海棠果水提物粉末,其制备,增强免疫作用及应用的制作方法

本发明涉及一种制备鲜海棠果水提物粉末的方法,涉及由该方法制得的鲜海棠果水提物粉末在制备免疫增强药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术：
：免疫功能低下可造成各种后果,例如诱发感染性疾病(各种流行性感冒)和皮肤病(尖锐湿疣,扁平疣,银屑病,生殖器疱疹,过敏性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜)。各种肿瘤患者(肺癌,肝癌,卵巢癌,肾癌,乳腺癌,宫颈癌,骨肉癌,消化系统肿瘤和血液系统肿瘤)患者都面临免疫功能低下而容易继发感染性疾病的境况。虽然临床有多种非特异性免疫增强剂(卡介苗,核酪注射液,左旋咪唑,聚肌胞,胸腺素,胸腺五肽和胎盘脂多糖)及多种被动性免疫增强剂(丙种球蛋白或胎盘球蛋白注射剂,干扰素,转移因子和新鲜血浆),但是这些免疫增强剂因各自的副作用或禁忌症而被局限。寻找新免疫增强剂一直是新药研究的兴趣之一。海棠果通常在秋季采摘。作为水果，海棠果既可新鲜食用也可晒干食用。民间认为海棠果具有健脾功效。发明人长期从事鲜海棠果水提物粉末的化学成分及治疗作用研究。发明人对鲜海棠果水提物粉末的化学组分进行质谱分析,发现了25种未见报道的组分,主要包括桂皮酰奎尼酸和多取代懈皮素。虽然报道过鲜水提物粉末单一组分的生物活性,但是全组分联合的生物活性并不知情。通过反复研究发明人发现,这25种组分联合可增强免疫力。与所有海棠果的已知发明相比,本发明的鲜海棠果水提物粉末可增强免疫力的发明达到了一个全新高度。根据这些认识,发明人提出了本发明。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种制备鲜海棠果水提物粉末的方法以及由该方法制备得到的鲜海棠果水提物粉末,实验证明,由本发明制备得到的鲜海棠果水提物粉末具有溶栓以及治疗缺血性中风作用。为了达到所述目的,本发明采用了以下四方面的技术手段。第一方面的技术手段是提供了一种鲜海棠果水提物粉末,分析鲜海棠果水提物粉末的质谱总离子流图谱及对应的质谱峰的25种组分认定这种鲜海棠果水提物粉末中含有18种奎尼酸类化合物及7种懈皮素类化合物；其中,18种奎尼酸类化合物为3-o-[e-2-(3-羟基-1-正丙烯羰氧)-3-羟基正丙酰氧-4,5-二甲氧-6-(5-羟基-1,3-正戊二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,6-二羧基乙酰氧-3-甲酰氧-4-(6-羧基正己羰氧)-5-羧基正丙烯酰氧桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-(3-羟基-1-正丙烯羰氧)-3-羟基正丙酰氧-4-羧基丙烯酰氧-5-(羧基-1,3-正丙二烯羰氧)-6-(3-羧基正丙烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,3-二羧基乙酰氧-4-(羧基-1,3-正丙二烯羰氧)-5-羟基-6-羧基正丙烯酰氧桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-羧基乙酰氧-3-(3-羟基正丙羰氧)-4-(羧基-1,3-正丙二烯羰氧)-5-甲氧-6-羧基正丙烯酰氧桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-羧基正丙烯酰氧-3-羟基乙酰氧-4-(4-羟基-1-正丁烯羰氧)-5-(4-羧基-1,3-正丙二烯羰氧)-6-(羧基正丙烯酰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,5-二甲氧-3-(5-羟基正戊羰氧)-4-(4-羟基-1-正丁烯羰氧)-6-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-羧基乙酰氧-3-羧基正丙烯酰氧-4-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)-6-(5-羟基正丁羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,5-二甲酰氧-3-羧基正丙酰氧-4-(6-羧基-1-正己烯羰氧)-6-(5-羟基正丁羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,5,6-三羧基乙酰氧-3-羟基正丙酰氧-4-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,4-二甲酰氧-3-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5-(3-羟基-1-正丙烯羰氧)-