新型RGD-壳寡糖氧化硅BCSG1-siRNA纳米粒靶向治疗乳腺癌法的制作方法

本发明涉及乳腺癌控制治疗技术领域，尤其涉及新型rgd-壳寡糖氧化硅bcsg1-sirna纳米粒靶向治疗乳腺癌法。

背景技术：

乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤的第一位，并且乳腺癌在我国不同地域的发病率都呈现逐年上升和年轻化的趋势。肿瘤的病因是变异细胞的基因物质损伤与突变。基因治疗是指将外源基因物质输送到靶细胞，以纠正或补偿基因的缺陷，从而达到治疗目的。与一般的治疗相比，基因治疗可以从病根上入手，直接作用于致病基因上，阻断致病蛋白的表达或产生大量的治疗蛋白，已被证明是一种有效的具有低副作用的治疗癌症新手段。乳腺癌特异性基因1(breastcancerspecificgene1，bcsg1)过度表达与乳腺癌的进程有关，bcsg1阳性表达提示有更大浸润和转移的倾向，而在乳腺良性肿瘤中不表达或很弱表达。bcsg1表达降低或抑制其活性可以有效地控制乳腺癌发展，提高治疗效果。rna干扰(rnainterference，rnai)是转录水平基因阻断技术，导致序列同源性基因产生特异性基因沉默现象，是一种小分子双链rna(sirna)转录后基因沉默技术，在细胞内特异性抑制靶基因表达。具有高效、高特异抑制靶基因表达的作用，但sirna在体内的易降解性和非靶向分布性，限制在治疗肿瘤方面的应用。目前基因治疗领域的主要有三种输送技术，分别是物理转染技术、病毒载药系统和非病毒载体系统：物理转染技术只能应用于体表组织，如皮肤和肌肉等，机体损伤比较大，同时转染效率低；病毒载药系统中病毒载体面临着严峻的安全性问题，病毒的免疫原性可诱发强烈的人体免疫反应，甚至引起器官衰竭而死亡，若病毒载体将携带的核酸药物插入宿主细胞的染色体中，则可能导致癌变，病毒载体在体内缺乏肿瘤靶向能力，可控性差；非病毒载药系统具有良好的安全性，基因携载量大，易于人工合成并进行各种化学修饰及大规模生产，将非病毒载体系统纳米化，可以实现非病毒纳米载体系统高效率的肿瘤靶向输送功能。但是未优化的非病毒纳米载体通过内吞作用进入细胞之后，一般情况下都会进入溶酶体，如果不能顺利逃出，就会被溶酶体酶降解，难以实现纳米药物从血液中隐身到快速黏附并进入肿瘤细胞的转换，最终搭载sirna的纳米粒仍未起到治疗肿瘤的作用。

为此，提出一种新型rgd-壳寡糖氧化硅bcsg1-sirna纳米粒靶向治疗乳腺癌法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一组用于抑制bcsg1基因表达的sirna，及合成一种表型优化的载体纳米材料用以搭载治疗性sirna来治疗乳腺癌。本载体可以在人体正常组织内sirna释放量少，稳定性好，降低sirna对正常组织的毒副作用，当进入弱酸性的肿瘤组织后加速sirna释放，发挥治疗效率，达到在特定组织中的最佳分布，具有典型的肿瘤靶向性。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

本发明根据bcsg1cdna已知序列，设计制作三条序列不同bcsg1-sirna，

1.bcsg1-sirna正义链5’-tggtgagcagcgtcaacactgt-3’

反义链5’-uuugugcagccaacccucctt-3’

2.bcsgi-sirna正义链5’-ccaaggagaatgttgtacagatt-3’

反义链5’-uuugugcagccaacccucctt-3’

3.bcsg1-sirna正义链5’-caagaccaaggagaatgttgttt-3’

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新型rgd-壳寡糖氧化硅bcsg1-sirna纳米粒靶向治疗乳腺癌法，具体包括如下步骤；

(1)制备rgd-壳寡糖-氧化硅/bcsg1-sirna纳米粒

采用反相微乳液法制备包封rgd多肽链的二氧化硅纳米粒；

步骤一；先将环己烷7.5ml和正己醇1.6ml混匀，加入rgd多肽链水溶液为内核材料，常温下搅拌30min，加入100μl氨水和100μlteos，连续搅24h，加入乙醇破乳，离心收集纳米粒，洗涤反应后的纳米粒。

步骤二；在100μl含2％冰醋酸的1％的寡糖溶液中，加入30mlrgd-二氧化硅纳米粒溶液进行搅拌，得到rgd-壳寡糖-氧化硅纳米粒；

步骤三；将等体积bcsg1-sirna溶液均预热至55℃，迅速与rgd-壳寡糖-氧化硅纳米粒混匀，涡旋30s，室温静置30min加入三聚磷酸钠溶液5ml，室温下搅拌3.5h，静置过夜，离心后弃除上清液，将载体用蒸馏水反复冲洗、抽滤，并进行干燥。

(2)rgd-壳寡糖氧化硅/bcsg1-sirna纳米粒治疗乳腺癌

静脉注射rgd-壳寡糖氧化硅/bcsg1-sirna纳米粒，通过血管系统运输，使其可通过毛细血管内网及屏障到乳腺癌组织中释放bcsg1-sirna，特异性抑制bcsg1的表达，控制乳腺癌发展，提高治疗效果。

优选的，所述sirna为冻干形式，加入lml无rnase水浓度为到20μm，缓冲液可恢复到10mmtris.hcl，ph8.0，20mmnaci，1mmedta。

