本发明属于化合物的医药用途技术领域，涉及一类双氢青蒿素与喹诺酮偶联物在制备wnt信号通路激动剂中的应用。
背景技术：
双氢青蒿素是青蒿素衍生物，具有高效、低毒的抗疟活性。近年来研究表明，双氢青蒿素及其衍生物还具有抗肿瘤、抗炎、抗组织纤维化等多种生物活性。
喹诺酮药物(如环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星)是目前治疗广泛耐多药结核病(mdr-tb)的首选药物，其对结核分枝杆菌有很好的抑制或杀灭作用，且与非喹诺酮类抗结核药物不产生明显的交叉耐药性，联合用药时对这些药物的活性无抑制作用，但喹诺酮药物长期使用会促使产生对上市喹诺酮药物耐药的结核分枝杆菌。
发明人所在课题组在过去的研究中合成了双氢青蒿素与喹诺酮(克林沙星、环丙沙星、诺氟沙星、沙拉沙星)的偶联物，发现这些偶联物对结核分枝杆菌标准敏感株、临床分离敏感株、临床分离耐药株具有较好的抑菌效果，可用于制备抗结核药物。
wnt信号传导途径是由配体蛋白质wnt和膜蛋白受体结合激发的一组多下游通道的信号转导途径。经此途径，通过细胞表面受体胞内段的活化过程将细胞外的信号传递到细胞内。wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中具有至关重要的作用。wnt/β-连环蛋白(β-catenin)途径是wnt途径中的一种，该途径会使得β-catenin能够积聚并定位于细胞核，随后通过基因转导以及tcf/lef(t细胞因子/淋巴增强因子)转录因子诱导wnt最终作用的目标基因转录，诱导后续的细胞反应的发生。wnt信号通路在许多类型的干细胞中对控制细胞增殖起关键作用，最近的研究发现它也影响干细胞的分化。在人类胚胎干细胞、造血干细胞、肠道干细胞、皮肤干细胞内wnt信号通路具有维持干细胞增殖和抑制分化的功能。另外进一步的研究也发现wnt信号通路在肿瘤干细胞的分化和增殖中也表现出与正常干细胞相似的功能。因此，对wnt信号通路的小分子调节剂(激动剂或抑制剂)的研究不仅具有重要的科研意义，还具有极大的潜力开发出以wnt信号通路为靶向的药物。
技术实现要素：
本发明的目的在于考察双氢青蒿素与喹诺酮偶联物的wnt信号通路激动活性，以拓宽其制药用途。
经研究，本发明提供如下技术方案：
式i所示的双氢青蒿素与喹诺酮偶联物或其消旋体、立体异构体、氮氧化物、药学上可接受的盐在制备wnt信号通路激动剂中的应用：
式i中，
linker选自：-(ch2)n-或-co(ch2)nco-，n选自2,3或4；
x选自：c1-c3烷基；环丙基；取代或未取代的苯基，所述苯基上的取代基为一个或多个，独立选自卤素、羟基、胺基、c1-c3烷氧基或c1-c3烷基；
z选自：n或c-r1；r1选自h、卤素或c1-c3烷氧基；
y选自：
进一步，式i中，
linker选自：-(ch2)n-或-co(ch2)nco-，n选自2或3；
x选自：甲基、乙基、环丙基、苯基或卤素取代苯基；
z选自：n或c-r1；r1选自h、卤素、甲氧基或乙氧基；
y选自：
进一步，式i中，
linker选自：-ch2ch2-、-ch2ch2ch2-或-coch2ch2co-；
x选自：乙基、环丙基或4-氟苯基；
z选自：n或c-r1；r1选自h、氟、氯或甲氧基；
y选自
进一步，式i所示的双氢青蒿素与喹诺酮偶联物为以下化合物中的任一种：
进一步，式i所示的双氢青蒿素与喹诺酮偶联物为以下化合物中的任一种：tm1-1、tm1-2、tm1-3、tm1-4、tm1-5、tm1-6、tm1-7、tm1-8、tm1-9、tm1-10、tm1-11、tm1-12。
进一步，所述wnt信号通路激动剂为wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂。
除另有说明外，本发明中的术语“消旋体”是指由等量对映体构成的光学不活性的有机物。“立体异构体”是指原子组成及键接相同而原子在三维空间排列上不同的分子。“氮氧化物”是指三级氮连接氧原子形成+n-o-结构单元的有机物。“药学上可接受的盐”可以是酸性盐，也可以是碱性盐，例如无机酸盐、有机酸盐、无机碱盐或有机碱盐。