6-羧基正丙烯酰氧桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-(3-羟基-1-正丙烯羰氧)-3-羟基正丙烯酰氧-4-羧基正丙烯酰氧-5-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5-(6-羟基-1,3,5-正己三烯羰氧)-6-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-3-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-4-羧基正丙酰氧-5-羟基乙酰氧-6-(5-羧基-1-正戊烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,4-二甲酰氧-3-(4-羧基-1,3-丁二烯羰氧)-5-(5-羟基-1,3-戊二烯羰氧)-6-羧基正丙烯酰氧桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-甲氧-3-(4-羧基-1,3-丁二烯羰氧)-4-甲酰氧-5,6-二(3-羟基正丙羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,4-二甲酰氧-3-(4-羧基-1,3-丁二烯羰氧)-5,6-二羧基乙酰氧桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-(8-羧基-1,3,5,7-正辛四烯羰氧)-3-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-4-(5-羧基-1,3-正戊二烯羰氧)-5-(7-羧基-1,3,5-正庚三烯羰氧)-6-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸和3-o-[e-2,3,5-三(8-羧基-1,3,5,7-正辛四烯羰氧)-4-羧基乙酰氧)-6-(5-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸；其中,7种懈皮素类化合物为3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’,5’-二(4-羟基-1-正丁烯羰氧)-4’-羧基乙酰氧-6’-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-甲氧-3’-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-4’-羧基乙酰氧-5’,6’-二(4-羧基-1-正丁烯羰氧)懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-甲氧-3’-羟基丙烯酰氧-4’-羧基乙酰氧-5’-羧基正丙烯酰氧-6’-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-甲氧-3’-(8-羧基-1,3-正辛二烯羰氧)-4’,6-二(7-羧基-1,3-正庚二烯羰氧)-5’-羧基正丙烯酰氧懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’,5’-二甲氧-3’,4’-二(5-羟基-1,3-正戊二烯羰氧)-6’-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’,5’-二甲氧-3’,6’-二(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-4’-羧基正丙烯酰氧懈皮素及3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’,6’-二(6-羟基-1,3-正己二烯羰氧)-4’-(4-羟基-1-正丁烯羰氧)-5’-甲氧懈皮素。第二方面的技术手段是提出一种制备所述的鲜海棠果水提物粉末的方法,使鲜海棠果水提物粉末可以这样制得:取鲜海棠果,用自来水洗净,取果肉切碎,在蒸馏水中加热至沸,持续加热3-5小时,搅拌至果肉呈果泥状,冷却至室温,过滤,滤液粘稠,滤饼用蒸馏水洗涤两次,然后弃去滤饼,合并收集的滤液,减压浓缩,得到深红色的粉末即为鲜海棠果水提物粉末。第三方面的技术手段是提出一种制备所述的鲜海棠果水提物粉末的优选方法,即取鲜海棠果,用自来水洗净,取果肉切碎,在蒸馏水中加热至沸,持续加热4小时,220rpm/min搅拌至果肉呈果泥状。第四方面的技术手段是提出了鲜海棠果水提物粉末在制备免疫增强药物中的应用。附图说明图1为鲜海棠果水提物粉末的uplc-质谱总离子流图谱。