银杏内酯B在制备胶质瘤细胞活性抑制剂中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及银杏内酯b在制备胶质瘤细胞活性抑制剂中的应用。

背景技术：

恶性胶质瘤(glioblastoma，gbm)是中枢神经系统肿瘤中恶性度最高的一种，其患者五年以上生存率低于10％。胶质瘤生长特点为浸润性生长，与正常脑组织无明显界限，所以理论上手术无法完全切除，依旧存在治疗困难和术后预后性差等问题。尽管十年以来对恶性胶质瘤的治疗手段有所进步，就目前来说化疗依旧是治疗该疾病最为成熟的方法。但是就目前的临床应用来看，传统化疗药物还存在副作用大，肿瘤抗药性以及无法穿透血脑屏障等问题。所以目前急需一种效果更强、对正常细胞毒副作用更小的小分子药物来治疗恶性胶质瘤。

近年以来，生物学家研究了大量从草药中提取出来的混合物作为一种新的抗癌药物来源，而且已经有数种天然产物被证实对多种癌症，如白血病、宫颈癌、卵巢癌具有明显的抗癌作用。银杏内酯化合物属于萜类化合物，由倍半萜内酯和二萜内酯组成，是银杏叶中一类重要的活性成分。白果内酯属倍半萜内酯，是目前从银杏叶中发现的唯一的一个倍半萜内酯化合物。其中在银杏内酯中银杏内酯b(bn52021)的活性生理活性最强，是迄今发现的最强的血小板活化因子拮抗剂，可在临床上用于治疗血栓、急性胰腺炎和心血管疾病，还可用于转移性癌症的治疗，对损伤神经元也有保护作用，同时具有抗氧化，延缓衰老的作用。

专利号cn200510109596.x，专利名称为“一种含银杏内酯b药物组合物及其制备方法与用途”，具体公开了一种含银杏内酯b药物组合物，包括磷酸川芎嗪和银杏内酯b，药物组合物中所含磷酸川芎嗪重量为银杏内酯b重量的10～500倍，还公开了该药物组合物的制备方法，本发明药物组合物为磷酸川芎嗪和银杏内酯b组成的复方制剂，通过二者相互补充协同作用于机体，充分发挥活血化瘀、抗血小板凝集、扩张血管、改善微循环作用，可应用于制备缺血性心脑血管疾病的药物。

银杏内酯b作为一种长期的心脑血管疾病治疗药物，对一些转移性癌症有一定治疗作用，但目前银杏内酯b在药物研究中，尚未有其对恶性胶质瘤的抗癌作用的报道。

技术实现要素：

本发明是为了克服现有技术的银杏内酯b尚未有其对恶性胶质瘤的抗癌作用的问题，公开了银杏内酯b在制备胶质瘤细胞活性抑制剂中的应用，通过研究发现银杏内酯b可以作为一种活性物质，对恶性胶质瘤有一定的治疗作用，天然产物，几乎无毒，副作用非常小；银杏内酯b能对胶质瘤细胞的迁移和增殖有不同程度的抑制，还会降低atp酶活力从而影响其代谢水平，阻滞细胞周期以及诱导凋亡，为恶性脑胶质瘤的治疗提供了一种新的化疗药物的备选方案。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

银杏内酯b及其衍生物在制备胶质瘤细胞活性抑制剂中的应用。

一种胶质瘤细胞活性抑制剂，所述胶质瘤细胞活性抑制剂中包含银杏内酯b及其衍生物，银杏内酯b的具体结构式如下：

作为优选，所述胶质瘤细胞包含胶质瘤细胞u-87mg、胶质瘤细胞u-251mg或胶质瘤细胞a172中的一种或多种。

所述的胶质瘤细胞活性抑制剂在恶性脑胶质瘤化疗药物中的应用。

关于银杏内酯b作用于胶质瘤的分子机理，已有的研究表明银杏内酯b是迄今发现的最强的血小板活化因子(paf)拮抗剂，而已有数据表明血小板活化因子受体(pafr)在胶质瘤中特异性高表达，因此银杏内酯b极有可能通过抑制pafr来作用于胶质瘤。另外银杏内酯b还能通过改变ras/mapk信号诱导细胞分化，从而抑制胶质瘤的进展。

作为优选，所述化疗药物含有银杏内酯b及其上述银杏内酯b在药学上可接受的酯中的一种或多种。

作为优选，银杏内酯b对胶质瘤细胞a172的给药浓度为1095-1100μm，对胶质瘤细胞u-87mg的给药浓度为1085-1090μm、胶质瘤细胞u-251mg的给药浓度为995-1000μm。

