千金文武汤在制备干预视网膜色素上皮细胞ARPE-19纤维化的药物中的应用的制作方法

本发明涉及中药技术领域，具体涉及千金文武汤在制备干预视网膜色素上皮细胞arpe-19纤维化的药物中的应用。

背景技术：

千金文武汤(qian-jin-wen-wudecoction,qwd)出自朝医学著作《东医四象新编》，由葛根、黄芩、藁本、山药、五味子、桔梗、升麻、白芷和麦冬九味药组成，主治太阴人消渴肾病，临床用于糖尿病及其并发症疗效显著。前期药理学研究表明，其对视黄醇结合蛋白的表达有抑制作用，可减缓或抑制糖尿病肾病(diabetickidneydisease,dkd)大鼠视网膜病变发病率和病程，但其具体作用机理有待探究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供千金文武汤在制备干预视网膜色素上皮细胞arpe-19纤维化的药物中的应用。

本发明提供了千金文武汤在制备干预视网膜色素上皮细胞arpe-19纤维化的药物中的应用。

本发明还提供了千金文武汤在制备抑制视网膜色素上皮细胞arpe-19纤维化的药物中的应用。

本发明还提供了千金文武汤在制备抑制高糖诱导视网膜色素上皮细胞arpe-19纤维化的药物中的应用。

优选的是，所述千金文武汤的制备用原料由葛根、黄芩、藁本、山药、五味子、桔梗、升麻、白芷和麦冬组成。

优选的是，所述千金文武汤的制备用原料由葛根10g、黄芩10g、藁本10g、山药10g、五味子5g、桔梗5g、升麻5g、白芷5g和麦冬5g组成。

本发明提供了千金文武汤在制备干预视网膜色素上皮细胞arpe-19纤维化的药物中的应用。本发明朝医方“千金文武汤”能够干预高糖诱导视网膜色素上皮细胞arpe-19的纤维化进程。试验结果表明，高糖诱导后，与正常组比较，模型组细胞明显变长呈纺锤形，且e-cad蛋白表达下调，α-sma和col-i蛋白表达上调；给药(千金文武汤)后，与模型组比较，以剂量依赖性方式上调e-cad蛋白表达，下调α-sma和col-i蛋白表达。

附图说明

图1为本发明提供的不同浓度葡萄糖无血清培养基的细胞形态学观察结果图；

图2为本发明提供的mtt实验检测千金文武汤对arpe-19细胞毒性影响结果图；

图3为本发明提供的arpe-19细胞被给予药物后细胞e-cad、α-sma和col-i蛋白表达免疫印迹图；

图4为本发明提供的arpe-19细胞被给予药物后细胞e-cad、α-sma和col-i的蛋白表达柱状图。

具体实施方式

本发明提供了千金文武汤在制备干预视网膜色素上皮细胞arpe-19纤维化的药物中的应用。本发明所述千金文武汤为朝医方“千金文武汤”，在本发明中，所述千金文武汤的制备用原料由葛根、黄芩、藁本、山药、五味子、桔梗、升麻、白芷和麦冬组成；更优选的，所述千金文武汤的制备用原料由葛根10g、黄芩10g、藁本10g、山药10g、五味子5g、桔梗5g、升麻5g、白芷5g和麦冬5g组成。本发明对所述千金文武汤的来源没有特殊限定。具体的，本发明所述千金文武汤的制备优选包括：将原料的组合物分别经10倍量和8倍量30％乙醇两次提取混合后，浓缩至料液比1:1；再以0.05g.ml^-1为上样浓度，用大孔吸附树脂(mar)进行吸附；最后将纯化后的药液再次浓缩至料液比1:1，进行冷冻干燥后，得到千金文武汤。

本发明还提供了千金文武汤在制备抑制视网膜色素上皮细胞arpe-19纤维化的药物中的应用。

本发明还提供了千金文武汤在制备抑制高糖诱导视网膜色素上皮细胞arpe-19纤维化的药物中的应用。高糖诱导后，与正常组比较，模型组细胞明显变长呈纺锤形，且e-cad蛋白表达下调，α-sma和col-i蛋白表达上调；给药后，与模型组比较，以剂量依赖性方式上调e-cad蛋白表达，下调α-sma和col-i蛋白表达。

下面结合具体实施例对本发明所述的千金文武汤在制备干预视网膜色素上皮细胞arpe-19纤维化的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

