本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种鹿瓜多肽注射制剂。
背景技术：
鹿瓜多肽注射制剂由鹿科动物梅花鹿的骨骼和葫芦科植物甜瓜的干燥成熟种子经分别提取后制成，主要含有骨诱导多肽类生物因子、甜瓜籽提取物、多种游离氨基酸和有机钙、磷等成分。
以鹿骨和甜瓜子为原料的药物制剂，主要是鹿瓜多肽注射制剂，该制剂具有调节骨代谢、刺激成骨细胞增殖、促进新骨形成的作用，亦可调节钙鳞代谢、增加骨钙沉积、防止骨质疏松，并具有抗炎、镇痛、抗风湿等作用，已在临床广泛使用。临床应用表明，以鹿骨和甜瓜子为原料的注射制剂是治疗骨折不愈合、骨质疏松症、风湿、类风湿性关节炎、腕舟状骨缺血性坏死和软组织损伤等的有效药物，在骨科的应用前景广阔。
中国专利cn02125357.9公开了以鹿骨和甜瓜子为原料制备注射剂，该专利方法为：分别对鹿骨和甜瓜子进行提取、酸调ph值、碱调ph值，合并提取液后再超滤制备成注射制剂；中国专利cn200410013602.7公开了鹿骨和甜瓜子为原料制备成注射制剂，该专利的方法为：鹿骨进行提取、酸调ph值、碱调ph值、超滤，甜瓜子提取、超滤，合并提取液制备成注射剂；中国专利200510108157.7公开了鹿瓜多肽注射剂的制备方法，该方法为：鹿骨提取，经过三次超滤，甜瓜子提取、三次超滤，合并提取液，制备成注射剂；中国专利cn200910167155.3公开了鹿瓜多肽注射剂的制备方法，该方法为：分别将鹿骨和甜瓜子提取、酸调ph值、加热后超滤、离心、碱调ph值、离心、调ph值、三步超滤、超滤液制备成注射剂；中国专利cn201210328858.1公开了鹿瓜多肽注射剂的制备方法，该方法为：鹿骨提取后，经过三次超滤，甜瓜子提取后，经过三次超滤，合并提取液制备成注射制剂。上述方法虽然可以获得鹿瓜多肽注射剂，但都没有充分考虑鹿瓜多肽中无效成分的含量，因此，上述制备方法有待商榷。
目前上市销售的鹿瓜多肽制剂主要为鹿瓜多肽注射液和鹿瓜多肽冻干粉针剂。专利cn1579542a公开了注射用鹿瓜多肽及其制备工艺，由多肽类物质和赋形剂制备成冻干粉针剂；专利cn1742778a公开了一种注射用鹿瓜多肽药物组合物及其制备方法，它含有鹿骨提取物、甜瓜子提取物和一种或多种赋形剂制成。然而鹿瓜多肽注射液中的肽类物质易聚合成大分子，其中的碱和鞣质可加速这种聚合反应，因此鹿瓜多肽注射液在保存过程中易聚合，导致临床过敏反应增加，同时不利于长期存放；鹿瓜多肽的冻干粉针剂在长期放置过程也存在稳定性差的问题，导致有效成分的含量降低，生物利用度降低，影响了临床应用。
技术实现要素：
基于上述原因，为了解决现有技术的不足，申请人经过多年研究，得到一种新的鹿瓜多肽注射制剂，该制剂是由鹿骨提取的多肽、甜瓜籽提取的多肽、海藻酸钠制备而成。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种鹿瓜多肽注射制剂，该注射制剂由鹿骨提取的多肽、甜瓜籽提取的多肽、海藻酸钠制备而成。
其中鹿骨提取的多肽、甜瓜籽提取的多肽与海藻酸钠的重量比为1.5-2.5：0.7-0.8：0.070-0.10。
其中鹿骨提取的多肽、甜瓜籽提取的多肽与海藻酸钠的重量比为2：0.75：0.083。
其中鹿骨提取的多肽的制备方法为：
取鹿骨，去掉骨髓，粉碎，称重，加入鹿骨重量1.5％～2.5％的复合蛋白酶和鹿骨重量2～4倍的注射用水，复合蛋白酶为重量比为1.85～2.35：1的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶；40℃～50℃提取1～3小时，过滤，滤液用枸橼酸调ph到4.5～6.0，静置，过滤，滤液用枸橼酸钠调ph到8.5～9.0，加入鹿骨重量的0.1～0.3倍的胰酶，40℃～50℃水解1～3小时，过滤，将滤液枸橼酸调制ph值为6.5～7.5，依次用截取分子量十万超滤系统、截取分子量一万超滤系统、截取分子量八千超滤机组，进行超滤，保留透过液，冷冻干燥，得到鹿骨提取的多肽。
其中甜瓜籽提取的多肽的制备方法为：
