一种利用光催化原理杀灭霉菌的方法与流程

本发明属于微生物杀灭或抑制领域，特别涉及一种利用光催化原理杀灭霉菌的方法。

背景技术：

近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤药物及化疗等临床治疗手段技术的使用，以及器官移植的大量开展、艾滋病增加等，导致了日益增多的免疫力受损病人，伴随而来的是日趋增高的真菌感染发病率。全球每年死于侵袭性真菌感染的人数高达150万，其致死率高于50％。从近几年来国内外各种临床报告显示，曲霉菌引起的感染越来越多，有明显上升趋势，尤其是烟曲霉菌引起的肺部感染。在人类病原性真菌中，90％的病原体是烟曲霉菌。

烟曲霉菌等霉菌难于杀灭，一则由于它属于真核生物，与人体细胞类似，抗真菌药物同时会作用于人体细胞，产生毒副作用，因此可选择的药物较少；二则由于霉菌的繁殖器官——孢子，孢子直径2～10μm，细胞壁一般200～500nm，表面疏水，具有小、轻、干、多，休眠期长、抗辐射、抗寒冷与高温等特点，能大量悬浮于空气中，易被吸入支气管或肺泡而不易被清除。当人体抵抗力下降，霉菌孢子便会萌发并迅速生长成菌丝，侵入血液和内部组织、器官，进行更大范围的侵染。

目前，用于霉菌杀灭或抑制的常用手段有紫外光辐射、氯化、臭氧及药物杀菌等。紫外线杀菌很难将孢子彻底杀死，易发生二次菌体自修复，且紫外线可能会造成人体皮肤损伤甚至诱发癌变。氯化、臭氧杀菌虽具备高效性，但不可避免产生有毒的三卤甲烷和溴酸盐等潜在致癌副产物，对人体健康造成一定威胁^[5]。而长期使用某种药物杀菌，霉菌表面的生物靶点分子构效会发生改变，就会产生耐药性。

1985年，matsunaga等发现tio2光催化剂具有良好的光催化杀菌性能。光催化杀菌因其杀灭性能良好，无二次污染，不易产生耐药性，而且安全无毒等特点而受到人们的重视。光催化杀菌是利用光照条件下材料产生光生空穴(h⁺)和光生电子(e^-)，h⁺可将材料表面吸附的oh^-或h2o分子氧化成羟基自由基(·oh)，e^-则与材料表面吸附的o2发生作用生成超氧自由基(·o2^-)，·o2^-进一步反应可生成羟基(·oh)和过氧化氢(h2o2)等活性物质。这些活性物质可以破坏微生物的外层结构和胞内物质，导致其凋亡。然而，利用可见光催化杀灭或抑制霉菌的有少量报道，但是杀灭效果不甚理想。

如前所述，霉菌孢子具有几百纳米的细胞壁，抵御恶劣环境的能力很强，光催化活性物质很难杀灭孢子。但是当孢子开始萌发，孢子的直径增加大约2～3倍，孢子的细胞壁因吸收水分和营养而膨胀变薄，特别是芽管的顶端厚度仅几个纳米厚，使得萌发阶段的孢子抵抗力减弱，容易被杀灭。另外，萌发阶段孢子的新陈代谢作用加剧，局部极化，以及细胞超微结构和生化水平等发生变化。因此，霉菌孢子萌发阶段的这些结构、细胞学变化为光催化杀菌提供了一个可能的突破口。从实际应用来看，未萌发的孢子对人体没有危害，只有它萌发并生长为菌丝才会危害人体。因此将霉菌扼杀在“萌芽”阶段，应该是一个有效的杀菌策略。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用光催化原理杀灭霉菌的方法，以杀灭处于孢子萌发阶段的霉菌。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用光催化原理杀灭霉菌的方法，通过可见光辐照具有霉菌亲和性且能被可见光激发的光催化剂，对萌发之后的霉菌孢子进行杀灭或抑制生长。

