靶向CD133载sPD1微泡的制备方法及在制备抑制宫颈癌的药物上的应用与流程

本发明涉及一种脂质微泡，具体为超声联合靶向cd133载spd1微泡，并将其应用于制备治疗宫颈癌。

背景技术：

宫颈癌是全世界女性最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌高居妇科恶性肿瘤第二位，发病率高且逐渐趋于年轻化，严重危害女性健康。宫颈癌主要是由于人乳头瘤病毒(hpv)感染造成，目前认为高危型hpv持续感染、机体的免疫功能下降及宫颈癌局部微环境之间的相互作用，促进宫颈癌的发生发展。当前治疗方法包括手术切除、放疗、化疗。手术是治疗宫颈癌的主要方法之一，虽然手术能暂时切除病灶，但肿瘤细胞具有很强的侵袭性和转移性，病灶并不能完全切除。辅助化疗在临床上被广泛用于术前和术后治疗，能够有效地降低肿瘤分期、减少宫旁浸润，为手术提供了良好的条件，但化疗的靶向性差，易产生耐药，全身毒副作用明显。宫颈癌是放射敏感性肿瘤，放疗对于中晚期患者和复发患者的效果是得到肯定的，但其严重的并发症给治疗带来极大的困难。因此探索宫颈癌的发病机制，寻找宫颈癌治疗的新靶点，对宫颈癌的早期诊断、治疗及预后评估具有重要的临床意义。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明提供一种超声联合靶向cd133载spd1微泡，并将其应用于制备抑制宫颈癌的药物。进一步优选方案中，应用于制备抑制u14宫颈癌细胞的药物。

所述的超声联合靶向cd133载spd1微泡是通过薄膜水化法及机械震荡法制备的生物素化脂质微泡，具体步骤包括如下：

(1)将二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素(dspe-peg2000-biotin)、硬脂酸—聚乙酰亚胺(pei-600)混于玻璃试管中，60℃水浴锅预热后，涡旋状态下充入氮气使混合液成膜于试管壁；(二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素(dspe-peg2000-biotin)、硬脂酸—聚乙酰亚胺(pei-600)，均为美国avanti公司购买)。二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素、硬脂酸—聚乙酰亚胺摩尔比75-90:3-6:3-6:2-6。

优选方案中二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素、硬脂酸—聚乙酰亚胺摩尔比85:5:5:5。

(2)将步骤(1)中成膜后的玻璃管抽真空(抽真空3h以上，使液体充分挥发)后，加入tris缓冲液，水浴超声(使玻璃管壁上的薄膜充分溶解于tris缓冲液中，液体澄清后停止水浴超声)后置于西林瓶中密封，冲入c3f8气体，冷藏保存；

(3)将步骤(2)中冷藏后的西林瓶经振荡后得到白色乳状液体(一般震荡25-30s)；将该白色乳状液体移经离心(在1000rpm的离心速度下离心3min)后弃去下层液体即为生物素化脂质微泡(下层液体为游离的脂质和杂质)；

(4)向步骤(3)中生物素化脂质微泡滴加链酶亲和素(美国avanti公司购买)，在2-4℃、避光下恒温振荡孵育，得到微泡混悬液；

(5)将步骤(4)中的微泡混悬液离心(在1000rpm的离心速度下离心3min)后，弃去下清液(以除去游离的链酶亲和素)后，采用pbs缓冲液漂洗、离心、弃下清(优选方案为重复pbs缓冲液漂洗、离心、弃下清的步骤3次)，得到微泡；

(6)将生物素化的cd133抗体(美国ebioscience公司购买)加入步骤(5)的微泡中，在2-4℃、避光的恒温振荡孵育过夜后离心(在1000rpm的离心速度下离心3min)，弃下清液(以除去游离的生物素化的cd133抗体)，加入pbs缓冲液漂洗、离心、弃下清(优选方案为重复pbs缓冲液漂洗、离心、弃下清的步骤3次)，即可得到靶向cd133微泡。

(7)将所得的靶向cd133微泡和spd1质粒(pcdna3.1(-)-spd1)室温下孵育，再用pbs冲洗，离心(在1000rpm的离心速度下离心3min)，除去未结合在微泡表面的spd1质粒，得到靶向cd133载spd1脂质微泡，即为靶向cd133载spd1微泡。

所得靶向微泡通过血球计数板计数，粒度仪测量粒径，显微镜下观察微泡形态；通过激光扫描共聚焦荧光显微镜观察。

所述的pe标记链酶亲和素的加入量相对于生物素化脂质微泡过量；生物素化的cd133抗体的加入量相对于微泡过量；spd1质粒的加入量相对于靶向cd133微泡的加入量过量。