图2为3-o-[e-2-(3-羟基-1-正丙烯羰氧)-3-羟基正丙酰氧-4,5-二甲氧-6-(5-羟基-1,3-正戊二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图3.为3-o-[e-2,6-二羧基乙酰氧-3-甲酰氧-4-(6-羧基正己羰氧)-5-羧基正丙烯酰氧桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图4为3-o-[e-2-(3-羟基-1-正丙烯羰氧)-3-羟基正丙酰氧-4-羧基丙烯酰氧-5-(羧基-1,3-正丙二烯羰氧)-6-(3-羧基正丙烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图5为3-o-[e-2,3-二羧基乙酰氧-4-(羧基-1,3-正丙二烯羰氧)-5-羟基-6-羧基正丙烯酰氧桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图6为3-o-[e-2-羧基乙酰氧-3-(3-羟基正丙羰氧)-4-(羧基-1,3-正丙二烯羰氧)-5-甲氧-6-羧基正丙烯酰氧桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图7为3-o-[e-2-羧基正丙烯酰氧-3-羟基乙酰氧-4-(4-羟基-1-正丁烯羰氧)-5-(4-羧基-1,3-正丙二烯羰氧)-6-(羧基正丙烯酰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图8为3-o-[e-2,5-二甲氧-3-(5-羟基正戊羰氧)-4-(4-羟基-1-正丁烯羰氧)-6-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图9为3-o-[e-2-羧基乙酰氧-3-羧基正丙烯酰氧-4-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)-6-(5-羟基正丁羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图10为3-o-[e-2,5-二甲酰氧-3-羧基正丙酰氧-4-(6-羧基-1-正己烯羰氧)-6-(5-羟基正丁羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图11为3-o-[e-2,5,6-三羧基乙酰氧-3-羟基正丙酰氧-4-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图12为3-o-[e-2,4-二甲酰氧-3-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5-(3-羟基-1-正丙烯羰氧)-6-羧基正丙烯酰氧桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图13为3-o-[e-2-(3-羟基-1-正丙烯羰氧)-3-羟基正丙烯酰氧-4-羧基正丙烯酰氧-5-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5-(6-羟基-1,3,5-正己三烯羰氧)-6-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图14为3-o-[e-2-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-3-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-4-羧基正丙酰氧-5-羟基乙酰氧-6-(5-羧基-1-正戊烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图15为3-o-[e-2,4-二甲酰氧-3-(4-羧基-1,3-丁二烯羰氧)-5-(5-羟基-1,3-戊二烯羰氧)-6-羧基正丙烯酰氧桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图16为3-o-[e-2-甲氧-3-(4-羧基-1,3-丁二烯羰氧)-4-甲酰氧-5,6-二(3-羟基正丙羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图17为3-o-[e-2,4-二甲酰氧-3-(4-羧基-1,3-丁二烯羰氧)-5,6-二羧基乙酰氧桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图18为3-o-[e-2-(8-羧基-1,3,5,7-正辛四烯羰氧)-3-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-4-(5-羧基-1,3-正戊二烯羰氧)-5-(7-羧基-1,3,5-正庚三烯羰氧