靶向组织微环境中衰老细胞的抗衰老药物D/A及其应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，更具体地，本发明涉及基于靶向组织微环境中衰老细胞的抗衰老药物d/a及其应用。

背景技术：

体内条件下衰老细胞会持续存在，并对周围细胞产生长期的影响。这主要是因为衰老细胞往往会发展为一种名为衰老相关分泌表型(senescence-associatedsecretoryphenotype，sasp)，使得这些细胞持续分泌大量促炎和微环境重塑分子。通过转录分析发现，与癌细胞一样，衰老细胞增强了“促生存网络”相关因子的表达，从而帮助它们抵抗细胞凋亡或其它形式的程序性细胞死亡。

细胞衰老通常表现为核膜内折，染色质固缩，脂褐质积累，细胞体积增大，细胞核变大，β-半乳糖苷酶活性上升以及分泌多种因子等。细胞衰老由一种或多种因素触发，激活下游的多条信号通路。除了进入永久性增殖停滞，衰老细胞常关系到许多病理学特征，包括局部炎症。细胞衰老会发生于受损细胞，并防止其在生物体内增殖。在各种外界刺激和内部因素影响下，细胞损伤可以导致明显的细胞衰老迹象；当损伤累积和达到一定的限度，组织中呈现各种肉眼可辨的组织退行变化和生理上的衰老表型。

随着年龄的增长，多数器官和组织中的衰老细胞会增多；临床条件下，这类细胞还会出现在与许多慢性疾病相关的器官中，以及放化疗之后。细胞衰老是指细胞失去功能(包括分裂和复制能力)但仍抵抗死亡的过程，已被证明可驱动多种与年龄有关的疾病，如骨质疏松、骨关节炎、动脉粥样硬化和特发性肺纤维化等。

2015年，美国斯克里普斯研究所(tsri)、梅奥诊所和其它机构的一个研究小组，报道了一类新的药物，可在动物模型中显著减缓老化过程，缓解虚弱症状，改善心脏功能，延长健康寿命。科学家将这类新的药物统称为“senolytics”。进一步的细胞培养实验表明，这些化合物确实可选择性地诱导衰老细胞的死亡。有趣的是，这两种化合物有不同的特异性，即达沙替尼(dasatinib)可消除衰老的人脂肪细胞祖细胞，而槲皮素(quercetin)则能更有效地对抗衰老的人内皮细胞和小鼠骨髓干细胞；总的来说，两者的结合方是更有效的。然而，国际范围内大量后续研究则表明，这种方法在人类正式使用前，还需要更多的测试。除了这两种药物可能在长期治疗时带来一些未知的副作用，更因其无法对组织微环境中占据数量更多的成纤维细胞等基质细胞群予以有效清除，而使其适用性和实际效果受到限制。

因此，本领域还需要进一步寻找抗衰老的有效药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供基于靶向组织微环境中衰老细胞的抗衰老药物d/a及其应用。

在本发明的第一方面，提供组合物在制备下调(包括抑制)或清除衰老细胞的药物或制剂中的用途；其中，所述的组合物包括达沙替尼和阿司匹林。

在一个优选例中，所述的细胞包括：自然衰老细胞；或受损细胞；较佳地为组织微环境中的受损细胞；更佳地为化疗或辐射治疗后的受伤细胞。

在另一优选例中，所述的辐射治疗包括：电离辐射，α、β或γ射线治疗。

在另一优选例中，所述细胞不包括(或，基本不包括)增殖态细胞。

在本发明的另一方面，提供组合物在制备延长机体生存期(寿命)的药物或制剂中的用途；其中，所述的组合物包括达沙替尼和阿司匹林。

在一个优选例中，所述的组合物还用于：降低衰老相关分泌表型(sasp)和细胞衰老标志性因子的水平；较佳地，所述的标志性因子包括(但不限于)：il6、il8、mcp2、cxcl1、gm-csf、mmp3、areg、sfrp2、angptl4、il1a(sasp标志因子)，p16^ink4a、p21^cip1(细胞衰老标志因子)。