本发明将所制备得到的靶向cd133微泡或靶向cd133载spd1微泡在制备抑制宫颈癌的药物上的应用。

所述的靶向cd133微泡或靶向cd133载spd1微泡在制备抑制u14宫颈癌细胞的药物上的应用。

所述的靶向cd133微泡或靶向cd133载spd1微泡的浓度为1×10⁷-1.5×10⁹个/ml。

将所得靶向cd133载spd1微泡与cd133高表达的hela宫颈癌细胞共同孵育，经pbs反复洗涤后，光学显微镜下观察靶向cd133微泡在细胞水平上的靶向聚集性。将制备的靶向cd133载spd1微泡和空微泡(未载入cd133抗体及spd1质粒)尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，通过超声诊断仪观察微泡在小鼠移植瘤内的超声成像效果。

实施本申请的技术方案所采用的小鼠和细胞系的情况如下：

spf级balb/c小鼠，雌性，18g左右，由三峡大学动物实验中心提供，饲养于三峡大学动物实验中心无特定病原体屏障环境中，严格spf级实验动物操作规程。u14宫颈癌细胞瘤株，由三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室提供。

小鼠宫颈癌移植瘤的建立及分组处理

从荷u14宫颈癌细胞的小鼠腹腔内抽取腹水，调整u14宫颈癌细胞浓度约2×10⁷/ml于小鼠右前腋皮下接种0.2ml，一周后形成约0.5cm皮下肿瘤结节。将成功建立的小鼠u14宫颈癌皮下移植瘤模型，随机分为5组，每组10只：对照组、空微泡组、靶向cd133微泡、靶向cd133载spd1微泡。根据分组给予不同种类微泡制剂的注射，每两天经尾静脉注射(0.2ml/只)及超声辐照瘤体一次，辐照条件：频率1mhz，功率1w/cm²，占空比50％，辐照时间90s/只，其中对照组给予相同剂量的生理盐水处理，并于治疗前测量瘤体长径(a)短径(b)，按公式v＝1/2ab²计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。治疗5次后处死部分小鼠，剥离瘤体，计算肿瘤体积及质量抑瘤率。剩余小鼠继续治疗，隔天每组取一只小鼠处死，取脾脏，分离脾细胞。

本发明的试验数据采用spss18.0软件进行统计学分析，结果用(x±s)表示，p<0.05为差别具有统计学意义。

附图说明

图1靶向cd133载spd1微泡激光共聚焦图像，其中a为可见光下微泡形态，b为pe标记(链霉亲和素)发射的红色荧光图像，c为fitc标记(抗鼠igg)的图像，反映微泡上有cd33抗体，d为b和c图叠加。

图2为pi染色的spd-1质粒在激光共聚焦图像反映微泡载dna的作用，其中，a为可见光下的微泡形态，b为pi染色的微泡的图像。

图3靶向cd133载spd1微泡稳定性试验。

图4为靶向cd133载spd1微泡载spd-1质粒结合能力的电泳图。

图5为靶向cd133载spd1微泡中spd-1质粒降解试验电泳图。

图6为靶向cd133载spd1微泡体外靶向作用。

图7为不同组处理抑制小鼠肿瘤作用，其中，a.肿瘤体积增长曲线；b.各组小鼠体重变化。

图8为不同组小鼠的肿瘤实物图。

图9为tunel试验反映靶向cd133载spd1微泡联合低频超声诱导宫颈癌细胞凋亡的作用，其中a.对照，b.空微泡，c.靶向cd133微泡，d.载spd1脂质微泡，e.靶向cd133载spd1微泡。

具体实施方式

实施例1

靶向cd133载spd1微泡的制备及其特征

1)将二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素(dspe-peg2000-biotin)、硬脂酸—聚乙酰亚胺(pei-600)按摩尔比85:5:5:5混于玻璃试管中，轻轻摇晃，充分混匀，60℃水浴锅预热后，将玻璃试管放在涡旋振荡器上，用n2吹玻璃试管中的液体，边吹边涡旋，在玻璃管壁底部形成一层均质的薄膜。

2)将成膜后的玻璃管连接真空抽气机，抽真空3h，使液体充分挥发。

3)取出玻璃试管后，向其中加入5mltris缓冲液，放入超声清洗机中水浴5min，使玻璃管壁上的薄膜充分溶解于tris缓冲液中，液体澄清后停止水浴超声。使用移液枪将其分装到5个西林瓶中并加盖密封。

4)分别向每个西林瓶中冲入c3f8气体，放入4℃冰箱保存。

5)将西林瓶固定在高速振荡仪上，调节振荡时间为30s，振荡后液体呈白色乳状液体；将液体移至离心管中，使用台式低速离心机1000rpm离心3min，离心后弃去下层液体即为普通生物素化脂质微泡，下层液体为游离的脂质和杂质。

6)取生物素化脂质微泡1ml于试管中，向其中缓慢滴加过量的pe标记链酶亲和素，在4℃、避光的恒温振荡器里孵育30min。

7)使用台式低速离心机将上述微泡混悬液以1000rpm离心3min，弃下清液以除去游离的链酶亲和素；加入pbs缓冲液漂洗、离心、弃下清，如此重复3次。

8)将生物素化的cd133单克隆抗体加入上述微泡中，在4℃、避光的恒温振荡器里孵育过夜；使用台式低速离心机将孵育后的微泡混悬液以1000rpm离心3min，弃下清液以除去游离的生物素化的cd133单克隆抗体；加入pbs缓冲液漂洗、离心、弃下清，如此重复3次，制备出靶向cd133微泡。