本发明的有益效果在于：本发明公开了式i所示的双氢青蒿素与喹诺酮偶联物在制备wnt信号通路激动剂中的应用，拓宽了其制药用途。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。
优选实施例中使用的主要试剂及规格:克林沙星、沙拉沙星(郑州克尔泰生化科技有限公司,>95％)；诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、加替沙星、莫西沙星(成都爱斯特贸易有限公司,ar)；依诺沙星、巴洛沙星(上海达瑞精细化工有限公司,ar)；双氢青蒿素(dha)(重庆华立武陵山制药有限公司,ar)；其余试剂均为市售化学纯或分析纯产品,未经纯化直接使用。
优选实施例中使用的主要仪器及型号:熔点测定仪(x-6,北京福凯仪器有限公司)；核磁共振仪(av-400,bruker,μsa；600dd2型,600mhz,agilent,μsa；tms为内标)；高分辨质谱仪(hresims)(varian7.0t,varian,μsa)。
实施例1.目标化合物的制备
1.目标化合物tm1系列的合成
目标化合物tm1系列(tm1-1～tm1-12)按照中国专利104418864b(双氢青蒿素与喹诺酮类化合物的偶联物及其制备方法和应用)中所述方法进行制备。
2.目标化合物tm9系列的合成
1)中间体im3的合成
中间体im3按照中国专利104418864b(双氢青蒿素与喹诺酮类化合物的偶联物及其制备方法和应用)中所述方法进行制备。
2)目标化合物tm9系列的合成
于100ml反应瓶中加入im3(1mmol)和二氯甲烷(dcm)3ml,-10℃～0℃搅拌,部分溶解,顺次加入n,n’-二异丙基乙胺(dipea,1.5mmol)、特戊酰氯(1.5mmol),-10℃～0℃继续搅拌反应约0.5h,加入fq(1mmol),薄层色谱法(tlc)监测反应进程。反应终止后,减压抽滤,滤饼用dcm(2ml×3)洗涤,收集洗液及滤液,加dcm10ml,依次以饱和nahco3水溶液、5％柠檬酸水溶液、饱和nacl水溶液(各10ml×2)洗涤,无水na2so4干燥,抽滤,滤液减压蒸干得粗品,柱层析纯化(以石油醚(pe)-乙酸乙酯(ea)混合溶剂为洗脱剂,体积比1:1),收集洗脱液,减压旋干,石油醚重结晶,tlc-紫外荧光和磷钼酸显色法检查纯度,真空干燥,即得tm9。具体合成条件及结果见表1。
表1制备tm9的实验结果
hy和x结构式中的虚线均表示连接键。
tm9系列化合物的表征数据如下：
tm9-1：淡黄色固体,m.p.:141-143℃.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:14.59(1h,s),8.63(1h,s),8.01-7.99(1h,d,j＝11.4hz),5.82-5.79(1h,dd,j＝2.4and9.6hz),5.45(1h,s),4.8-4.73(1h,m),4.49-4.48(2h,q),4.30-4.10(1h,m),3.75-3.17(5h,m),2.88-2.58(5h,m),2.40-2.35(1h,td,j＝2.4,13.8and27.6hz),2.05-2.02(2h,m),1.91-1.88(1h,m),1.80-1.77(1h,m),1.73-1.62(4h,m),1.59-1.57(3h,t,j＝6.6hz),1.49-1.48(3h,m),1.43(3h,s),1.37-1.35(2h,m),0.97-0.96(3h,d,j＝5.4hz),0.91-0.88(3h,q).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ:176.41,171.98,169.90,166.67,156.29,150.33,128.45,125.73,122.38,108.45,104.64,96.58,94.79,92.27,87.94,80.31,55.69,54.86,52.68,51.75,51.17,45.42,44.50,37.47,36.40,34.27,32.02,29.70,26.14,24.75,22.19,20.39,16.56,16.52,13.36,12.88,12.24.hrms:c36h45f2n3o10[m+na]+计算值740.2965,测定值740.29460.