在另一优选例中，所述的组合物还用于：提高机体机能，避免多个器官共济失调。

在另一优选例中，所述的组合物中，按照摩尔比或质量比，达沙替尼:阿司匹林为1:(2～100)；较佳地为1:(4～80)；更佳地为1:(5～50)。

在另一优选例中，按照摩尔比或质量比，达沙替尼:阿司匹林为1:6；1:8；1:10；1:12；1:15；1:20；1:30；1:50；1:60；1:70；1:90等。

在另一优选例中，达沙替尼在组合物中的终浓度为1nm～10mm，如10nm、100nm、1um、10um、100um、1mm。

在本发明的另一方面，提供一种用于下调或清除衰老细胞的药物组合物，其包括达沙替尼和阿司匹林。

在一个优选例中，所述药物组合物中还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，按照摩尔比或质量比，达沙替尼:阿司匹林为1:(2～100)；较佳地为1:(4～80)；更佳地为1:(5～50)。

在本发明的另一方面，提供所述的药物组合物的用途，用于制备下调或清除衰老细胞的药盒或试剂盒。

在本发明的另一方面，提供用于下调或清除衰老细胞的药盒或试剂盒，其包括所述的药物组合物。

在本发明的另一方面，提供用于下调或清除衰老细胞的药盒或试剂盒，其包括容器1及容器2，分别装有达沙替尼和阿司匹林；较佳地，按照摩尔比或质量比，达沙替尼:阿司匹林为1:(2～100)；较佳地为1:(4～80)；更佳地为1:(5～50)。

在另一优选例中，所述的组合物、药盒或试剂盒中，以达沙替尼和阿司匹林为活性成分，其它成分为药学载体或赋形剂等。

在另一优选例中，所述的组合物仅由达沙替尼和阿司匹林组成。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型是：口服剂，注射剂，输液剂，片剂，粉剂，胶囊剂，丸剂；较佳地为口服剂。

在本发明的另一方面，提供一种下调或清除衰老细胞的方法，包括以组合物处理衰老细胞；其中，所述的组合物包括达沙替尼和阿司匹林。

在本发明的另一方面，提供阿司匹林的用途，用于促进达沙替尼下调或清除衰老细胞的活性或延长机体生存期的活性；或

在本发明的另一方面，提供阿司匹林的用途，用于制备促进达沙替尼下调或清除衰老细胞活性或延长机体生存期活性的药物或制剂。

在本发明的另一方面，提供一种促进达沙替尼下调或清除衰老细胞的活性的方法，包括将阿司匹林与达沙替尼联合应用。

在另一优选例中，上述各用途或方法为不以临床疾病治疗为直接目的的。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、人源前列腺原代基质细胞系psc27经过化疗药物bleo处理之后第7天，以rna-seq进行全转录组测序，发现大量sasp因子呈现上调趋势。星号指示处为bcl2a1和serpinb2。

图2、使用sa-β-gal染色技术对psc27细胞进行分析。左，代表性染色图片，上下分别为增殖态(pre)和衰老(sen)细胞，标尺20μm；右，基于每组100个细胞的统计学比较。***，p<0.001。

图3、通过brdu染色确定细胞分裂和增殖状态。基于每组100个细胞的统计学比较。***，p<0.001。

图4、经过免疫荧光染色之后对dna损伤程度进行平行比较。一抗为γh2ax；根据最终每个细胞核中dnadamagefoci的数量进行分级(0foci；1-3foci；4-10foci；>10foci)。***，p<0.001。

图5、使用shrna在psc27细胞分别敲除多个生存相关基因之后，利用atplite检测细胞信号并进行平行对比。**，p<0.01；*，p<0.05。

图6、同图5类似，使用shrna在wi38细胞中分别敲除多个生存相关基因之后，利用atplite检测细胞信号并进行平行对比。**，p<0.01。

图7、使用shrna在psc27细胞分别敲除多个生存相关基因之后，利用结晶紫染色技术检测细胞存活数量并进行平行对比。**，p<0.01；*，p<0.05。

图8、同图7类似，使用shrna在wi38细胞中分别敲除多个生存相关基因之后，利用结晶紫染色技术检测细胞信号并进行平行对比。**，p<0.01。

图9、使用达沙替尼(dasatinib)在一定浓度范围(0、200、400、600、800、1000nm)内处理pre和sen状态下的psc27细胞，并分析其生存情况。每组数据对实验开始时的本组细胞数量进行规范化。*，p<0.05；**，p<0.01。