作为优选技术方案，所述光催化剂和霉菌处于液相环境，除此之外，同样适用于气相环境，如发霉的衣服、木材、墙体等。

作为优选技术方案，所述光催化剂在液相环境中的最小浓度为0.1g/l。

作为优选技术方案，所述光催化剂具有霉菌亲和性且能被可见光激发，优选g-c3n4/bi4o7。

作为优选技术方案，所述霉菌为处于萌发阶段的孢子，优选为孵育8～10h的孢子。

作为优选技术方案，所述霉菌在液相环境中的浓度小于10⁸cfu/ml。

作为优选技术方案，所述霉菌为烟曲霉菌、黄曲霉菌、青曲霉菌或白色念珠菌，本发明以烟曲霉菌为例。

作为优选技术方案，所述可见光采用氙灯光源，光源波长为420nm～780nm，功率为100～300w，光催化剂与光源距离10～15cm，辐照时间为2～10h。

有益效果：本发明选用具有可见光激发活性的光催化剂(例如g-c3n4/bi4o7)，可见光辐照下促使光生电子-空穴在催化剂表面反应生成羟基自由基(·oh)与超氧自由基(·o2^-)等活性物质(ros)。对于烟曲霉菌孢子而言，因其外壁具有黑色素等特殊物质，赋予其强的抵御外界环境变化的能力，很难将其在可见光下杀灭。而将孢子在基础培养基(mm)中孵育8～10h至萌芽状态，其原先孢子外壁进行重新组装，抵御外界环境变化能力减弱，在可见光照射下，经光催化剂作用6h后，萌发孢子的死亡率达到80％以上，黑暗中实验确定光催化剂几乎无毒，4次循环实验发现其稳定性较好。此外，该光催化剂因本身无毒、循环性能较好、杀菌彻底且不易使菌进行二次自修复等特点，可广泛应用于需要防霉及无菌环境的可见光杀菌。

附图说明

图1为实施例1、2、3、4中空白对照与光催化剂杀烟曲霉菌2、4、6h后，再生长的菌落对比图；

其中：(a)为无光照、无光催化剂生长；(b)为光催化2h后的菌落数；(c)为光催化4h后的菌落数；(d)为光催化6h后的数。

具体实施方式

本发明的一种利用光催化原理杀灭霉菌的方法，通过可见光辐照具有霉菌亲和性且能被可见光激发的光催化剂，对萌发之后的霉菌孢子进行杀灭或抑制生长。其中，光催化剂和霉菌处于液相环境，除此之外，同样适用于气相环境，如发霉的衣服、木材、墙体等。

光催化剂在液相环境中的最小浓度为0.1g/l。

光催化剂具有具有霉菌亲和性且能被可见光激发，在可见光(420～760nm)激发下能够促进光生电子-空穴对产生羟基自由基(·oh)与超氧自由基(·o2^-)等活性物质(ros)。本发明优选g-c3n4/bi4o7。

霉菌为处于萌发阶段的孢子，优选为孵育8～10h的孢子；霉菌在液相环境中的浓度小于10⁸cfu/ml。

霉菌为烟曲霉菌、黄曲霉菌、青曲霉菌或白色念珠菌，本发明以烟曲霉菌为例。

可见光采用氙灯光源，光源波长为420nm～780nm，功率为100～300w，光催化剂与光源距离10～15cm，辐照时间为2～10h。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

下述实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例，仅对保护进行具体阐述。例如，收集孢子不仅可以用0.002％的吐温80，也可以用0.1％的吐温20。光催化液相环境及菌液稀释时不仅可以用pbs溶液，还可以使用无菌水、生理盐水等。

g-c3n4/bi4o7光催化杀灭芽管期烟曲霉菌方性能测试有普通光学显微镜、扫描电子显微镜(sem)、荧光共聚焦显微镜。其中，普通光学显微镜可观察烟曲霉菌在光催化剂作用下的长度变化，以确认某时间菌丝受到催化剂限制，不再生长。sem可以清楚地观察芽管期及后期菌丝形貌变化，以确认催化剂对菌的破损程度。荧光共聚焦显微镜则是通过对活/死细胞染色，观察细胞的活/死情况。

实施例1

步骤1，以g-c3n4/bi4o7作为光催化剂；

步骤2，收集分生孢子：将烟曲霉菌种子液划在yag培养基中培养2天并用0.002％的吐温80收集分生孢子，离心洗干净孢子后，用血球计数板计算孢子浓度；其中，离心参数为：转速为9000rpm/min，时间为3min，次数为3次；

