物对于肝癌Hep3B细胞的抑制效果；图2为不同浓度的正丁醇A提取物、正丁醇B提取物以及水提取物对于肝癌Hep3B细胞的抑制效果；图3为不同浓度的石油醚提取物、氯仿提取物以及乙酸乙酯提取物对于肝癌HepG2细胞的抑制效果；图4为不同浓度的正丁醇A提取物、正丁醇B提取物以及水提取物对于肝癌HepG2细胞的抑制效果，其中，a、g代表浓度为12.5μg/mL，b、h代表浓度为25μg/mL，c、i代表浓度为50μg/mL，d、j代表浓度为100μg/mL，e、k代表浓度为200μg/mL以及f、l代表浓度为400μg/mL。

如图5、图6所示分别为肝癌Hep3B细胞和肝癌HepG2细胞给药后培养48h状态图，其中，A为正常组，B为DMSO组，C为氯仿提取物100μg/mL，D为正丁醇B200μg/mL。

1.5结论

实验验证：雪莲培养物的氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物以及水提取物对于肝癌Hep3B细胞均具有不同程度的抑制作用，并且意外发现氯仿提取物及正丁醇B提取物对于肝癌Hep3B细胞的抑制率均可高于50％，其IC50分别是28.1μg/mL、23.2μg/mL，当氯仿提取物在100μg/mL～400μg/mL范围时，其对于肝癌Hep3B细胞的最高抑制率可将近80％；当正丁醇B提取物在50μg/mL～400μg/mL范围时，其对于肝癌Hep3B细胞的最高抑制率可将近80％。

雪莲培养物的石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物以及正丁醇提取物对于肝癌HepG2细胞均具有不同程度的抑制作用，并且意外发现是氯仿及正丁醇B抑制率最强，其IC50分别为27.1、31.6μg/mL，当氯仿提取物在25μg/mL～50μg/mL范围时，其对于肝癌HepG2细胞的最高抑制率可将近80％；当正丁醇B提取物在25μg/mL～200μg/mL范围时，其对于肝癌HepG2细胞的最高抑制率可将近80％。

综合而言，将不同提取物对两种肝癌细胞的抑制作用比较研究发现，石油醚提取物抑制作用最差，氯仿提取物及正丁醇提取物对肝癌Hep3B细胞及肝癌HepG2细胞抑制作用均可超过50％，其IC50分别为28.1μg/mL、23.2μg/mL；27.1μg/mL、31.6μg/mL，但是这些药物72h抑制率没有高于48h抑制率，因此，如需进行长期给药，可有效缩短用药周期。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由权利要求指出。

应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述的内容，可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。