图10、同图9相似，使用dasatinib在一定浓度范围内(0、200、400、600、800、1000nm)处理pre和sen状态下的wi38细胞，并分析其生存情况。每组数据对实验开始时的本组细胞数量进行规范化。*，p<0.05；**，p<0.01。

图11、使用aspirin在一定浓度范围内(0、5、10、15、20、25、30、35、40um)处理pre和sen状态下的psc27细胞，并分析其生存情况。每组数据对实验开始时的本组细胞数量进行规范化。

图12、同图11相似，使用aspirin在一定浓度范围内(0、5、10、15、20、25、30、35、40um)处理pre和sen状态下的wi38细胞，并分析其生存情况。每组数据对实验开始时的本组细胞数量进行规范化。

图13、显微图片显示dasatinib和aspirin单独或联合使用处理sen状态下的psc27细胞，并分析其生存情况。标尺，20μm。d，dasatinib；a，aspirin。

图14、分别或者联合使用一定浓度的dasatinib(0、400、1000nm)和aspirin(0、5、10um)处理增殖或衰老时期的psc27细胞，并分析其生存情况。绿色虚线，起始细胞数量作为数据分析的基线水平。

图15、dasatinib和aspirin分别在1000nm和10μm浓度下处理增殖或衰老时期的psc27细胞，并分析其凋亡情况。d，dasatinib；a，aspirin。

图16、免疫荧光染色分析psc27细胞分别在增殖态和衰老条件下的caspase3(cleaved)和p16^ink4a的信号强度。标尺，20μm。d，dasatinib；a，aspirin。

图17、使用γ射线以一定剂量(10gy)处理野生型小鼠并在3个月之后分析其体内衰老进展情况。组化染色结果显示的p16^ink4a阳性和p21^cip1阳性细胞，经过统计之后进行组内和组间平行对比。d，dasatinib；a，aspirin。

图18、通过sa-β-gal染色技术对经过γ射线照射过的小鼠组织进行染色分析，阳性细胞比例在组内和组间平行对比。d，dasatinib；a，aspirin。ir，ionizingradiation。

图19、小鼠组织切片经过sa-β-gal染色之后的代表性图片。标尺，200μm。d，dasatinib；a，aspirin。ir，ionizingradiation。

图20、在衰老小鼠中进行预临床抗衰老试验的技术流程图。选择20个月龄的野生型小鼠进行dasatinib(5mg/kg)/aspirin(50mg/kg)联合给药处理；每两周予以一次口服给药，4个月疗程结束之后，综合分析其多项生理能力。

图21、系统检测各组实验小鼠在多个方面包括左心室射血频率，最大行走速度，悬挂耐久力，咬合力量的平均能力。n＝10。

图22、平行比较各组实验小鼠在常规体能项目包括塌车耐力和每日活动量；同时，基本生理测验包括体重和食物摄入量也予以检测并对获取的数据进行综合比较。n＝10。

图23、针对处于生命晚期极度衰老阶段的野生型小鼠进行抗衰老治疗的技术示意图。选择24-27个月龄的野生型小鼠进行dasatinib(5mg/kg)/aspirin(50mg/kg)联合给药处理；每两周予以一次口服给药，直至其出现病理症状。

图24、通过qrt-pcr检测小鼠组织微环境中基质细胞表达sasp典型外泌因子的水平。选择3月龄小鼠作为分析对比的基线，安慰剂(placebo)组和dasatinib/aspirin(d/a)组数据进行规范化并平行比较。rpl13a表达值为内参对照。n＝3。

图25、抗衰老治疗后的小鼠无病生存曲线分析(healthspan)。dasatinib/aspirin(d/a)组，n＝80；中位生存期＝296天；placebo组，n＝85。中位生存期＝244天。p＝0.0008。