)-6-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图19为3-o-[e-2,3,5-三(8-羧基-1,3,5,7-正辛四烯羰氧)-4-羧基乙酰氧)-6-(5-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图20为3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’,5’-二(4-羟基-1-正丁烯羰氧)-4’-羧基乙酰氧-6’-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)懈皮素及裂解产物。图21为3-o-葡萄糖苷-2’-甲氧-3’-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-4’-羧基乙酰氧-5’,6’-二(4-羧基-1-正丁烯羰氧)懈皮素及裂解产物。图22为3-o-葡萄糖苷-2’-甲氧-3’-羟基丙烯酰氧-4’-羧基乙酰氧-5’-羧基正丙烯酰氧-6’-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)懈皮素及裂解产物。图23为3-o-葡萄糖苷-2’-甲氧-3’-(8-羧基-1,3-正辛二烯羰氧)-4’,6-二(7-羧基-1,3-正庚二烯羰氧)-5’-羧基正丙烯酰氧懈皮素及裂解产物。图24为3-o-葡萄糖苷-2’,5’-二甲氧-3’,4’-二(5-羟基-1,3-正戊二烯羰氧)-6’-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)懈皮素及裂解产物。图25为3-o-葡萄糖苷-2’,5’-二甲氧-3’,6’-二(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-4’-羧基正丙烯酰氧懈皮素及裂解产物。图26为3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’,6’-二(6-羟基-1,3-正己二烯羰氧)-4’-(4-羟基-1-正丁烯羰氧)-5’-甲氧懈皮素及裂解产物。具体实施方式为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。实施例1鲜海棠果水提物粉末的制备取鲜海棠果,用自来水洗净,取100g果肉切碎,在150ml蒸馏水中加热至沸4h,搅拌(220rpm/min)至果肉呈果泥状,冷却至室温,过滤,滤液粘稠,滤饼用蒸馏水洗涤两次,每次150ml蒸馏,然后弃去滤饼,合并收集的滤液,减压浓缩,得6g深红色复溶性好的粉末,即为鲜海棠果水提物粉末。实施例2测定鲜海棠果水提物粉末的色谱和质谱离子流谱2-1.样品溶液的制备(10mg/ml)称取26.7mg鲜海棠果水提物粉末,用2.67ml超纯水中将粉末溶解。得到的溶液经超声震荡1分钟,之后再于13000r/min离心10分钟。取上清液,过0.22μm滤膜,置于样品瓶中供色谱和质谱测定用。2-2.色谱条件色谱条件色谱柱:waters，acquityhsst3柱(2.1×100mmi.d.,1.7μm)；进样体积:2μl；流动相:水(0.1％甲酸),乙腈；按照表1的梯度用流动相洗色谱柱。表1流动相梯度表2-3.测定色谱图按照上面的色谱测定条件测定并记录鲜海棠果水提物粉末的uplc色谱图(见说明书附图1)。2-4.测定离子流谱和质谱的条件电喷雾离子化模式为正(pi)及负(ni)模式。离子模式参数:毛细管电压为1000v,去溶剂气流速为800l/h,温度450℃,源温度为120℃,锥孔气流速为50l/h,喷雾气压为6bar,碎裂电压为20-45v,取样锥电压为6v,采集模式为msecontinuum分辨率模式,带电粒子的质量数与电荷数之比(m/z)数据采集范围为100-1500,低能量通道trap碎裂电压为6v,高能量通道trap碎裂电压选择梯度电压为20-60v,选取le(亮氨酸脑啡肽)为质量锁采集m/z,范围为100-1500。实施例3指定鲜海棠果水提物粉末中25种组分的结构将实施例2的uplc色谱与质谱联接,测定鲜海棠果水提物粉末的uplc-质谱。质谱条件是电喷雾离子化的正离子和负离子两种模式。离子模式参数:毛细管电压为1000v,去溶剂气流速为800l/h,温度450℃,源温度为120℃,锥孔气流速为50l/h,喷雾气压为6bar,碎裂电压为20-45v,取样锥电压为6v,采集模式为msecontinuum分辨率模式,带电粒子的质量数与电荷数之比(m/z)数据采集范围为100-1500,低能量通道trap碎裂电压为6v,高能量通道trap碎裂电压选择梯度电压为20-60v,选取le(亮氨酸脑啡肽)为质量锁采集m/z,范围为100-1500。在47分钟内分出25个独立峰。