从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇过氧化物的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及药物化学及生物医药技术领域，具体设及一种从黄绿蜜环菌中提取麦 角酱醇过氧化物的方法，W及该麦角酱醇过氧化物在制备抗肝癌药物、抗肺癌药物中的应 用。
【背景技术】
[0002] 黄绿蜜环菌(41'111；[11日1'1日1111日0-1'；[￥日]13)，又名黄磨茹、金磨茹、黄环菌，隶属于担 子菌亚口、层菌纲、伞菌目、白磨科、蜜环菌属。黄绿蜜环菌子实体中等大，菌盖扁半球形至 平展，直径5-12cm，菌盖边缘内卷，表皮开裂形成近环状排列的纤毛状后憐片。菌權近似菌 盖色，稍密，弯生，不等长。菌柄柱形，茎部膨大，长2-lOcm，直径2-2.5cm，白色或或带黄色， 内实。菌环中位，单层，菌环W上为白色，菌环W下为黄色鱗片。在显微镜下观察，担抱子楠 圆形，无色至微黄色，淀粉质，担抱子棒状，无色，具4个抱子，菌丝具明显锁状联合。菌丝分 布在±壤5-10(：111。该菌夏秋季生于针叶林地或草地上，尤其喜生于高山草地上，菌丝可与主 要植被为嵩草和高山杂类草等形成菌根。在牧草生长季节，由黄绿蜜环菌菌丝顶端生长，在 草地上形成或大或小的圆圈、半圆或条带状的磨茹圈。圈的宽度大约为50cm，圈的直径大约 6cm左右(周连玉.黄绿蜜环菌的研究概述.安徽农学通报[J].2010,16(3) :52-54)。
[0003] 国内对黄绿蜜环菌营养成分进行了初步分析，富含氨基酸、蛋白质、多糖多肤等营 养和药用成分，具有较高的保健和药用价值。但目前的蜜环菌制剂主要W初提混合物为原 料，如郭顺星等在"蜜环菌的化学成分及应用研究"（微生物学通报[J]. 1996,23(4) :239- 240)中提出：蜜环菌糖浆W蜜环菌培养液(菌丝连同发酵液)为主要原料，煮沸浓缩制成，主 治眩晕头痛，神经衰弱，失眠，美尼尔综合症;蜜环菌浸膏W菌丝体为原料，煮沸、过滤，残渣 醇析，醇析物与滤液合并浓缩制成，用于治疗血管性头痛、神经衰弱、冠屯、病、脑动脉血管硬 化等病；蜜环菌片W菌丝体烤干后磨成细粉压片而成，对高胆固醇血症、高甘油Ξ醋血症、 降低血压有一定效果。由于蜜环菌制剂成分一般为混合物，缺乏必要的药效物质基础和药 效研究，所W其缺乏合理的质量控制标准，难W确保临床用药的有效性、安全性、可持续性。 可见，对黄绿蜜环菌的化学成分进行进一步提取和研究非常有必要。
[0004] 麦角酱醇过氧化物是黄绿蜜环菌中一种重要的植物酱醇类物质。目前对该化合物 的提取步骤繁琐，重复性不高，且得率低，制备量小，仅能满足实验室研究需求。而对该化合 物的研究，多用于生化方面，对其抗癌的药理活性研究鲜有报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种从黄绿蜜环菌 中提取麦角酱醇过氧化物的方法，该方法采用离线高效液相色谱进行分离纯化，分离方法 稳定，重复性高，制备量大，得到的麦角酱醇过氧化物纯度可达98% W上;且使用该方法制 备麦角酱醇过氧化物提取率高，每公斤原料可达目的产物30mg，相比现有技术提取率高，操 作简单省时，能满足工业化生产需求。
[0006] 本发明所采用的技术方案为：
[0007] -种从黄绿蜜环菌中提取麦角酱醇过氧化物的方法，该方法包括W下步骤：
[0008] (1)W黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙醋W液固比 (5-10)mL:lg进行浸泡，然后过滤取上清，得到乙酸乙醋提取液，并浓缩至膏状；
[0009] (2)使用乙醇体积分数为10-35%的正己烧-乙醇二元混合溶剂溶解步骤（1)得到 的膏状乙酸乙醋提取物，得到100-150mg/mL的上样溶液；
[0010] (3)对上样溶液进行一维液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱， 采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烧、B相为乙醇，进样量为50-150mL/针，流 动相流速为550-600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260皿;采用的洗脱方式为 B相浓度由0 %至75 %梯度洗脱45-75min，根据紫外吸收光谱收集10-14min洗脱液作为目的 组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；
[0011] (4)用乙醇体积分数为2-13%的乙醇-正己烧二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶 解至浓度为SO-lOOrng/mL
[0012] (5)进行二维液相色谱分离:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动 相为二元混合有机化其中A相为正己烧、B相为乙醇，进样量为500-200化17针，流动相流速 为10-30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260皿，采用的洗脱方式为B相浓度4- 8%等度洗脱20-30min，根据紫外吸收光谱收集6-8min洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩 至干，得到二维液相组分；