图26、抗衰老治疗前后小鼠生命期间无病总生存曲线分析(lifespan)。dasatinib/aspirin(d/a)组，n＝80，中位生存期＝1026天；placebo组，n＝85，中位生存期＝974天。p＝0.0008。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究，意外地发现，将达沙替尼与阿司匹林联合应用，对于下调或清除机体衰老细胞具有极其优异的效果，从而可应用于清除组织微环境中的受损细胞如化疗或辐射治疗后的受损细胞，也可应用于清除随年龄增长而自然衰老的细胞，从而延长机体的生存时间。在此基础上形成了本发明。

如本发明所用，所述的“增殖态(pre)细胞”是指能够保持连续、活跃的分裂和不断增殖的状态的细胞。

如本发明所用，所述的“衰老(sen)细胞”是指增殖与分裂的能力降低、生理功能发生衰退的细胞。

达沙替尼

达沙替尼的英文名称为dasatinib；cas号为302962-49-8；分子式为c22h26cln7o2s。化学结构式如下式(i)：

在本发明中，所述的“达沙替尼”可以是纯净形式存在的式(i)所示的化合物，或纯度大于85％(较佳地大于90％，例如95％，98％，99％)的式(i)所示的化合物。

现有技术中，所述的式(i)化合物一般通过化学合成的方式获得，其是一种商品化的药物，因此其成品是本领域技术人员易于获得的。

在本发明中，还包括式(i)化合物的药学上可接受的盐，其也保留有达沙替尼的化学活性。所述的“药学上可接受的盐”可以是达沙替尼与无机酸或有机酸反应生成的盐。

在本发明中，还包括式(i)化合物的前体，所述的“前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(i)的一种化合物，或化学结构式(i)的一个化合物所组成的盐或溶液。

现有技术中，已知达沙替尼属多酪氨酸激酶抑制剂，用于已经治疗，包括甲磺酸伊马替尼耐药或不能耐受的慢性骨髓性白血病所有病期的成人患者；同时其也被应用于治疗对其他疗法耐药或不能耐受的费城染色体阳性的急性淋巴性白血病成人患者。然而，达沙替尼在细胞衰老相关领域的研究或应用效果并不十分理想。

阿司匹林

阿司匹林即乙酰水杨酸，其cas号为50-78-2，其是一种临床广泛使用的解热、镇痛、抗风湿药。阿司匹林的化学结构式如下：

所述的阿司匹林可通过化学合成的方式获得。此外，现有技术中已经有商品化的阿司匹林，因此其是本领域技术人员易于获得的。

在本发明中，还包括阿司匹林的药学上可接受的盐，其也保留有阿司匹林的化学活性。所述的“药学上可接受的盐”可以是阿司匹林与无机酸或有机酸反应生成的盐。

在本发明中，还包括阿司匹林的前体，所述的“前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(ii)的一种化合物，或化学结构式(ii)的一个化合物所组成的盐或溶液。

达沙替尼与阿司匹林的联用用途

经过基于大量的小分子药物的体外药效动力学筛选分析，本发明人发现达沙替尼(dasatinib)在一定浓度范围内能够造成衰老细胞存活率显著下降，而相比之下增殖态细胞基本不受影响。

另一方面，本发明人发现，水杨酸的衍生物阿司匹林在有限浓度范围内不影响衰老细胞存活。

然而，令人惊讶的是，当达沙替尼和阿司匹林同时使用时，衰老基质细胞的生存率在达沙替尼单独处理造成的结果基础上进一步降低，但增殖态细胞大致没有变化。因此，两者联合用药具有显著的增效效果，且基本上仅针对衰老细胞而不会影响增殖态细胞。

因此，本发明提供了达沙替尼与阿司匹林的混合物或组合物的用途，用于制备下调或清除衰老细胞的药物或制剂的药物组合物；以及，用于制备延长机体生存期(寿命)的药物或制剂。所述的细胞可以是自然衰老细胞或受损细胞。所述受损细胞可以是组织微环境中的受损细胞，或为化疗或辐射治疗后的受损细胞。

放射治疗是利用放射线治疗疾病尤其肿瘤的一种局部治疗方法。放射线包括放射性同位素产生的α、β、γ射线和各类x射线治疗机或加速器产生的x射线、电子线、质子束及其他粒子束等。大约70％的癌症患者在治疗癌症的过程中需要用放射治疗，约有40％的癌症可以用放疗根治。放射治疗在肿瘤治疗中的作用和地位日益突出，已成为治疗恶性肿瘤的主要手段之一。然而，其副作用也十分显著，对于组织器官的损伤能够产生不可忽视的病理影响。而本发明的达沙替尼与阿司匹林的混合物或组合物则有望被应用于缓解这种损伤。

