一种黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分的提取方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物化学及生物医药技术领域，具体涉及一种黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分的提取方法，以及该抗肿瘤活性成分在制备抗肝癌药物和抗肺癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-rivens)，又名黄蘑燕、金蘑燕、黄环菌，隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、蜜环菌属。黄绿蜜环菌子实体中等大，菌盖扁半球形至平展，直径5-12cm，菌盖边缘内卷，表皮开裂形成近环状排列的纤毛状后磷片。菌褶近似菌盖色，稍密，弯生，不等长。菌柄柱形，茎部膨大，长2-lOcm，直径2-2.5cm，白色或或带黄色，内实。菌环中位，单层，菌环以上为白色，菌环以下为黄色鳞片。在显微镜下观察，担孢子椭圆形，无色至微黄色，淀粉质，担孢子棒状，无色，具4个孢子，菌丝具明显锁状联合。菌丝分布在土壤5-lOcm。该菌夏秋季生于针叶林地或草地上，尤其喜生于高山草地上，菌丝可与主要植被为嵩草和高山杂类草等形成菌根。在牧草生长季节，由黄绿蜜环菌菌丝顶端生长，在草地上形成或大或小的圆圈、半圆或条带状的蘑菇圈。圈的宽度大约为50cm，圈的直径大约6cm左右(周连玉.黄绿蜜环菌的研究概述.安徽农学通报[J].2010，16(3):52-54)。
[0003]国内对黄绿蜜环菌营养成分进行了初步分析，富含氨基酸、蛋白质、多糖多肽等营养和药用成分，具有较高的保健和药用价值。但目前的蜜环菌制剂主要以初提混合物为原料，如郭顺星等在“蜜环菌的化学成分及应用研究”(微生物学通报[J].1996, 23(4):239-240)中提出:蜜环菌糖浆以蜜环菌培养液(菌丝连同发酵液)为主要原料，煮沸浓缩制成，主治眩晕头痛，神经衰弱，失眠，美尼尔综合症；蜜环菌浸膏以菌丝体为原料，煮沸、过滤，残渣醇析，醇析物与滤液合并浓缩制成，用于治疗血管性头痛、神经衰弱、冠心病、脑动脉血管硬化等病；蜜环菌片以菌丝体烤干后磨成细粉压片而成，对高胆固醇血症、高甘油三酯血症、降低血压有一定效果。由于蜜环菌制剂成分一般为混合物，缺乏必要的药效物质基础和药效研究，所以其缺乏合理的质量控制标准，难以确保临床用药的有效性、安全性、可持续性。可见，对黄绿蜜环菌的化学成分进行进一步提取和研究非常有必要。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种黄绿蜜环菌中生物活性成分的提取方法，该方法采用二维高效液相色谱进行分离纯化，得到纯度高达97%的单体化合物，且该单体化合物被证明具有抗肺癌和抗肝癌活性，具有相关药物制剂开发潜力。
[0005]本发明所采用的技术方案为:
[0006]—种黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分的提取方法，该方法包括以下步骤:
[0007](I)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比(5-10)mL: Ig进行浸泡，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状；
[0008](2)使用乙醇体积分数为10-35%的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解步骤(I)得到的膏状乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上样溶液；
[0009](3)对上样溶液进行一维液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为50-150mL/针，流动相流速为550-600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210_260nm ;采用的洗脱方式为B相浓度由0% (即按体积百分比B相0%、A相100%混合而成的液体，下同理)至75%进行梯度洗脱45-75min，根据紫外吸收光谱收集34-39分钟洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；
[0010](4)用乙醇体积分数为2-15 %的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL ；
[0011](5)进行二维液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为500-2000 μ L/针，流动相流速为10-30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210_260nm，采用的洗脱方式为B相浓度4%进行等度洗脱25-35min，根据紫外吸收光谱收集11_16分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到目的成分。