材料与仪器如表1和表2所示。

表1药材与试剂

表2主要仪器与设备

细胞培养

1、培养基的配置

取胎牛血清，在55℃下灭活。将dmem在37℃水浴条件下加热。配置含10％fbs的dmem培养基。

2、细胞复苏

把已经配制完成的培养基放入37℃的水浴锅中加热，把人视网膜色素上皮arpe-19细胞从-80℃冰箱中取出，放置于37℃的水浴锅中融化待用。在通风设备、照明设备良好的超净台中，用75％的酒精擦拭试验台，点燃酒精灯，进行培养基的瓶口灭菌，使用移液枪吸出5ml培养基，将其放置至15ml试管中，使用移液枪吸取细胞冻存液转移至试管中并离心3min(1000r·min^-1)用吸引器吸出离心后的上清液，取适量的培养基吹打细胞直至分布均匀，最后转移至培养皿中，加入10ml培养基。将培养皿放入37℃，5％浓度的co2培养箱中，培育48h。

3、细胞传代

先将dmem培养基与胰蛋白酶从冰箱中取出，在水浴锅中预热至37℃。从培养箱里将已经长满arpe-19细胞的培养皿取出，用显微镜观察其细胞数量与细胞形态是否达到铺满培养皿底部80％要求。将达到要求的培养皿转移至75％擦拭过的通风照明良好的超净台，用吸引器抽走培养皿中上层的培养基，然后用培养基冲洗培养皿，洗去漂浮的死细胞。取3ml胰蛋白酶于培养皿中，上下左右均匀摇晃约1min使细胞与胰蛋白酶充分接触，将培养皿放置于培养箱中孵育，计时3min后取出。取出培养箱中的培养皿，加入培养基。拿出两个全新的培养基，用记号笔标注为arpe-19细胞记录实验日期与实验者姓名，移入适量预先配好的培养基。取出培养箱中的培养皿，拍打使细胞滑落，在灯光下观察细胞是否呈流动状态，使用光学显微镜观察细胞分散情况，然后转移至试管中。将盛有细胞的试管放入高速离心机中3min(1000r·min^-1)，到时间后取出。用吸引器吸走上层清液，用移液枪加入培养基，将底部的细胞吹起，上下三十次。将吹打之后完全的细胞转移至新培养皿，然后进行十字摇摆，放置培养箱中培育。37℃，5％co2中培育48h。

4、细胞冻存

当培养皿中的细胞长至80％左右时将其冻存。从冰箱中拿出dmem培养基和胰蛋白酶，提早安排在37℃水浴锅中预热。戴上新的一次性无菌手套，点击关闭超净台中的紫外灯的按钮，打开排风系统和日光灯，打开酒精灯，含75％酒精擦拭超净台。将约37℃的dmem培养基、胰蛋白酶进行瓶口灭菌，转移至新的15mltube同样瓶口灭菌。用移液枪加入新的培养基洗去死细胞，然后吸走。再用移液枪移入2ml胰蛋白酶，呈十字摇摆约20次。把培养皿置于培养箱中消化3min，然后取出并拍散细胞，移入5-6mldmem培养基，吹打细胞直至均匀，用离心机以1000r·min^-1，离心3min。拿出细胞冻存管，标识表记标帜好细胞种类(arpe-19细胞)，冻存日期等信息。拿出冷冻液并用酒精灯灭菌瓶口。拿出离心后的细胞，抽净上清液，移入1.5ml冷冻液，吹打至细胞分散均匀，将细胞移入冻存管，拧紧冻存管瓶口，封口膜包裹灭菌后的冻存管，放于-80℃的冰箱，等待48h，移入液氮罐。

mtt法检测千金文武汤对arpe-19细胞的毒性

采用mtt法测定各给药物浓度对细胞的毒性，从而确定最佳给药浓度。

1、种板

将dmem培养基，胰酶放到37℃的水浴锅中加热。关闭超净台的紫外灯，打开照明与通风，戴上一次性手套，喷上75％的酒精进行消毒，继续将超净台的台面喷洒75％的酒精进行擦拭，消毒处理。把培养箱中长满arpe-19细胞的培养基拿出，放到显微镜下观察arpe-19的生长情况，将长好的arpe-19细胞拿到超净台上。点燃酒精灯，培养基，胰酶瓶口消毒处置。先用pbs洗去死细胞，用吸引器吸走pbs。往培养皿中加入3ml胰酶，十字摇晃30下，放入培养箱当中3min。拿出培养皿，加入dmem培养基终止消化，将细胞转移到试管中。放入超高速离心机中离心3min(1000r·min^-1)取出试管，吸走上清液，加入培养基吹散底部细胞，取15μl液体放入计数板，在显微镜下计数，按照提前设置好的种板密度开始稀释。把稀释好的细胞悬浮液打入96孔板中，每孔体积200μl。把96孔板放入培养箱中培养18h。