所述的达沙替尼与阿司匹林的混合物或组合物还用于：降低衰老相关分泌表型(sasp)标志性因子的水平；较佳地，所述的标志性因子包括但不限于：il6、il8、mcp2、cxcl1、gm-csf、mmp3、areg、sfrp2、angptl4、il1a，p16^ink4a、p21^cip1。

组合物或混合物

本发明提供了一种混合物，含有：阿司匹林和达沙替尼作为活性组分。较佳地，所述的混合物中，阿司匹林与达沙替尼按照摩尔比或质量比为1:(2～100)；较佳地为1:(4～80)；更佳地为1:(5～50)。例如，按照摩尔比或质量比为1:6；1:8；1:10；1:12；1:15；1:20；1:30；1:50；1:60；1:70；1:90等。

本发明提供了一种药物组合物，含有：(a)有效量的达沙替尼或其药学上可接受的盐；(b)有效量的阿司匹林或其药学上可接受的盐；以及(c)药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的达沙替尼和阿司匹林传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。

本发明的药物组合物或混合物可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式。剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：注射剂，输液剂，片剂，胶囊剂，丸剂。其中达沙替尼或阿司匹林可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。

本发明的达沙替尼和阿司匹林的混合物或药物组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。

所用的达沙替尼和阿司匹林的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化，这可以根据临床医师的经验和建议。

本发明的具体实施例中，给出了一些达沙替尼和阿司匹林的混合物，例如一个实施例中，在细胞实验中，提出了达沙替尼和阿司匹林按照不同摩尔比或质量比的一系列给药方案。本发明中，也运用了小鼠作为实验动物，从小鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据meeh-rubner公式来进行计算：

meeh-rubner公式：a＝k×(w^2/3)/10,000。

式中a为体表面积，以m²计算；w为体重，以g计算；k为常数，随动物种类而不同，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。

所述达沙替尼和阿司匹林及其混合物或药物组合物可通过口服以及静脉内、肌内或皮下等途径给药。优选地可以是口服给药。适应于口服的药物形式包括但不限于片剂、粉剂、胶囊剂、缓释剂等。适应于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。

必要的时候，达沙替尼和阿司匹林还可与其它活性成分或药物联合给药。

本发明还提供了一种用于下调或清除衰老细胞，或延长机体生存期的药盒，所述的药盒中，含有：容器1，以及置于容器1中的达沙替尼组分；以及容器2以及置于容器2中的阿司匹林组分。

或者，所述的药盒中，含有所述的达沙替尼和阿司匹林的混合物，其中阿司匹林与达沙替尼的比例如前述。

或者，所述的药盒中，含有包括达沙替尼和阿司匹林的混合物，以及药学上可接受的载体的药物组合物。

此外，所述的药盒中还可以还有一些辅助用药的材料。

此外，所述的药盒中还可含有使用说明书，说明治疗下调或清除衰老细胞或延长机体生存期的方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、化疗药物诱导人源基质细胞衰老并呈现典型的衰老相关分泌表型

本发明人使用基因毒化疗药物博来霉素(bleomycin，bleo)处理人源前列腺原代基质细胞系psc27。psc27细胞在dmem(含10％fbs)培养基中培养，添加bleo至终浓度50μg/ml，处理后第7天以rna-seq进行全转录组测序。

增殖态(pre)和衰老(sen)细胞的界定：对于培养的细胞，通过sa-β-gal和brdu染色技术界定，衰老细胞呈现sa-β-gal阳性，增殖态细胞呈现brdu阳性。

结果表明，衰老(sen)细胞相比于增殖态(pre)细胞，基因表达谱已经发生深刻改变。在上调的基因列表中，出现大量sasp典型外泌因子，如il8、csf2、ccl20、il1a等(图1)。

与此同时，psc27细胞在sa-β-gal染色后的阳性呈现显著性升高(图2)，而brdu阳性率则显著性降低(图3)。说明细胞衰老程度有显著增加，细胞增殖显著下降。