取甜瓜籽，粉碎，称重，加入甜瓜籽重量1.5％～2.5％的复合蛋白酶和甜瓜籽重量2～4倍的注射用水，复合蛋白酶为重量比为1.85～2.35：1的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶；40℃～50℃提取1～3小时，过滤，滤液用枸橼酸调ph到4.5～6.0，静置，过滤，滤液用枸橼酸钠调ph到8.5～9.0，加入甜瓜籽重量的0.1～0.3倍的胰酶，40℃～50℃水解1～3小时，过滤，滤液用枸橼酸调制ph值为6.5～7.5，依次用截取分子量十万超滤系统、截取分子量一万超滤系统、截取分子量八千超滤机组，进行超滤，保留透过液，冷冻干燥，得到甜瓜籽提取得到多肽。
其中该注射制剂的制备方法为：取海藻酸钠，加入注射用水，溶解完全，加热至30-40℃，在该温度下加入鹿骨提取的多肽和甜瓜籽提取的多肽，保持30-40℃搅拌10-20min，冷却至室温，过滤，滤液经0.22μm滤芯过滤，浓缩至多肽含量为3-6mg/ml，灌装，得到注射液。
本发具有下述有益的技术效果：
1、工艺简单，适合工业化生产，去除活性炭工艺方法，符合一致性评价的规定。
2、采用海藻酸钠作为制剂的辅料，保证制剂产品稳定性，进一步，获得质量更加优秀的产品。
3、本发明的注射制剂，符合注射制剂常规的要求，比如内毒素、装量差异等，具有更高的潜在安全性。
4、制剂辅料用量少，产品成本更低，降低患者的用药费用。
5、本发明制剂经过稳定性试验，多肽含量、游离氨基酸含量、高分子物质含量几乎不增加或增加较小，具有更好的安全性。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明下述试验委托沈耀(香河)科技有限公司完成。
制备实施例
实施例1
取鹿骨，去掉骨髓，粉碎，称重，加入鹿骨重量1.5％的复合蛋白酶和鹿骨重量2倍的注射用水，复合蛋白酶为重量比为1.85：1的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶；40℃提取3小时，过滤，滤液用枸橼酸调ph到4.5，静置，过滤，滤液用枸橼酸钠调ph到8.5，加入鹿骨重量的0.1倍的胰酶，40℃水解3小时，过滤，将滤液枸橼酸调制ph值为6.5，依次用截取分子量十万超滤系统、截取分子量一万超滤系统、截取分子量八千超滤机组，进行超滤，保留透过液，冷冻干燥，得到鹿骨提取的多肽。
其中甜瓜籽提取的多肽的制备方法为：取甜瓜籽，粉碎，称重，加入甜瓜籽重量1.5％的复合蛋白酶和甜瓜籽重量2倍的注射用水，复合蛋白酶为重量比为1.85：1的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶；40℃提取3小时，过滤，滤液用枸橼酸调ph到4.5，静置，过滤，滤液用枸橼酸钠调ph到8.5，加入甜瓜籽重量的0.1倍的胰酶，40℃水解3小时，过滤，滤液用枸橼酸调制ph值为6.5，依次用截取分子量十万超滤系统、截取分子量一万超滤系统、截取分子量八千超滤机组，进行超滤，保留透过液，冷冻干燥，得到甜瓜籽提取得到多肽。
制剂的制备方法：鹿骨提取的多肽、甜瓜籽提取的多肽与海藻酸钠的重量比为1.5：0.7：0.070取海藻酸钠，加入注射用水，溶解完全，加热至30℃，在该温度下加入鹿骨提取的多肽和甜瓜籽提取的多肽，保持30℃搅拌20min，冷却至室温，过滤，滤液经0.22μm滤芯过滤，浓缩至多肽含量为4.5mg/ml，灌装，得到注射液100支。
实施例2
鹿骨提取的多肽的制备方法为：取鹿骨，去掉骨髓，粉碎，称重，加入鹿骨重量2.5％的复合蛋白酶和鹿骨重量4倍的注射用水，复合蛋白酶为重量比为2.35：1的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶；50℃提取1小时，过滤，滤液用枸橼酸调ph到6.0，静置，过滤，滤液用枸橼酸钠调ph到9.0，加入鹿骨重量的0.3倍的胰酶，50℃水解1小时，过滤，将滤液枸橼酸调制ph值为7.5，依次用截取分子量十万超滤系统、截取分子量一万超滤系统、截取分子量八千超滤机组，进行超滤，保留透过液，冷冻干燥，得到鹿骨提取的多肽。