2、考察一定浓度药物对arpe-19细胞的影响

把96孔板加入千金文武汤提取物，每孔分别加入100μl药物，(每组依次给药10μg，50μg，100μg，200μg，300μg，500μg，1000μg，2000μg)然后用手轻拍孔板周围，再放入培养箱中处理18h。18h之后再加入mtt试剂(5mg·ml^-1)20μl，避光保存。具有活性的细胞可以把mtt还原为水不溶性的蓝色结晶甲臜，然后放入培养箱中继续孵育4h。4h后，加入100μl溶解液使甲臜结晶溶解，继续放入培养箱中4h后，用锡纸包好。

3数据检测

将分光光度计打开并设置好参数，检测570nm的吸光度。

当apre-19细胞被给予不同浓度的千金文武汤后，结果如图2所示，500μg组的细胞存活率为84.76％，说明给药500μg(浓度为5μg·μl^-1)时无明显毒性，且细胞生长良好。

细胞造模

将dmem培养基，胰酶放到37℃的水浴锅中加热。用胰蛋白酶消化arpe-19细胞，放入培养箱中消化3min，时间到后取出观察细胞消化状况，加入3ml培养基，吹打还没消化的细胞，将培养皿中的停止消化的arpe-19细胞悬液加入试管中，将试管放入离心机，设置好1000r·min^-1，时间3min。到时间后将试管取出，吸走上层清液，加入3ml培养基吹起底部细部，然后把细胞种入6孔板中，放置完毕后，再放进37℃，5％co2培养箱中培养；在每个培养皿中加入含不同浓度的葡萄糖无血清培养基(葡萄糖终浓度为25μmol·l^-1、5μmol/l^-1、30μmol/l^-1、40μmol·l^-1、50μmol·l^-1)处理72h。显微镜下观察细胞形态，通过造模实验得到最佳的给药浓度，用于药物处理细胞。

apre-19细胞分别给予5μmol·l^-1和50μmol·l^-1的葡萄糖无血清培养基。与5μmol·l^-1组相比，50μmol·l^-1组细胞呈现显著的纺锤形，细胞间隙变大，融合度降低，表明arpe-19细胞在葡萄糖浓度为50μmol·l^-1时模型指标更明显，故确定50μmol·l^-1作为造模的葡萄糖浓度。倒置相差显微镜下观察细胞造模结果见图1，其中，a：给予5μmol·l^-1葡萄糖；b：给予50μmol·l^-1葡萄糖。

细胞分组及给药

将细胞移至6孔板中，生长18h后，观察细胞的生长情况。在每孔中加入细胞造模中确定葡萄糖浓度的无血清培养基处理72h。细胞分为空白组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，空白组、模型组不给予药物，低剂量组给药浓度为0.1μg·μl^-1，中剂量组给药浓度为2μg·μl^-1，高剂量组给药浓度为5μg·μl^-1。给药后培养观察72h。吸取每孔的药物，然后每孔给予裂解液130μl，冷冻过夜。

蛋白免疫印迹实验

1、提取蛋白质

准备细胞刮子，pbs缓冲液，用细胞刮子用力的刮六孔板，刮掉粘在六孔板上的蛋白质，每刮完一组用pbs缓冲液冲洗细胞刮子。用移液枪将六孔板中的蛋白质悬液，转移至2ml的tube中。将tube放入冷冻离心机，4℃离心10min，转速13000。用移液枪将离心后的上层清液转移至1.5ml的tube中，将tube放入-20℃保存。13000r·min^-1。收集上清液，放入-20℃保存。