本发明人随后检测了dna损伤程度，而针对γh2ax的免疫荧光染色(ifstaining)结果表明，bleo处理(50μg/ml终浓度，处理12小时)之后，psc27呈现更高比例的受损细胞(图4)。

实施例2、体外条件下抗衰老候选药物达沙替尼和阿司匹林对细胞存活的动力学研究

首先，本发明人考察了选择性敲除一些基因对于基质细胞的影响情况。结合psc27衰老之后发生上调表达的、同抗凋亡相关的个别基因如ptgs2、bcl2a1、serpinb2，本发明人使用shrna分别敲除了abl、efnb1、efnb3、ptgs2、bcl2a1、serpinb2，atplite。结果显示仅有abl、ptgs2、bcl2a1的缺失可以造成衰老基质细胞(psc27，人胚肺成纤维细胞wi38)存活率显著降低(图5，图6)。同样，结晶紫染色证实ptgs2、bcl2a1在这两个细胞系中对于生存具有显著影响(图7，图8)。由于同时影响衰老(sen)细胞和增殖态(pre)细胞，可能影响正常生理条件下的微环境。

用于敲除abl、ptgs2、bcl2a1的shrna靶向位点序列如下：

abl：ccgccttcatccctctcatat(seqidno:1)；

ptgs2：agagtatgcgatgtgcttaaa(seqidno:2)；

bcl2a1：gttgcggagttcataatgaat(seqidno:3)；

经过基于大量的小分子药物的体外药效动力学筛选分析，本发明人发现达沙替尼(dasatinib)在一定浓度范围内(400-1000nm)能够造成衰老psc27和wi38细胞存活率显著下降，而相比之下增殖态细胞基本未受影响(图9，图10)。

水杨酸的衍生物阿司匹林是一种临床广泛使用的解热、镇痛、抗风湿药，在体外实验中未能呈现显著的抑制衰老细胞生存的效果。在5μm条件下，不能显著降低衰老基质细胞的生存(图11，图12)。当浓度上升为10μm时，细胞存活率不变，而随后继续提高浓度至40μm时，总体效果也并未继续上升，无论psc27还是wi38均表现为类似的一种趋势(图11，图12)。这些结果表明，阿司匹林在有限浓度范围内不影响衰老细胞存活。

初步的显微图像分析结果表明，达沙替尼(1000nm)在48小时内可以大幅减少存活衰老细胞的数量，而残余细胞出现典型的凋亡特征；相比之下，阿司匹林(1μm)造成衰老细胞死亡的程度不及前者，但使得细胞呈现更加典型的纤维样拉伸，而非明显的凋亡形态；两者合用(达/阿，d/a)，无论psc27还是wi38均在数量下降的同时表现为凋亡和牵拉伴随的迹象(图13)。那么，衰老细胞的生存究竟在哪种条件下受到的影响最显著呢？

随后的药效动力实验中，达沙替尼在400nm和1000nm浓度下均造成基质细胞存活率显著降低，尽管后者更加显著(图14)。相比之下阿司匹林在5μm和10μm条件下没有显著改变衰老细胞的生存。然而，令人惊讶的是，当达沙替尼(1000nm)和阿司匹林(10μm)同时使用时，衰老基质细胞的生存率在达沙替尼(1000nm)单独处理造成的结果基础上继续降低，但增殖态细胞大致没有变化(图14)。

同时进行的凋亡检测实验结果证实，达沙替尼(1000nm)可以引起衰老细胞凋亡比例显著上升，而阿司匹林(10μm)没有类似影响；二者合用，衰老细胞凋亡程度进一步显著上扬，高于达沙替尼单独使用的效果(图15)。以上任何条件下，对照组即增殖态细胞均未受明显影响。

免疫荧光染色结果表明，相比于增殖态细胞，衰老细胞呈现细胞周期调节因子p16^ink4a表达上调，其高表达说明细胞衰老的程度上升；达沙替尼与阿司匹林(达/阿)联用，可以造成caspase3(cleaved)信号明显增强，而相比之下的增殖态细胞基本不变(图16)。caspase3(cleaved)信号增强意味着衰老细胞的细胞凋亡增加。