优选的，所述步骤一中的洗涤用液为乙醇、水，依次使用乙醇和水进行洗涤工作。

优选的，所述步骤三中的干燥温度为40℃。

优选的，所述步骤二的搅拌时长为180r/min下混合搅拌30min。

优选的，所述半气囊右侧的外壳体上开设有挤压口，且挤压口为圆形。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：壳寡糖纳米粒带正电荷，可有效包封带负电的核苷酸sirna。壳寡糖-sirna复合物具有更小的粒径及更强的sirna转染能力，控制载药粒径100-200nm，通过血管系统运输，使其可通过毛细血管内网及屏障到乳腺癌组织中发挥效用。rgd多肽标记的壳寡糖纳米系统具有较好的sirna包封率与靶向性。rgd多肽链的ανβ3整合蛋白是肿瘤血管上皮细胞普遍表达一个肿瘤识别蛋白，肿瘤靶向性强。环状rgd(cyclicarg-gly-asp)多肽链有较好的稳定性和对ανβ3整合蛋白的高识别结合性，以(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)为交联剂，通过共价耦合方式对壳聚糖进行rgd多肽修饰。本发明rgd多肽修饰的介孔二氧化硅纳米粒可通过受体介导的细胞内吞作用提高细胞对药物的吸收率，提高癌细胞与正常细胞的选择性，高效识别肿瘤组织并快速释放sirna，是一个更好的靶向基因治疗传递系统。

附图说明

图1为本发明的实施方案图；

图2为本发明的对照组和纳米粒组对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明根据bcsg1cdna已知序列，设计制作三条序列不同的bcsg1-sirna，

1.bcsg1-sirna正义链5’-tggtgagcagcgtcaacactgt-3’

反义链5’-uuugugcagccaacccucctt-3’

2.bcsgi-sirna正义链5’-ccaaggagaatgttgtacagatt-3’

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3.bcsg1-sirna正义链5’-caagaccaaggagaatgttgttt-3’

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由美国thermofisher公司、takara公司设计3对sirna序列，提交ambion公司化学合成。ambion公司合成的sirna为冻干形式，加入lml无rnase水浓度为到20μm，缓冲液也恢复到10mmtris.hcl，ph8.0，20mmnaci，1mmedta。

请参阅图1，本发明提供的一种实施例：

(1)制备rgd-壳寡糖-氧化硅/bcsg1-sirna纳米粒

采用反相微乳液法制备包封rgd多肽链的二氧化硅纳米粒，先将环己烷7.5ml和正己醇1.6ml混匀，加入rgd多肽链水溶液为内核材料，常温下搅拌30min，加入100μl氨水和100μlteos，连续搅24h。加入乙醇破乳，离心收集纳米粒，依次用乙醇、水洗涤反应后的纳米粒。在100μl含2％冰醋酸的1％的寡糖溶液中，加入30mlrgd-二氧化硅纳米粒溶液，180r/min下混合搅拌30min，得到rgd-壳寡糖-氧化硅纳米粒。将等体积bcsg1-sirna溶液均预热至55℃，迅速与rgd-壳寡糖-氧化硅纳米粒混匀，涡旋30s，室温静置30min加入三聚磷酸钠溶液5ml，室温下搅拌3.5h，静置过夜，离心后弃除上清液，将载体用蒸馏水反复冲洗、抽滤，于40℃下干燥。

(2)rgd-壳寡糖氧化硅/bcsg1-sirna纳米粒治疗乳腺癌

静脉注射rgd-壳寡糖氧化硅/bcsg1-sirna纳米粒，通过血管系统运输，使其可通过毛细血管内网及屏障到乳腺癌组织中释放bcsg1-sirna，特异性抑制bcsg1的表达，控制乳腺癌发展，提高治疗效果。

请参阅图2，本发明提供的一种对照组和纳米粒组对比图；

将rgd-壳寡糖-氧化硅/bcsg1-sirna纳米粒采取裸鼠尾静脉注射输入到乳腺癌mcf7种植瘤裸鼠模型，实验结果显示，对照组细胞生长良好，附着在板上；纳米粒注射组细胞体积较小，形状狭窄，连接松散，活性降低，漂浮在板上的细胞较多。

壳寡糖纳米粒带正电荷，可有效包封带负电的核苷酸sirna。壳寡糖-sirna复合物具有更小的粒径及更强的sirna转染能力，控制载药粒径100-200nm，通过血管系统运输，使其可通过毛细血管内网及屏障到乳腺癌组织中发挥效用。rgd多肽标记的壳寡糖纳米系统具有较好的sirna包封率与靶向性。rgd多肽链的ανβ3整合蛋白是肿瘤血管上皮细胞普遍表达一个肿瘤识别蛋白，肿瘤靶向性强。环状rgd(cyclicarg-gly-asp)多肽链有较好的稳定性和对ανβ3整合蛋白的高识别结合性，以(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)为交联剂，通过共价耦合方式对壳聚糖进行rgd多肽修饰。

由对比图可得出，本发明rgd多肽修饰的介孔二氧化硅纳米粒可通过受体介导的细胞内吞作用提高细胞对药物的吸收率，提高癌细胞与正常细胞的选择性，高效识别肿瘤组织并快速释放sirna，是一个更好的靶向基因治疗传递系统，本载体可以在种植瘤裸鼠模型正常组织内sirna释放量少，稳定性好，降低sirna对正常组织的毒副作用，当进入弱酸性的肿瘤组织后加速sirna释放，发挥治疗效率，达到在特定组织中的最佳分布，具有典型的肿瘤靶向性。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。