甜瓜籽提取的多肽的制备方法为：取甜瓜籽，粉碎，称重，加入甜瓜籽重量2.5％的复合蛋白酶和甜瓜籽重量4倍的注射用水，复合蛋白酶为重量比为2.35：1的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶；50℃提取1小时，过滤，滤液用枸橼酸调ph到6.0，静置，过滤，滤液用枸橼酸钠调ph到9.0，加入甜瓜籽重量的0.3倍的胰酶，50℃水解1小时，过滤，滤液用枸橼酸调制ph值为7.5，依次用截取分子量十万超滤系统、截取分子量一万超滤系统、截取分子量八千超滤机组，进行超滤，保留透过液，冷冻干燥，得到甜瓜籽提取得到多肽。
制剂的制备方法：鹿骨提取的多肽、甜瓜籽提取的多肽与海藻酸钠的重量比为2.5：0.8：0.10；取海藻酸钠，加入注射用水，溶解完全，加热至40℃，在该温度下加入鹿骨提取的多肽和甜瓜籽提取的多肽，保持40℃搅拌20min，冷却至室温，过滤，滤液经0.22μm滤芯过滤，浓缩至多肽含量为4.5mg/ml，灌装，得到注射液100支。
实施例3
鹿骨提取的多肽的制备方法为：取鹿骨，去掉骨髓，粉碎，称重，加入鹿骨重量2.0％的复合蛋白酶和鹿骨重量3倍的注射用水，复合蛋白酶为重量比为2.05：1的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶；40℃～50℃提取1～3小时，过滤，滤液用枸橼酸调ph到5.5，静置，过滤，滤液用枸橼酸钠调ph到8.8，加入鹿骨重量的0.2倍的胰酶，45℃水解2小时，过滤，将滤液枸橼酸调制ph值为7.0，依次用截取分子量十万超滤系统、截取分子量一万超滤系统、截取分子量八千超滤机组，进行超滤，保留透过液，冷冻干燥，得到鹿骨提取的多肽。
甜瓜籽提取的多肽的制备方法为：取甜瓜籽，粉碎，称重，加入甜瓜籽重量2.0％的复合蛋白酶和甜瓜籽重量3倍的注射用水，复合蛋白酶为重量比为2.05：1的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶；45℃提取2小时，过滤，滤液用枸橼酸调ph到5.0，静置，过滤，滤液用枸橼酸钠调ph到8.8，加入甜瓜籽重量的0.2倍的胰酶，45℃水解2小时，过滤，滤液用枸橼酸调制ph值为7.0，依次用截取分子量十万超滤系统、截取分子量一万超滤系统、截取分子量八千超滤机组，进行超滤，保留透过液，冷冻干燥，得到甜瓜籽提取得到多肽。
制剂的制备方法：鹿骨提取的多肽、甜瓜籽提取的多肽与海藻酸钠的重量比为2：0.75：0.083；取海藻酸钠，加入注射用水，溶解完全，加热至35℃，在该温度下加入鹿骨提取的多肽和甜瓜籽提取的多肽，保持35℃搅拌15min，冷却至室温，过滤，滤液经0.22μm滤芯过滤，浓缩至多肽含量为4.5mg/ml，灌装，得到注射液。
实施例4
鹿骨提取的多肽的制备方法为：取鹿骨，去掉骨髓，粉碎，称重，加入鹿骨重量1.8％的复合蛋白酶和鹿骨重量3.5倍的注射用水，复合蛋白酶为重量比为1.95：1的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶；45℃提取2.5小时，过滤，滤液用枸橼酸调ph到5.5，静置，过滤，滤液用枸橼酸钠调ph到9.0，加入鹿骨重量的0.25倍的胰酶，45℃水解1.5小时，过滤，将滤液枸橼酸调制ph值为6.5，依次用截取分子量十万超滤系统、截取分子量一万超滤系统、截取分子量八千超滤机组，进行超滤，保留透过液，冷冻干燥，得到鹿骨提取的多肽。
甜瓜籽提取的多肽的制备方法为：取甜瓜籽，粉碎，称重，加入甜瓜籽重量1.8％的复合蛋白酶和甜瓜籽重量2倍的注射用水，复合蛋白酶为重量比为1.95：1的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶；45℃提取1.5小时，过滤，滤液用枸橼酸调ph到4.5，静置，过滤，滤液用枸橼酸钠调ph到8.5，加入甜瓜籽重量的0.15倍的胰酶，45℃水解2小时，过滤，滤液用枸橼酸调制ph值为6.5，依次用截取分子量十万超滤系统、截取分子量一万超滤系统、截取分子量八千超滤机组，进行超滤，保留透过液，冷冻干燥，得到甜瓜籽提取得到多肽。