tm9-2：淡黄色固体,m.p.:164-166℃.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:14.99(1h,s),8.79-8.77(1h,d,j＝7.8hz),7.82-7.78(1h,t,j＝9.6hz),5.82-5.77(1h,m),5.44-5.42(1h,d,j＝11.4hz),5.26-5.22(1h,q),4.62-4.60(1h,m),4.17-3.99(2h,m),3.90-3.81(1h,m),3.61-3.57(3h,d,j＝8.4hz),3.50-3.42(1h,m),3.26-3.25(1h,d,j＝10.2hz),3.21-3.17(1h,t,j＝12hz),2.85-2.57(5h,m),2.40-2.35(1h,m),2.32-2.26(1h,m),2.05-2.02(1h,m),1.88-1.71(5h,m),1.63-1.20(10h,m)(3h,m),1.14-1.05(2h,m),0.97-0.96(3h,d,j＝6hz),0.88-0.87(3h,d,j＝6.6hz).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ:176.92,171.94,171.25,167.18,153.06,149.86,141.21,137.29,134.54,127.99,119.00,108.23,104.63,92.23,91.68,80.30,61.35,56.63,54.45,51.73,50.55,48.31,45.39,41.17,40.59,37.45,36.38,35.66,34.24,32.02,29.61,28.60,26.12,25.36,24.73,22.18,20.37,12.25,10.71,8.70.hrms:c40h50fn3o11[m+na]+计算值790.3321,测定值790.33000.
tm9-3:淡黄色固体,m.p.:146-148℃.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:14.70(1h,s),8.83(1h,s,),7.91-7.89(1h,d,j＝12hz),5.82-5.80(1h,dd,j＝1.8and10.2hz),5.45(1h,s),4.89(1h,s),4.03-4.02(1h,t,j＝3.6hz),3.74-3.61(4h,m),3.52-3.21(5h,m),2.89-2.63(4h,m),2.61-2.59(1h,m),2.40-2.35(1h,td,j＝3.6,14.4and28.2hz),2.05-2.02(1h,m),1.91-1.61(5h,m),1.52-1.44(6h,m),1.39-1.20(6h,m),1.05-1.00(2h,m),0.97-0.96(3h,d,j＝6hz),0.89-0.88(3h,q).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ:177.16,172.00,169.91,166.80,166.74,157.01,155.34,150.25,145.82,140.04,134.19,128.00,108.17,104.64,92.27,87.95,80.31,63.65,55.48,51.74,51.07,45.42,40.56,37.47,36.40,34.26,32.03,30.95,29.70,29.63,27.25,26.14,24.75,22.19,20.38,16.55,12.26,9.84.hrms:c38h48fn3o11[m+na]+计算值764.3165,测定值764.31428.
tm9-4:淡黄色固体,m.p.:171-173℃.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:14.92(1h,s),8.71(1h,s),8.16-8.13(1h,d,j＝13.2hz),5.80-5.79(1h,d,j＝10.2hz),5.44(1h,s),4.44-4.41(2h,q),3.93-3.82(6h,m),3.74-3.73(2h,m),2.90-2.54(5h,m),2.39-2.34(1h,m),2.05-2.02(1h,m),1.91-1.88(1h,m),1.80-1.60(3h,m),1.53-1.51(3h,t,j＝7.2hz),1.43(3h,s),1.39-1.24(4h,m),1.05-1.00(1h,m),0.97-0.96(3h,d,j＝6hz),0.88-0.87(3h,d,j＝7.2hz).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ:177.27,171.87,170.19,166.96,150.62,148.37,146.77,145.11,120.84,114.50,109.65,104.65,92.35,91.70,80.30,60.57,51.72,47.98,47.00,45.40,41.50,37.47,36.38,34.25,32.03,29.63,27.75,26.13,24.74,22.18,20.38,15.19,12.24.hrms:c34h43fn4o10[m+na]+计算值709.2855,测定值709.28255.