步骤3，制备萌芽期烟曲霉菌菌株：将步骤2中分生孢子在mm培养基中孵育9小时，即得到萌芽期烟曲霉菌；

步骤4，不对萌芽时期的烟曲霉菌做任何处理，稀释后进行涂板，并培育1.5天。

对实施例1步骤4得到的菌落数计数后，作为空白对照，以便观察对萌芽时期烟曲霉菌做不同处理后的变化情况。

实施例2

步骤1，以g-c3n4/bi4o7作为光催化剂；

步骤2，收集分生孢子：将烟曲霉菌种子液划在yag培养基中培养2天并用0.002％的吐温80收集分生孢子，离心洗干净孢子后，用血球计数板计算孢子浓度；其中，离心参数为：转速为9000rpm/min，时间为3min，次数为3次；

步骤3，制备萌芽期烟曲霉菌菌株：将步骤2中分生孢子在mm培养基中孵育10小时，即得到萌芽期烟曲霉菌；

步骤4，取9.9mlpbs溶液+0.1ml菌液+50mg催化剂在烧杯中，拿到300w氙灯光源下照射，当光照时间为2h时，取出100μl，涂在yag培养基中，并培育1.5天，对菌落进行计数。

对实施例2步骤4得到的菌落数计数后，与空白对照进行对比，得到光照2h时催化剂对芽管期烟曲霉菌的杀灭率。如图1所示，该条件下光催化剂杀菌率在20％左右。

实施例3

步骤1，以g-c3n4/bi4o7作为光催化剂；

步骤2，收集分生孢子：将烟曲霉菌种子液划在yag培养基中培养2天并用0.002％的吐温80收集分生孢子，离心洗干净孢子后，用血球计数板计算孢子浓度；其中，离心参数为：转速为9000rpm/min，时间为3min，次数为3次；

步骤3，制备萌芽期烟曲霉菌菌株。将步骤2中分生孢子在mm培养基中孵育8小时，即得到萌芽期烟曲霉菌；

步骤4，取9.9mlpbs溶液+0.1ml菌液+50mg催化剂在烧杯中，拿到300w氙灯光源下照射，当光照时间为4h时，取出100μl，涂在yag培养基中，并培育1.5天，对菌落进行计数。

对实施例3步骤4得到的菌落数计数后，与空白对照进行对比，得到光照4h时催化剂对芽管期烟曲霉菌的杀灭率。如图1所示，该条件下光催化剂杀菌率在60％左右。

实施例4

步骤1，以g-c3n4/bi4o7作为光催化剂；

步骤2，收集分生孢子：将烟曲霉菌种子液划在yag培养基中培养2天并用0.002％的吐温80收集分生孢子，离心洗干净孢子后，用血球计数板计算孢子浓度；其中，离心参数为：转速为9000rpm/min，时间为3min，次数为3次；

步骤3，制备萌芽期烟曲霉菌菌株：将步骤2中分生孢子在mm培养基中孵育9小时，即得到萌芽期烟曲霉菌；

步骤4，取9.9mlpbs溶液+0.1ml菌液+50mg催化剂在烧杯中，拿到300w氙灯光源下照射，当光照时间为6h时，取出100μl，涂在yag培养基中，并培育1.5天，对菌落进行计数。

对实施例4步骤4得到的菌落数计数后，与空白对照进行对比，得到光照6h时催化剂对芽管期烟曲霉菌的杀灭率。如图1所示，该条件下光催化剂杀菌率在81％。

综上，本发明利用可见光辐照光催化剂，从而杀灭萌发之后的烟曲霉菌。光催化剂被可见光(420～760nm)激发后产生的羟基自由基(·oh)与超氧自由基(·o2^-)等活性物质(ros)能够在液相环境中破坏一定浓度的芽管期烟曲霉菌。上述实施例表面，将9.9mlpbs溶液+0.1ml菌液+50mgg-c3n4/bi4o7催化剂体系在可见光下照射6h，芽管期的烟曲霉菌死亡率达到80％以上，并且黑暗中实验确定光催化剂几乎无毒，4次循环实验发现其稳定性能较好。因此，此光催化原理杀菌可广泛应用于需要防霉及无菌环境的可见光杀菌。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。