9)将所得的靶向cd133微泡和spd1质粒(pcdna3.1(-)-spd1)室温下孵育，再用pbs冲洗，离心(在1000rpm的离心速度下离心3min)，除去未结合在微泡表面的spd1质粒，得到靶向cd133载spd1脂质微泡，即为靶向cd133载spd1微泡。

靶向微泡的物理性质

本发明制备的目标阳离子微球具有空心球形，形态稳定，粒径均匀。靶向cd133载spd1微泡(tcmb)浓度为(2.1±0.4)×10⁸/ml。tcmb的zeta电位为(32.4±2.8)mv。平均直径为(929.7±23.9)nm。在激光共聚焦下观察目标阳离子超声微泡。a中在可见光激发下，表现出无荧光现象，b在绿色激发波下，微泡表面呈红色荧光其中，红色荧光表明pe标记的链霉亲和素与微泡表面生物素结合。c为在蓝光激发下，微泡表面呈现绿色荧光，绿色荧光表明fitc标记的第二抗体与微泡表面的cd133抗体结合，反映微泡上有cd33抗体。d为绿色和红色光完全重叠的情况下，形成黄色荧光(图1)。

靶向阳离子微泡的基因载量

在共聚焦显微镜下，观察到质粒可以结合tcmb表面，红色荧光表示被pi染色spd-1质粒(图2)，从图中可以看出pi染色的spd-1质粒在激光共聚焦显微镜下显示红色荧光并且结合在tcmb周围。

图3为携带基因的tcmb的浓度随时间而变化，从第7天开始显着下降，具有统计学意义，p<0.05。

spd-1质粒不与正常微泡(nmb)结合，但可与靶向阳离子微泡结合，1ugspd-1质粒可与接近饱和状态的25μltcmb孵育，表明基因携带能力约为20μg/10⁸微泡，即25μltcmb可以完全阻止spd-1质粒向正极移动，而nmb则不能(图4)。众所周知，质粒直接进入血液并被体内的酶破坏，模拟机体内环境，琼脂糖凝胶电泳结果显示结合tcmb表面的spd-1质粒在4分钟内保持完整，表明tcmb对基因有一定的保护效果(图5)。将spd-1质粒与微泡表面结合，然后置于4℃环境中5天，浓度未发现明显变化，表明稳定性良好。

微泡的靶向性分析

将相同浓度的nmb和tcmb(1×10⁶/ml)与u14细胞一起孵育半小时，然后在倒置显微镜下观察微泡和细胞是否结合。结果显示：nmb基本上不与细胞结合，而tcmb可以与细胞表面紧密结合，这表明自制的靶向cd133阳离子微泡可以特异性结合u14细胞(见图6所示)。

实施例2

靶向cd133载spd1微泡在制备抑制宫颈癌的药物上的应用

小鼠u14宫颈癌皮下移植瘤模型的建立

u14细胞接种于小鼠右前腋下10天后，可见肿瘤形成，多数呈圆形，直径7cm左右，少数不规则。50只小鼠用于实验，其中45只小鼠成功建模，成瘤率90％。小鼠生长状态良好，未见异常死亡。将模型小鼠随机分为五组，每组9只。

超声联合靶向载基因微泡对小鼠宫颈癌的抑制作用

各组小鼠的肿瘤抑瘤率

小鼠的右腋下出现了膨出的肿块。从小鼠的腋下切除的肿瘤组织是结节状的，质地稍硬，表面是假包膜的。它易于从周围组织剥离，并且可以在肿瘤组织中看到局部液化坏死(图8)。在治疗期间，小鼠存活良好，在将微泡注入尾静脉期间注射少量空气后，两只小鼠意外死亡。记录小鼠体重观察，第1天，第6天和第11天之间体重没有显着差异(图7b)。随着病程的延长，各组肿瘤继续增加，呈指数增长趋势，治疗组肿瘤生长速度不同程度减慢(图7a)。各组小鼠的肿瘤体积和重量抑制率如表1所示。可以看到每个治疗组小鼠的肿瘤体积和体重均有不同程度的降低，与对照组有统计学差异(*p<0.05)。cd133/spd1组的体积抑制率和体重抑制率分别为78.01％和72.25％，与其他组有统计学差异(^#p<0.05)(表1)。

表1不同组之间肿瘤抑制率的比较

注：与对照组相比，*p<0.05；各组间相比，^#p<0.05

tunel实验检测肿瘤组织凋亡

用tunel试验评估负载spd-1的tcmb联合低频超声对宫颈癌的抑制作用。红染的细胞核表明细胞处于凋亡状态，可以清楚地看到，通过不同的处理，各组小鼠的肿瘤组织中均出现了大量的凋亡细胞(图9)。与对照组相比，空微泡组细胞凋亡率无统计学差异(p>0.05)。cd133组，spd1组和cd133/spd1组凋亡率增加(*p<0.05)，cd133/spd1组凋亡率增加最明显(^#p<0.05)。