根据质谱裂解规律,这些峰(按照总离子流图谱从左到右的峰顺序)的指定见表2。这25种组分在质谱条件下的裂解产物见说明书附图2-26。表2总离子流图谱中峰对应组分保留时间,负离子质量数,结构及名称实施例4评价鲜海棠果水提物粉末对脾细胞增殖的影响为考察鲜海棠果水提物粉末的免疫增强作用,本发明按照mtt,3-(4,5-dime-thylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide,法测定了鲜海棠果水提物粉末对icr雄性小鼠的脾细胞增殖的影响。海棠果水提物粉末用rpmi-1640培养基配成终浓度为0.2mg/ml的溶液测定脾细胞增殖活性。阳性对照为胸腺五肽,购自深圳翰宇药业股份有限公司,用rpmi-1640培养基配制成浓度为50μm的溶液(终浓度是10μm)。空白对照rpmi-1640培养基购自gibco公司。体重为22g的icr雄性小鼠(购于北京维通利华动物实验技术有限公司),乙醚麻醉后脱颈牺牲,并在无菌条件下取脾。该脾用200目钢网和玻璃注射器芯研磨,得到的匀浆样脾组织用hank’s液洗两次。1500转/分离心10分钟,计数,用完全rpmi-1640培养液配成5×106个脾细胞/ml培养液的细胞悬液.后接种于96孔板中,每孔加入100μl(每孔含5×105个脾细胞,96孔板外围每孔加100μlpbs液封)。pbs由8.00gnacl,0.20gkcl,1.56gna2hpo4·12h2o及0.20gkh2po4用三蒸水溶解定容至1000ml,经高压灭菌锅灭菌制备。96孔板在37℃下在5％co2的孵箱中孵育4h,给药孔每孔加25μl海棠果水提物粉末的rpmi-1640培养基溶液或加25μl胸腺五肽的rpmi-1640培养基配溶液,轻轻晃动均匀(每板均设置rpmi-1640培养基对照)。孵育48h后,每孔加25μlmtt溶液(5mg/ml),继续孵育4h后吸去上清液,每孔加入100μldmso,振荡15min,使生成的蓝色formazan结晶充分溶解于dmso中。5min内使用酶标仪于490nm波长下测定每孔formazan光密度值。该值用标准公式换算为促使小鼠脾淋巴细胞增殖的百分率,用均值±sd％表示,代表在细胞层面的免疫增强活性。表3说明在0.2mg/ml浓度下海棠果水提物粉末促进小鼠脾淋巴细胞增殖的百分率显著性强于rpmi-1640培养基对照和浓度为10μm的胸腺五肽。可见,鲜海棠果水提物粉末有非常优秀的促进脾淋巴细胞增殖活性。表3鲜海棠果水提物粉末对脾细胞增殖的影响化合物浓度脾淋巴细胞增殖的百分率(均值±sd％)rpmi-1640培养基-0海棠果水提物粉末0.2mg/ml41.5±8.9a胸腺五肽10μm15.3±1.1a)与rpmi-1640培养基比p<0.01,与胸腺五肽比p<0.01；n＝9实施例5评价鲜海棠果水提物粉末对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响为考察鲜海棠果水提物粉末在动物层面的免疫增强作用,本发明采用小鼠碳廓清实验模型评价了鲜海棠果水提物粉末对icr雄性小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响。雄性icr小鼠(20±2g,购于北京维通利华动物实验技术有限公司)。静息饲养1天后随机分为鲜海棠果水提物粉末组,12只小鼠,口服剂量为12.5mg/kg/天,连续给药3天；胸腺五肽组,12只小鼠,腹腔注射剂量为2μmol/kg/天,连续给药3天；生理盐水组,10只小鼠,口服剂量为0.1ml/10g/天,连续给药3天。末次给药24小时后小鼠尾静脉注射5倍生理盐水稀释的印度墨水(meilunbio)。分别于注射后5min,15min两个时间点断尾取10μl血,加至2ml浓度为0.1％的nahco3水溶液中,混匀,于660nm波长下测定样本的吸光度。小鼠处死,取肝,脾称重。用吞噬指数表示小鼠的免疫能力。按照吞噬指数＝体重/(肝重+脾重)×[(logod1-logod2)/(t2-t1)]1/3计算各组小鼠巨噬细胞吞噬指数。结果见表4。数据表明在口服剂量为12.5mg/kg/天时连续给药3天,鲜海棠果水提物粉末不仅可显著性增强小鼠免疫功能,而且活性明显强于腹腔注射剂量为2μmol/kg/天连续给药3天的胸腺五肽(这里使用的胸腺五肽的腹腔注射剂量是临床使用的剂量)。可见,鲜海棠果水提物粉末有优秀的免疫增强作用。表4鲜海棠果水提物粉末对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响化合物剂量(给药途径)吞噬指数(均值±sd)生理盐水0.1ml/10g/天(口服)3.97±1.15海棠果水提物粉12.5mg//kg/天(口服)5.18±1.39a胸腺五肽2μmol/kg/天(腹腔注射)4.95±0.67a)与生理盐水比p<0.01,与胸腺五肽比p>0.05；n＝12。当前第1页12