tm9-5:淡黄色固体,m.p.:135-137℃.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:14.80-14.76(1h,d,j＝27hz),8.83-8.80(1h,t),7.88-7.82(1h,q),5.79-5.74(1h,m),5.43-5.41(1h,d,j＝11.4hz),4.74-4.72(1h,m),4.06-4.04(1h,m),3.92-3.88(1h,m),3.84-3.80(3h,m),3.55-3.41(2h,td,j＝10.2,40.8and70.8hz),3.28-3.18(1h,m),3.07-2.91(3h,m),2.86-2.51(5h,m),2.39-2.35(1h,m),2.07-1.60(10h,m),1.60-1.12(9h,m),1.03-1.00(2h,m),0.97-0.96(3h,d,j＝5.4hz),0.85-0.84(3h,d,j＝6hz).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ:177.16,171.96,171.32,166.93,155.50,149.98,139.62,133.89,128.41,125.68,107.76,104.57,92.15,91.62,80.25,62.44,58.55,54.19,53.24,51.69,50.88,45.34,40.77,37.42,36.34,34.20,31.96,30.58,29.59,28.75,28.16,27.70,26.08,24.70,22.14,20.34,12.18,9.83,9.45.hrms:c39h50fn3o11[m+na]+计算值778.3321,测定值778.33022.
3.目标化合物tm10系列的合成
1)中间体im1的合成
中间体im1按照中国专利104418864b(双氢青蒿素与喹诺酮类化合物的偶联物及其制备方法和应用)中所述方法进行制备。
2)目标化合物tm10系列的合成
于100ml圆底烧瓶中依次加入fq、无水k2co3和dmf,60℃水浴搅拌30min(fq微溶),加入im1,控温在50℃-75℃水浴搅拌反应,tlc监测反应进程。反应结束后,加水搅拌,析出大量固体,乙酸乙酯(etoac)萃取(20ml×2),合并有机相,依次用5％柠檬酸水溶液、饱和nacl水溶液(各20ml×2)洗涤,无水na2so4干燥,减压蒸干得到粗品,柱层析纯化,以dcm-meoh(体积比90:1)为洗脱剂,收集洗脱液,减压旋干,乙醚重结晶,tlc-紫外荧光和磷钼酸显色法检查纯度,真空干燥,即得tm10。具体合成条件及结果见表2。
表2制备tm10的实验结果
hy和x结构式中的虚线均表示连接键。
tm10系列化合物的表征数据如下：
tm10-3:淡黄色固体,m.p.:160-162℃.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:13.10-13.01(1h,d,j＝55.8hz),8.82-8.57(1h,m),7.89-7.82(1h,m),5.48-5.40(1h,m),4.90-4.87(1h,m),4.49-4.13(3h,m),4.07,4.02-4.00(1h,m),3.95-3.85(2h,m),3.83-3.75(3h,m),3.62-3.29(6h,m),2.74-2.72(1h,m,h-11),2.40-2.36(1h,m),2.07-2.03(1h,m),1.91-1.79(3h,m),1.64-1.47(5h,m),1.44-1.42(4h,m),1.34-1.17(4h,m),1.05-1.02(1h,m),1.01-0.89(6h,m),0.87-0.84(2h,m).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ:176.96,172.44,166.45,164.80,156.14,154.49,150.31,145.69,134.18,133.20,110.11,108.24,104.59,102.17,88.09,81.30,66.18,63.56,61.51,58.56,52.50,47.55,45.16,44.07,40.68,39.51,37.32,36.42,34.58,31.00,26.19,24.80,20.44,14.71,13.17,9.72.hrms:c36h48fn3o9[m+na]+计算值708.3267,测定值708.32519.
tm10-4:淡黄色固体,m.p.:173-175℃.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:15.05(1h,s),8.68(1h,s),8.09-8.07(1h,d,j＝13.2hz),5.49(1h,s),4.84-4.83(1h,d,j＝2.4hz),4.43-4.39(2h,q),4.00-3.99(1h,m),3.89(4h,s),3.62(1h,s),2.72-2.65(7h,m),2.40-2.35(1h,td,j＝3.6,14.4and28.2hz,),2.05-2.02(1h,m),1.91-1.74(4h,m),1.64-1.61(1h,m),1.52-1.46(5h,m),1.44(3h,s),1.34-1.32(1h,m),1.27-1.23(1h,m),0.96-0.95(3h,d,j＝6hz),0.93-0.91(3h,d,j＝7.2hz).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ:177.18,167.12,150.60,148.39,146.50,145.24,120.40,113.91,109.42,104.28,102.23,88.13,81.23,65.84,57.96,53.38,52.70,47.94,47.29,44.54,37.79,36.57,34.84,30.99,29.86,26.35,24.93,24.62,20.53,15.13,13.25.hrms:c32h43fn4o8[m+na]+计算值653.2957,测定值653.29397.
