】
[0033]以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
[0034]1.原料、材料:
[0035]黄绿蜜环菌子实体采摘自青海祁连并经过鉴定；人肺癌A549细胞由中国医学科学院血液病医院提供；人肝肿瘤Hep-G2细胞由中国医学科学院血液病医院提供。
[0036]2.试剂:
[0037]无水乙醇购自天津市北方天医化学试剂厂；色谱级乙酸乙酯、正己烷购自Honeywell 公司；F_12K培养基购自 Life Technologies Corporat1n ;MEM培养基购自 LifeTechnologies Corporat1n ;DMS0购自天津康科德科技有限公司。
[0038]3.仪器设备:
[0039]超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；台式冷冻离心机购自Thermo公司；30升中药提取罐购自上海顺仪实验设备有限公司；恒温鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司；旋转蒸发仪上海亚容生化仪器厂；silica正相硅胶色谱柱购自博纳艾吉尔有限公司；制备型高效液相色谱仪购自江苏汉邦科技有限公司；iCELLigenCe实时无标记细胞功能分析仪购自艾森生物(杭州)有限公司。
[0040]实施例1:
[0041]本实施例黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分的提取，包括以下步骤:
[0042](I)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在70°C烘干脱水，然后在_20°C超微粉碎Imin，即得黄绿蜜环菌超微粉。
[0043](2)取上述黄绿蜜环菌超微粉3kg，经过三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡:3kg黄绿蜜环菌超微粉加入15L乙酸乙酯，25°C浸泡48h，浸泡结束后，20°C、4，OOOrpm离心30min，分别收集上清液和残渣，上清液通过旋转蒸发浓缩后转移至60°C恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重。第二次乙酸乙酯浸泡:第一次的残渣加入15L乙酸乙酯，25°C浸泡36h。(浸泡结束，按第一次浸泡方法进行处理，其中水体乙酸乙酯上清可与第一次提取上清混合，烘干至恒重)。第三次浸泡:第二次浸泡残渣加入15L乙酸乙酯，25°C浸泡24h，浸泡结束，按第一次浸泡处理方法进行处理，将三次浸泡上清合并，旋蒸浓缩后烘干至恒重。
[0044](3)将干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇体积分数为25%的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解配制成lOOmg/mL的溶液，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到黄绿蜜环菌子实体小分子提取物的一维上样溶液。
[0045](4)对一维上样溶液进行一维液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(150mmX 250mm，娃胶粒径10 μ m)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烧，B相为乙醇，进样量为10mL/针，流动相流速为580mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长21nm ；乙醇活化色谱柱3?10倍柱体积，正己烷平衡3倍柱体积，一维上样溶液上样，采用B相浓度由0%至75%进行梯度洗脱50min。得到的一维液相色谱图如图1所示，得到如图10个主要粗组分，收集36-38.5min洗脱液(图中9号峰)作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分，称重为5.32克。
[0046](5)用乙醇体积分数为15 %的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为100mg/mL，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到二维上样溶液。
[0047](6)对二维上样溶液进行二维液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(20mmX 250mm，娃胶粒径10 μ m)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为1000 μ L/针，流动相流速为20mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm，采用的洗脱方式为等度洗脱方式:B相浓度4%进行等度洗脱25min。得到的二维液相色谱图如图2所示，只有一个主峰为目的峰，其他的杂质峰峰容量都很小，证明一维分离质量很高，收集ll_13min洗脱液(图中唯一主峰)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，称重为0.066克，即为本发明目的组分，对其进行HPLC纯度分析，达97%。
[0048]实施例2:
[0049]本实施例黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分的提取，包括以下步骤:
[0050](I)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在70°C烘干脱水，然后在_20°C超微粉碎Imin，即得黄绿蜜环菌超微粉。
[0051](2)取上述黄绿蜜环菌超微粉3kg，经过三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡:3kg黄绿蜜环菌超微粉加入24L乙酸乙酯，25°C浸泡48h，浸泡结束后，20°C、4，OOOrpm离心30min，分别收集上清液和残渣，上清液通过旋转蒸发浓缩后转移至60°C恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重。第二次乙酸乙酯浸泡:第一次的残渣加入24L乙酸乙酯，25°C浸泡36h。(浸泡结束，按第一次浸泡方法进行处理，其中水体乙酸乙酯上清可与第一次提取上清混合，烘干至恒重)。第三次浸泡:第二次浸泡残渣加入24L乙酸乙酯，25°C浸泡24h，浸泡结束，按第一次浸泡处理方法进行处理，将三次浸泡上清合并，旋蒸浓缩后烘干至恒重。
[0052](3)将干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇体积分数为15%的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解配制成85mg/mL的溶液，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到黄绿蜜环菌子实体小分子提取物的一维上样溶液。
[0053](4)对一维上样溶液进行一维液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(150mmX 250mm，娃胶粒径10 μ m)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烧，B相为乙醇，进样量为120mL/针，流动相流速为600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长21nm ；乙醇活化色谱柱3?10倍柱体积，正己烷平衡3倍柱体积，一维上样溶液上样，采用B相浓度由0%至75%进行梯度洗脱50min。得到的一维液相色谱图如图1所示，得到如图10个主要粗组分，收集35.5-37.5min洗脱液(图中9号峰)作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分，称重为5.47克。
[0054](5)用乙醇体积分数为10 %的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为80mg/mL，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到二维上样溶液。
[0055](6)对二维上样溶液进行二维液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(20mmX 250mm，娃胶粒径10 μ m)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烧，B相为乙醇，进样量为900 μ I/针，流动相流速为20mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm，采用的洗脱方式为等度洗脱方式:B相浓度4%进行等度洗脱25min。得到的二维液相色谱图如图2所示，只有一个主峰为目的峰，其他的杂质峰峰容量都很小，证明一维分离质量很高，收集13.25-15.25min洗脱液(图中唯一主峰)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，称重为0.071克，即为本发明目的组分，对其进行HPLC纯度分析，达96.5%。
[0056]实施例3:
[0057]本实施例黄绿蜜环菌抗肿瘤活性成分的提取，包括以下步骤:
[0058](I)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在70°C烘干脱水，然后在_20°C超微粉碎Imin，即得黄绿蜜环菌超微粉。
[0059](2)取上述黄绿蜜环菌超微粉3kg，经过三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡:3.5kg黄绿蜜环菌超微粉加入28L乙酸乙酯，250C浸泡48h，浸泡结束后，20°C、4，OOOrpm离心30min，分别收集上清液和残渣，上清液通过旋转蒸发浓缩后转移至60°C恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重。第二次乙酸乙酯浸泡:第一次的残渣加入28L乙酸乙酯，25°C浸泡36h。(浸泡结束，按第一次浸泡方法进行处理，其中水体乙酸乙酯上清可与第一次提取上清混合，烘干至恒重)。第三次浸泡:第二次浸泡残渣加入28L乙酸乙酯，25°C浸泡24h，浸泡结束，按第一次浸泡处理方法进行处理，将三次浸泡上清合并，旋蒸浓缩后烘干至恒重。
[0060](3)将干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇体积分数为20%的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解配制成103mg/mL的溶液，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到黄绿蜜环菌子实体小分子提取物的一维上样溶液。
[0061](4)对一维上样溶液进行一维液相色谱分离:采用的色谱柱为Sili