[0013] (6)用乙醇体积分数为2-13%的乙醇-正己烧二元混合溶剂溶解二维液相组分，溶 解至浓度为SO-lOOrng/mL
[0014] (7)进行再分离纯化:采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二 元混合有机相，其中A相为正己烧、B相为乙醇，进样量为300-1500化/针，流动相流速为10- 30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-26化m，采用的洗脱方式为B相浓度2-3%等 度洗脱35-45min，根据紫外吸收光谱收集22-24min洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至 干，得到目的产物麦角酱醇过氧化物。
[0015] 所述步骤(3)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径150mm、柱长250mm，其中娃 球粒径为10-50μπι，使用时柱溫为室溫或25-40°C。
[0016] 所述步骤(5)、（7)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径20mm、柱长250mm，其 中娃球粒径为10-50μπι，使用时柱溫为室溫或25-40°C。
[0017] 本发明还进一步提供上述提取得到的麦角酱醇过氧化物在制备抗肺癌药物中的 应用。该麦角酱醇单体化合物作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受 载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如:片剂、胶囊、注射剂等。
[0018] 本发明进一步提供上述提取得到的麦角酱醇过氧化物在制备抗肝癌药物中的应 用。该麦角酱醇单体化合物作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载 体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如:片剂、胶囊、注射剂等。
[0019] 本发明原料黄绿蜜环菌化学成分复杂、物质极性比较集中，目的化合物麦角酱醇 过氧化物极性较小，所W本发明先选用乙酸乙醋进行有效组分的粗提。根据相似相溶原理， 该溶剂可W尽可能多地溶解目的组分W及与相近的小分子杂质，且乙酸乙醋为脂溶性溶 剂，与其相似相溶的目的组分也应该具备进入生物活性细胞所必需的脂溶性特性，从而具 有更高的进入细胞参与细胞内作用的可能性。
[0020] 其次在色谱分离的选择上选用离线液相色谱技术进行有效组分的提取，其优势在 于液相色谱不仅具有更高的峰容量，而且Ξ维具有不同的选择性。经过一维简化的组分可 W在二维、Ξ维上根据不同的选择性实现互补分离，结构相似的化合物可W在二维、Ξ维上 达到有效分离，从而提高制备的效率和化合物纯度。
[0021] 本发明利用液相色谱制备的方法成功从黄绿蜜环菌中提取分离得到纯度达98% 的天然小分子麦角酱醇过氧化物，该方法工艺简单，时间周期短，试剂耗费量小，制备量大， 稳定可控，重复性好，实用性高，适用于大规模工业化生产的需要。
[0022] 现在药理研究表明，黄绿蜜环菌具有多种药理作用和保健作用并被广泛应用于屯、 脑血管疾病、妇科各类疾病的治疗。因此从中分离出具有确切结构并且易于进行化学合成 的集抗癌活性为一体的化合物必将为抗癌新药的研发奠定基础。本发明得到的黄绿蜜环菌 提取物麦角酱醇过氧化物性质稳定，通过细胞在线实时监测的方法观测其在体外的抗肿瘤 作用，发现该化合物对肝癌化p-g2细胞和肺癌A549细胞均具有抑制作用；该化合物在体外 实验抗肿瘤作用明显，具有抗癌药物开发潜力，为抗癌天然药物的开发提供了有力的依据。
【附图说明】
[0023] 图1所示的是本发明实施例1中的一维高效液相色谱图；
[0024] 图2所示的是本发明实施例1中的二维高效液相色谱图；
[0025] 图3所示的是本发明实施例1中的Ξ维高效液相色谱图；
[0026] 图4所示的是本发明实施例2中的一维高效液相色谱图；
[0027] 图5所示的是本发明实施例2中的二维高效液相色谱图；
[0028] 图6所示的是本发明实施例2中的Ξ维高效液相色谱图；
[0029] 图7所示的是本发明所得目的组分的分析型高效液相色谱图；
[0030] 图8所示的是本发明所得目的组分的MS质谱图；
[0031 ]图9所示的是本发明所得目的组分的HiNMR核磁图；
[0032] 图10所示的是本发明所得目的组分的C^NIR核磁图；
[0033] 图11所示的是本发明所得目的组分的丽Q幻普图；
[0034] 图12所示的是本发明所得目的组分的HMB幻普图；
[0035] 图13所示的是本发明所得麦角酱醇过氧化物对肺癌A549细胞的抑制作用；
[0036] 图14所示是本发明所得麦角酱醇过氧化物对肝癌化P-G2