鹿骨提取的多肽、甜瓜籽提取的多肽与海藻酸钠的重量比为1.7：0.7：0.075；取海藻酸钠，加入注射用水，溶解完全，加热至35℃，在该温度下加入鹿骨提取的多肽和甜瓜籽提取的多肽，保持35℃搅拌15min，冷却至室温，过滤，滤液经0.22μm滤芯过滤，浓缩至多肽含量为4.5mg/ml，灌装，得到注射液。
实施例5
鹿骨提取的多肽的制备方法为：取鹿骨，去掉骨髓，粉碎，称重，加入鹿骨重量2.4％的复合蛋白酶和鹿骨重量2.5倍的注射用水，复合蛋白酶为重量比为2.20：1的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶；45℃提取3小时，过滤，滤液用枸橼酸调ph到6.0，静置，过滤，滤液用枸橼酸钠调ph到9.0，加入鹿骨重量的0.25倍的胰酶，45℃水解2.5小时，过滤，将滤液枸橼酸调制ph值为7.5，依次用截取分子量十万超滤系统、截取分子量一万超滤系统、截取分子量八千超滤机组，进行超滤，保留透过液，冷冻干燥，得到鹿骨提取的多肽。
甜瓜籽提取的多肽的制备方法为：取甜瓜籽，粉碎，称重，加入甜瓜籽重量2.5％的复合蛋白酶和甜瓜籽重量3.5倍的注射用水，复合蛋白酶为重量比为2.25：1的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶；45℃提取2.5小时，过滤，滤液用枸橼酸调ph到6.0，静置，过滤，滤液用枸橼酸钠调ph到9.0，加入甜瓜籽重量的0.25倍的胰酶，45℃水解2小时，过滤，滤液用枸橼酸调制ph值为7.5，依次用截取分子量十万超滤系统、截取分子量一万超滤系统、截取分子量八千超滤机组，进行超滤，保留透过液，冷冻干燥，得到甜瓜籽提取得到多肽。
制剂的制备方法：鹿骨提取的多肽、甜瓜籽提取的多肽与海藻酸钠的重量比为2.4：0.8：0.095；取海藻酸钠，加入注射用水，溶解完全，加热至40℃，在该温度下加入鹿骨提取的多肽和甜瓜籽提取的多肽，保持40℃搅拌10min，冷却至室温，过滤，滤液经0.22μm滤芯过滤，浓缩至多肽含量为4.5mg/ml，灌装，得到注射液100支。
对比例：
鹿骨提取的多肽的制备方法为：取鹿骨，去掉骨髓，粉碎，称重，加入鹿骨重量2.0％的复合蛋白酶和鹿骨重量3倍的注射用水，复合蛋白酶为重量比为2.05：1的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶；40℃～50℃提取1～3小时，过滤，滤液用枸橼酸调ph到5.5，静置，过滤，滤液用枸橼酸钠调ph到8.8，加入鹿骨重量的0.2倍的胰酶，45℃水解2小时，过滤，将滤液枸橼酸调制ph值为7.0，依次用截取分子量十万超滤系统、截取分子量一万超滤系统、截取分子量八千超滤机组，进行超滤，保留透过液，冷冻干燥，得到鹿骨提取的多肽。
甜瓜籽提取的多肽的制备方法为：
取甜瓜籽，粉碎，称重，加入甜瓜籽重量2.0％的复合蛋白酶和甜瓜籽重量3倍的注射用水，复合蛋白酶为重量比为2.05：1的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶；45℃提取2小时，过滤，滤液用枸橼酸调ph到5.0，静置，过滤，滤液用枸橼酸钠调ph到8.8，加入甜瓜籽重量的0.2倍的胰酶，45℃水解2小时，过滤，滤液用枸橼酸调制ph值为7.0，依次用截取分子量十万超滤系统、截取分子量一万超滤系统、截取分子量八千超滤机组，进行超滤，保留透过液，冷冻干燥，得到甜瓜籽提取得到多肽。
取鹿骨提取液和甜瓜子提取液解冻后，按照多肽含量重量比2：0.8混合混合制得鹿瓜多肽提取液，加入活性炭，过滤，滤液用截取分子量8000的超滤膜超滤，保留透过液，透过液经0.22μm滤芯过滤，浓缩至多肽含量为4.5mg/ml，灌装，得到注射液100支。