2、制胶

选取1cm配胶用玻璃板，清洗干净，用夹子夹好后用三蒸水验漏；从冰箱中拿出aa、aps，按照配胶表配好8％和12％的分离胶和浓缩胶(先不加temed)，震荡混匀，确定玻璃板不漏，倒出三蒸水并用纸把水吸干，分离胶中加入temed并震荡混匀，保持充分布满，在确保分离胶高度的前提下，用1ml的移液枪注入到玻璃板中，留出浓缩胶所需空间，再用甲醇填满，左右晃动使胶面平整，静置。待分离胶凝固后(约1h)，倒出甲醇，用三蒸水洗三次，用纸吸干，试梳子，确保梳子于玻璃板贴合。浓缩胶加入temed并震荡混匀，动作迅速的注入玻璃板，然后迅速的插入梳子，应该避免气泡的产生；静置待浓缩胶完全凝固后拔出梳子，清洗样孔，确保样孔中没有浓缩胶，擦干水待用。配好的胶板若不立即使用，可用锡纸或保鲜膜包好放入4℃冰箱中冷藏。

3、电泳

将胶板用夹子夹好并放入电泳槽中，小玻璃板侧朝内；两板之间加入新的1×runningbuffer，没过内侧小玻璃板，周围加入回收的runningbuffer；用10μl的移液枪先在第一个胶孔加入1μlmark，再依次加入样品；电泳，恒流(30ma)跑胶，当蛋白质样品到达凝胶底部1cm时(约1h)，关闭电源。

4、转印

电泳结束后，准备两张pvdf膜浸泡在适量甲醇中；在合适的容器中倒入transbuffer，依次放入夹子、转印用棉花、pvdf膜。撬开胶板，刮去浓缩胶，划开分离胶四周，迅速将胶放在pvdf膜上，盖上棉花，夹好夹子；将固定夹放入转移罐中，倒入转换缓冲液，并将转移罐放入冰中。开始转印，恒压65v转印1h，恒压35v转印1h。

5、洗膜，贴抗体

量取100ml0.05％pbs-t20，再称取5g洗膜用牛奶溶于其中，混合均匀，将转印完的pvdf膜放入牛奶中封闭1h；然后取出pvdf膜用0.05％pbs-t20清洗四次，依次为15min、5min、5min、5min；孵育相应的一抗(抗体比例详见说明书，用含5％w·v^-1脱脂奶粉或bsa的pbs-t20缓冲液稀释)，摇床上室温下摇晃4h或4℃孵育12h；贴完一抗后，再用0.05％pbs-t20依次清洗15min、5min、5min、5min；贴二抗:加入过氧化酶标记的相应的二抗(使用含2.5％w·v^-1脱脂奶粉的pbs-t20缓冲液配制)，摇床上室温孵育1h；二抗摇完后取出pvdf膜，用0.05％pbs-t20依次清洗15min、15min、15min。

6、显像

将洗好的转印膜放到暗室里，各取a液和b液1ml，用移液枪混合均匀；准备显影剂和清水，打开红外灯关闭日光灯，注意不能曝光，剪取胶片；用镊子取出膜后，用纸把膜上的混合液体吸走，将膜放在混合物中，用移液枪冲洗；将漂洗好的膜放进夹板中塑料薄膜内，用纸去除气泡并固定，观察是否有荧光；若荧光较明显，剪好的膜片被放在胶片上，关闭夹板片刻后，立即取出胶片(注意不能错位，以防显出的条带模糊；若荧光不明显或者未观察到荧光，则关上夹板置于暗处一段时间后再进行后续操作(关闭夹子防止膜变干)；在显影液中从最底部放入薄膜，并将其完全浸泡，当看到出现条带较清晰的斑点时，即可取出胶片放入水中清洗，洗净后再放入定影液中进行定影，如图3所示。

arpe-19细胞被给予药物后细胞e-cad、α-sma和col-i蛋白的表达情况结果如图4(###:p<0.001vs空白组,***:p<0.001**:p<0.01vs模型组)所示，由图3和图4可知，与空白组相比，模型组e-cad的表达水平明显降低，col-i、α-sma的表达水平明显升高，表明模型建立。当给予各浓度药物后，药物以剂量依赖性方式下调α-sma与col-i的表达，上调e-cad的表达。这些结果表明千金文武汤能干预高糖诱导arpe-19细胞的纤维化进程。

本发明实验结果表明，高糖诱导后，与正常组比较，模型组细胞明显变长呈纺锤形，且e-cad蛋白表达下调，α-sma和col-i蛋白表达上调；给药后，与模型组比较，以剂量依赖性方式上调e-cad蛋白表达，下调α-sma和col-i蛋白表达。

朝医方“千金文武汤”能够干预高糖诱导视网膜色素上皮细胞arpe-19的纤维化进程。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。