ca正相硅胶色谱柱(150mmX 250mm，娃胶粒径10 μ m)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烧，B相为乙醇，进样量为10mL/针，流动相流速为550mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长21nm ；乙醇活化色谱柱3?10倍柱体积，正己烷平衡3倍柱体积，一维上样溶液上样，采用B相浓度由0%至75%进行梯度洗脱45min。得到的一维液相色谱图如图1所示，得到如图10个主要粗组分，收集34-36min洗脱液(图中9号峰)作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分，称重为5.11克。
[0062](5)用乙醇体积分数为9 %的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为65mg/mL，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到二维上样溶液。
[0063](6)对二维上样溶液进行二维液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(20mmX 250mm，娃胶粒径10 μ m)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为1000 μ L/针，流动相流速为18mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm，采用的洗脱方式为等度洗脱方式:B相浓度4%进行等度洗脱25min。得到的二维液相色谱图如图2所示，只有一个主峰为目的峰，其他的杂质峰峰容量都很小，证明一维分离质量很高，收集13.25-15.75min洗脱液(图中唯一主峰)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，称重为0.056克，即为本发明目的组分，对其进行HPLC纯度分析，达97%。
[0064]实施例4:抑制人肺肿瘤A549细胞生长的试验
[0065]细胞培养:
[0066]在5 % CO2、37 °C饱和湿度下，用F-12K (10 % FBS+1 % PS)培养基培养人肺肿瘤A549细胞，选取对数期生长的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。
[0067]细胞生长情况监测:
[0068]将细胞实时监测仪放入37°C、5% CO2饱和湿度培养箱中。取八孔板，每孔加入150 μ LF-12K培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的Α549细胞悬液345 μ L，至每孔细胞数约2 X 14个，静置3min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5 μ I稀释好的药物(实施例1得到的单体化合物)至终浓度为25 μ g/ml，含1%。DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。
[0069]空白对照孔(DMSO):不加药物，加IKDMSO ；
[0070]实验孔(HMG-9):加实施例1所得目的组分。
[0071 ] 试验结果如图7所示。
[0072]结果表明:本发明目的组分在25 μ g/ml时对A549细胞生长具有较强的抑制作用。
[0073]实施例5:抑制人肝肿瘤Hep_G2细胞生长的试验
[0074]细胞培养:
[0075]在5% C02、37°C饱和湿度下，用MEM(10% FBS、I % PS)培养基培养人肺肿瘤ifep-G2细胞，选取生长状态良好的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。
[0076]细胞生长情况监测:
[0077]将细胞实时监测仪放入5% C02、37°C饱和湿度培养箱中。取八孔板，每孔加入150 μ LMEM培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的Hep-G2细胞悬液345 μ L，至每孔细胞数约4 X 14个，静置3min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5 μ L稀释好的药物(实施例1得到的单体化合物)至终浓度为25 μ g/mL，含1%。DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。
[0078]空白对照孔(DMSO):不加药物，加入1% DMSO ；
[0079]实验孔(HMG-9):加实施例1所得目的组分。
[0080]实验结果如图8所示。
[0081 ] 结果表明:本发明目的组分在25 μ g/ml时对能Hep_G2细胞具有较好的抑制作用。
[0082]对比图1、图3、图5及图2、图4、图6，可以得出，本发明黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分的提取方法重复性好，批次间一致性高，可操作程度强，适合工业化推广生产。
[0083]由实施例4、5可知，本发明所得目的单体化合物具有较强的抑制肺癌A549细胞和肝癌Hep_G2细胞的活性，接下来我们将进一步解析其具体结构，并进行相关动物药效学、药理学、急性毒性、长期毒性试验，力图开发出强活性抗肿瘤单体药物，为人类的健康奉献微薄力量。
[0084]本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合药物有效成分提取的市售产品。
[0085]以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
【主权项】
1.一种黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分的提取方法，其特征在于包括以下步骤: (1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比(5-10)mL: Ig进行浸泡，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状； (2)使用乙醇体积分数为10-35%的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解步骤(I)得到的膏状乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上样溶液； (3)对上样溶液进行一维液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为50-150mL/针，流动相流速为550-600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210_260nm ;采用的洗脱方式为B相浓度由0%至75%进行梯度洗脱45-75min，根据紫外吸收光谱收集34-39分钟洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分； (4)用乙醇体积分数为2-15%的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL ； (5)进行二维液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为500-2000 μ L/针，流动相流速为10-30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210_260nm，采用的洗脱方式为B相浓度4%进行等度洗脱25-35min，根据紫外吸收光谱收集11_16分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到目的成分。2.根据权利要求1所述的一种黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分的提取方法，其特征在于:所述步骤(3)中的Silica正相娃胶色谱柱的尺寸为直径150_、柱长250_，其中娃球粒径为10-50 μ m，使用时柱温为室温或25-40 °C。3.根据权利要求1所述的一种黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分的提取方法，其特征在于:所述步骤(5)中的Silica正相娃胶色谱柱的尺寸为直径20mm、柱长250mm，其中娃球粒径为10-50 μ m，使用时柱温为室温或25-40 °C。4.权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分在制备抗肺癌药物中的应用。5.权利要求1所述的黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分在制备抗肝癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分的提取方法：以黄绿蜜环菌子实体为原料，磨成粉末后用乙酸乙酯浸泡，过滤取上清，浓缩至膏状；用正己烷-乙醇溶剂溶解，得上样溶液；一维液相色谱分离：采用Silica色谱柱，A正己烷、B乙醇二元流动相，B相浓度由0％至75％梯度洗脱，收集34-39分钟洗脱液，浓缩至膏状；用乙醇-正己烷溶剂溶解；二维液相色谱分离：采用Silica色谱柱，A正己烷、B乙醇二元流动相，B相浓度4％等度洗脱，收集11-16分钟洗脱液，浓缩至干，得目的成分。该方法得到纯度达97％的单体化合物，且该化合物被证明具有抗肺癌和抗肝癌活性，具有相关药物制剂开发潜力。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/07
【公开号】CN105596379
【申请号】CN201510551624
【发明人】张耀洲, 王欢欢, 盖其静, 杜思邈, 庞莉, 韩朝, 李上文, 马红, 杨珊珊, 陆洪
【申请人】天津耀宇生物技术有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年9月1日