【多肽含量测定】精密量取样品1ml，置25ml量瓶中，加0.1mol/l氢氧化钠溶液稀释至刻度，作为供试品溶液，照福林酚测定法测定。
福林酚测定法
试剂碱性铜试液取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合，作为乙液。
临用前，合并甲、乙两液，并加水至500ml。
操作法对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含0.3mg的溶液。
供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液(取福林试液中的贮备液1→16)4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5分钟，置冷水浴10分钟，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版二部附录ⅳa)，在650nm的波长处测定吸收度；以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与相应的吸收度计算回归方程。
测定法精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入碱性铜试液”起，依法测定，从回归方程计算多肽的含量，并乘以稀释倍数，即得。
【游离氨基酸测定法】
精密量取氨基酸对照品溶液和供试品溶液200μl，分别置一1ml离心管中，精密加入正亮氨酸内标溶液(1mg/ml)20μl，加入0.1mol/l异硫氰酸苯酯(pitc)乙腈溶液100μl，1mol/l三乙胺乙腈溶液100μl，混匀，室温放置1小时，加入400μl正己烷，振荡，放置10分钟，取下层溶液，用0.45μm滤器过滤。
色谱条件：色谱柱：agelaxbp-c18柱250mm*4.6mm，5μm；流动相：a液：0.1mol/l醋酸钠(ph6.5)/乙腈＝93/7，b液：乙腈/水＝4/1；检测波长：254nm；柱温：43℃；进样量：2μl。
表1流动相梯度表
取不同制剂照氨基酸测定法测定，含游离氨基酸(门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸)总量不超过500μg/ml。
【高分子量物质】照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录ⅴd)测定。
色谱条件与系统适用性试验用凝胶色谱柱(tskgelg2000sw)；流动相为乙腈－水－三氟乙酸(35:65:0.1)；流速为0.7ml/mim；检测波长为214nm。理论板数按核糖核酸酶a峰计算不低于2000。
标准曲线的制备分别取核糖核酸酶a(分子量13700)、人胰岛素(分子量5808)、胸腺肽α1(分子量3108)、生长抑素(分子量1638)适量，用流动相制成每1ml中各含0.5mg的溶液作为分子量标准溶液。分别取分子量标准溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，重复进样，其保留时间相对偏差不得大于2.0％。以各峰的保留时间为横坐标，分子量对数为纵坐标作标准曲线，进行线性回归，相关系数不得小于0.99。
测定法取供试品10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以面积归一化法计算，供试品中分子量大于10000道尔顿的组分不得过5.0％。
试验方法：稳定试验：将实施例1-5和对比例12分别置于高温70℃，相对湿度95％和光照照6000lx条件下，分别于第10天、30天取样考察各项指标，结果见下表2：
表2不同试验组制剂比较试验
试验结论：上述试验表明，采用海藻酸钠作为药用辅料制备成的制剂，多肽含量几乎不变，游离氨基酸含量、高分子物质含量变化较小；而对比例的多肽制剂，多肽含量降低较快，游离氨酸含量和高分子物质含量增加较多，充分说明，在制剂中加入海藻酸钠后，具有更好的稳定性。