[0012]所述步骤(3)中的Silica正相娃胶色谱柱的尺寸为直径150mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50 μ m，使用时柱温为室温或25-40 °C。
[0013]所述步骤(5)中的Silica正相娃胶色谱柱的尺寸为直径20mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50 μ m，使用时柱温为室温或25-40 °C。
[0014]本发明还进一步提供上述提取得到的黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分在制备抗肺癌药物中的应用。该黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如:片剂、胶囊、注射剂等。
[0015]本发明进一步提供上述提取得到的黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分在制备抗肝癌药物中的应用。该黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如:片剂、胶囊、注射剂等。
[0016]本发明采用二维液相色谱技术进行从黄绿蜜环菌中分离纯化抗肿瘤活性成分:
[0017]首先:选用乙酸乙酯进行粗提，根据相似相溶原则该溶剂可以尽可能多地提取与其极性相近的小极性物质，且乙酸乙酯为脂溶性溶剂，与其相似相溶的目的组分也应该具备进入生物活性细胞所必需的脂溶性特性，从而具有更高的进入细胞参与细胞内作用的可能性；
[0018]其次，在一维分离的条件选择上:多次试验结果显示，Silica正相硅胶色谱柱对所提物质分离效果较好，而通过考察不同流动相组成和不同洗脱方式、流速及进样量后，结果显示采用本发明乙醇-正己烷0% -75%梯度洗脱分离效果最佳，且进样量在50-150mL/针范围内、流动相在550-600mL/min范围内时重复性良好，得到的一维液相组分中目的化合物纯度高达89%，近乎单体化合物的纯度，且目的峰清晰、峰容量较大、无拖尾吸收等现象，与其他峰之间分离非常好，无交叉或重叠等现象，非常有利于分离操作和后续进一步提纯；
[0019]再次，在二维分离的条件选择上:由于一维得到的组分中目的化合物含量已相当高，再使用Silica正相硅胶色谱柱，在洗脱条件选择为B相浓度4%等度洗脱时能将少部分极性接近的杂质分离开，得到纯度高达97%的单体化合物。
[0020]在液相色谱的溶剂选择上，一维色谱分离、二维色谱分离以及中间提取物的溶解，均采用正己烷、乙醇两种溶剂混合液，可以通过改变乙醇的比例来调节有效成分的溶解能力和流动相的洗脱能力，且整个色谱分离仅使用两种溶剂，有利于提取溶剂的回收再利用。
[0021]与现有技术中相比，本发明具有以下优点和显著效果:
[0022](I)提取方法工艺简单，成本低，试剂耗费量小，制备量大，稳定可控，重复性好，批次间一致性高，经工艺放大后可以运用于工业生产；
[0023](2)得到的单体化合物纯度高，稳定性好，且具备良好的生物活性，通过细胞在线实时监测的方法观测其在体外的抗肿瘤作用，发现其对肺癌A549细胞和肝癌Hep-G2细胞具有抑制作用，具有抗肿瘤药物开发潜力，拓宽了抗肿瘤药物的原料来源；
[0024](3)由于产物为高纯度的单体化合物，质量品质和用药更为可控，能够确保临床用药的有效性、安全性、可持续性。
【附图说明】
[0025]图1所示的是本发明实施例1黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分提取的一维色谱图；
[0026]图2所示的是本发明实施例1黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分提取的二维色谱图；
[0027]图3所示的是本发明实施例2黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分提取的一维色谱图；
[0028]图4所示的是本发明实施例2黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分提取的二维色谱图；
[0029]图5所示的是本发明实施例3黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分提取的一维色谱图；
[0030]图6所示的是本发明实施例3黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分提取的二维色谱图；
[0031]图7所示的是本发明实施例4中目的成分对肺癌A549细胞的抑制作用；
[0032]图8所示的是本发明实施例5中目的成分对肝癌!fep-G2细胞的抑制作用。
【具体实施方式