实施例3、放疗导致的组织微环境中衰老细胞可以通过达沙替尼和阿司匹林联用的方式得以大量去除

本发明人使用γ射线(10gy)处理野生型小鼠并在3个月之后进行深入分析。射线处理之后1个月服用达/阿，服用量为：达沙替尼5mg/kg，阿司匹林50mg/kg。

组化染色结果证实，组织微环境中有约57％的细胞出现p16^ink4a阳性，但在达/阿联用条件下却显著降低(降低幅度大约60％)。同时，相比于对照(安慰剂组)，小鼠组织中p21^cip1阳性细胞比例也显著下降(图17)。

本发明人对组织切片进行了sa-β-gal染色分析，评估结果证实电离辐射本身可以显著增加组织中衰老细胞的比例，而抗衰老药物不能。但是，在达/阿以口服给药的方式处理实验小鼠时，一次使用之后的15天之内，微环境中衰老细胞的数量即呈显著降低(图18，图19)。

这些结果证明，达/阿作为抗衰老组合药物，能够有效降低体内衰老细胞的数量，并且不需要多次治疗或者给药，而其本身对于正常生理条件下的微环境不会造成提前衰老或早衰等影响。

实施例4、自然衰老条件下达/阿通过诱导组织微环境中衰老细胞的清除可以提高多器官的生理功能

即便能够清除因抗癌治疗等外界胁迫因素造成的组织中被动衰老细胞，是否可以在正常生理条件下尤其自然衰老已经发生的前提背景下同样达到类似目的？达/阿的使用是否需要可以通过多次进行、即间歇式给药？是否会对机体的生理功能造成影响？本实施例中对此进行研究。

本发明人选择性使用了一组年龄为20个月的实验小鼠，对其施以为期4个月的间歇给药达/阿(每两周一次口服，每次服用量为：达沙替尼5mg/kg，阿司匹林50mg/kg，主要分为安慰剂组与达/阿药物组同时进行(图20)。在4个月的疗程结束时，本发明人全面评估了这两组小鼠的生理指标。

分析数据表明，达/阿组动物在多个方面包括左心室射血频率，最大行走速度，悬挂耐久力，咬合力量等检测结果中，均比对照组呈现更高的能力(图21)。同时，常规体能项目如塌车耐力(即小鼠自主跑轮能力，可以用于监测小鼠的自发性活动。这个跑轮的设计：每套设备的跑轮上有一个磁力指示器，在笼子外面有个霍尔传感器，用来监测跑轮的旋转)。和每日活动也发生明显增强，但一组基本生理测验如体重和食物摄入均未出现明显改变(图22)。

以上结果表明，在不影响基本生理功能的情况下，达/阿药物能够通过降低组织中衰老细胞的方式提高机体的多项指标，避免多个器官发生共济失调。

实施例5、极度衰老条件下达/阿通过诱导组织微环境中衰老细胞的清除可以延长总体寿命但不引起病理症状

那么，使用抗衰老药物，是否在机体已经接近生命终点时，也能起到延缓老化的作用呢？为回答这一问题，本发明人进而使用了处于更晚期阶段的一批小鼠(24-27月龄)。

通过每两周一次的口服给药，达/阿组小鼠在sasp标志性因子的表达水平上出现普遍的显著下降，包括但不限于il6、il8、mcp2、cxcl1(图24)。更重要的则是这种从24-27月龄开始每隔一周使用的口服达/阿药物(每次服用量为：达沙替尼5mg/kg，阿司匹林50mg/kg，使得小鼠的疗后阶段中位生存期显著延长，从244天显著延长到296天(图25，21.3％，p<0.001)。相应的，口服达/阿药物处理下的小鼠总生存期也出现大幅增长，从974天显著延长到1026天(图26，25.0％，p<0.001)。

因而，对于生命晚期阶段的实验动物，达/阿药物能够降低衰老细胞数量，减少较为广谱的sasp外泌因子表达，最终使得机体的生存时间显著延长。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>靶向组织微环境中衰老细胞的抗衰老药物d/a及其应用

<130>196718

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>1

ccgccttcatccctctcatat21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<400>2

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<213>智人(homosapiens)

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