4.目标化合物tm11-1的合成
1)中间体im2的合成
中间体im2按照中国专利104418864b(双氢青蒿素与喹诺酮类化合物的偶联物及其制备方法和应用)中所述方法进行制备。
2)目标化合物tm11-1的合成
于100ml圆底烧瓶中依次加入洛美沙星(1.052g/3.0mmol)、无水k2co3和dmf,60℃水浴搅拌30min,加入im2(1.456g/3.6mmol),继续60℃水浴搅拌反应,tlc监测反应进程。9h后反应结束,加水搅拌,析出大量固体,etoac萃取(20ml×2),合并有机相,依次用5％柠檬酸水溶液、饱和nacl水溶液(各20ml×2)洗涤,无水na2so4干燥,减压蒸干得到粗品,柱层析纯化,以dcm-meoh(体积比90:1)为洗脱剂,收集洗脱液,减压旋干,乙醚重结晶,tlc-紫外荧光和磷钼酸显色法检查纯度,真空干燥,得纯品0.315g，收率16％。
tm11-1的表征数据如下：淡黄色固体,m.p.:161-163℃.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:14.45(1h,s),8.61-8.58(1h,m),7.99-7.93(1h,m),5.45-5.35(1h,m),4.82-4.80(1h,s),4.48-4.35(3h,m),4.11-4.00(2h,m),3.59-3.17(8h,m),2.67-2.62(1h,m,h-11),2.42-2.26(3h,m),2.1-2.03(3h,m),1.91-1.76(4h,m),1.71-1.66(2h,m),1.61-1.58(3h,m),1.55-1.53(2h,m),1.43-1.40(3h,m),1.28-1.24(2h,m),0.99-0.89(6h,m).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ:176.17,171.72,166.29,150.40,135.12,127.21,108.44,104.42,102.22,91.37,88.09,81.00,80.52,65.39,62.48,59.12,54.96,52.60,51.83,50.88,47.84,45.16,44.32,37.52,36.49,34.64,30.89,29.22,26.26,24.82,23.24,20.48,16.62,14.32,13.25.hrms:c35h47f2n3o8[m+na]+计算值698.3223,测定值698.32102.
实施例2.目标化合物的wnt信号通路激动活性测试
目标化合物的wnt信号通路激动活性由美国礼来公司openinnovationdrugdiscovery(oidd)program进行测试，首先进行单浓度初筛(primarysp)，然后对初步筛选出的潜力分子进行多浓度测试(primarycrc)。部分化合物的wnt信号通路激动活性测试结果见表3和表4。
表3wnt信号通路激动活性测试结果-1
表1测试了目标化合物tm1系列在不同浓度下促进小鼠成肌细胞c2c12(wnt条件培养基培养)中β-catenin蛋白在细胞核定位表达的活性，以及目标化合物tm1系列在wnt3a刺激下促进c2c12细胞向成骨细胞分化(骨原碱性磷酸酶)的半数效应浓度(ec50)以及促进c2c12细胞表达β-catenin蛋白的ec50。结果显示，在10μm测试浓度下，12个受试化合物均能促进β-catenin蛋白在c2c12细胞核定位表达，激动活性超过56％，其中7个化合物的激动活性超过90％，3个化合物的激动活性达到105％左右；在2μm测试浓度下，12个受试化合物的激动活性仍然超过41％，其中5个化合物的激动活性超过72％，最高达到98.7％，激动活性非常强；12个受试化合物中有9个化合物促进c2c12细胞表达β-catenin蛋白的ec50<0.1μm,活性最强的tm1-7的ec50值仅为0.0105μm，显示出超强的激动活性。
表4wnt信号通路激动活性测试结果-2
表2测试了目标化合物tm1系列促进脂肪干细胞(adsc,wnt条件培养基培养)表达β-catenin蛋白和碱性磷酸酶的ec50。
根据表3、表4的wnt信号通路激动活性测试结果和本领域的公知常识，本领域技术人员可以预测本发明式i所示的双氢青蒿素与喹诺酮偶联物(包括化合物tm1、tm9、tm10、tm11-1等)都或多或少具有一定的wnt信号通路激动活性，可用于制备wnt信号通路激动剂，例如wnt/β-catenin信号通路激动剂。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。