作为优选，所述化疗药物包括银杏内酯b的抑制剂和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

作为优选，所述化疗药物的恶性脑胶质瘤化疗药物为口服制剂或注射制剂。

作为优选，所述口服制剂的剂型为胶囊或片剂。

作为优选，所述口服制剂的剂量约为5-5.2mg/kg体重，进一步优选为5mg/kg体重。

因此，本发明具有如下有益效果：

(1)通过研究发现银杏内酯b可以作为一种活性物质，对恶性胶质瘤有较好的治疗作用，是天然产物，几乎无毒；

(2)银杏内酯b能对胶质瘤细胞的迁移和增殖有显著的抑制作用，严格控制胶质瘤细胞的增殖率，对生物体的副作用小；

(3)还会降低atp酶活力从而影响其代谢水平，阻滞细胞周期以及诱导凋亡，从源头上遏制了胶质瘤细胞的形成，所以具有极佳的治疗效果；

(4)为恶性脑胶质瘤的治疗提供了一种新的化疗药物的备选方案，丰富了恶性脑胶质瘤的抑制药物种类。

附图说明

图1是银杏内酯b对三种胶质瘤细胞系细胞增殖抑制作用的量效关系曲线图。

图2是银杏内酯b作用下u-87mg细胞生长曲线。

图3是不同浓度银杏内酯b对三种胶质瘤细胞系生长抑制及细胞形态学变化的光镜图。

图4是银杏内酯b影响三种胶质瘤细胞细胞迁移距离的统计图。

图5是brdu标记法分析银杏内酯b对胶质瘤细胞增殖影响(5(a))的相应定量结果柱状图(5(b))。

图6是银杏内酯b对c57b6小鼠颅内胶质瘤生长的抑制效果(6(a))及统计柱状图(6(b))。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。

实施例

i、银杏内酯b对胶质瘤细胞u-87mg增殖和毒性的影响

用含10％胎牛血清的dmem培养基配制胶质瘤细胞u-87mg(购自atcc)，加入96孔板中，每孔100μl(5000个细胞/孔)的。将培养板在培养箱预培养24小时(37℃，5％co2)。分别向培养板的孔中加入含有终浓度0μm、250μm、500μm、1000μm、2000μm银杏内酯b的含10％胎牛血清的dmem培养基，每孔200μl。将培养板在培养箱孵育48小时。弃去培养基换成含有10％cck8的dmem培养基。将培养板在培养箱内孵育1小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度(od值)。以不含胶质瘤细胞u-87mg和银杏内酯b，含cck8的培养孔为空白对照，以不含银杏内酯b，含胶质瘤细胞u-87mg和cck8的培养孔为阴性对照。

活力计算：细胞活力*(％)＝[a(加药)-a(空白)]/[a(0加药)-a(空白)]×100

a(加药)：含胶质瘤细胞u-87mg、cck8和银杏内酯b的孔的吸光度

a(空白)：具有培养基和cck8而没有胶质瘤细胞u-87mg和银杏内酯b的孔的吸光度

a(0加药)：具有胶质瘤细胞u-87mg、cck8而没有银杏内酯b的孔的吸光度

*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

同样条件下，分别用胶质瘤细胞系a172、u-251mg代替u-87mg进行试验，结果如图1所示，银杏内酯b对性胶质瘤细胞系a172、u-87mg、u-251mg的半抑制浓度分别为1098μm、1087μm、996μm。

ii、银杏内酯b对不同种类胶质瘤细胞增殖的抑制

用含10％胎牛血清的dmem培养基在96孔板中配置100μl的胶质瘤细胞u-87mg(5000个/孔)。将培养板在培养箱预培养24小时(37℃，5％co2)。向培养板加入含有0.5μm银杏内酯b的含10％胎牛血清的dmem培养基，每孔200μl，以加入等量pbs替代银杏内酯b的含10％胎牛血清的dmem培养基作为对照。将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(0-6天)，每天在固定时间对加入和未加入药物的孔板中的细胞进行计数并绘制生长曲线。

同样条件下，分别用胶质瘤细胞系a172、u-251mg代替u-87mg进行试验，结果如图2所示，未经药物处理的细胞数目正常增加，而被银杏内酯b处理的细胞增殖速度极慢，并在高浓度药物下出现凋亡。

iii、银杏内酯b对胶质瘤迁移能力的影响

1、细胞样品的准备

取对数生长的a-172mg细胞铺在六孔板中，细胞汇合度至80％左右时，用中号枪头进行划痕实验，pbs清洗2遍洗去漂浮的细胞，加入不含血清的分别含有中浓度(1000μm)和低浓度(500μm)银杏内酯b以及不含银杏内酯b的dmem培养基。

2、拍照观察

在显微镜下每隔24小时对划痕部位拍照，并对划痕宽度进行统计分析。

同样条件下，以u251细胞代替a-172mg细胞进行试验，结果如图4所示，统计结果图4中d表示经过银杏内酯b处理的a-172mg细胞与未加药处理的细胞相比迁移能力显著降低。

iiii、brdu标记法分析银杏内酯b对细胞增殖的影响

1、细胞样品的准备：

取对数生长的u-87mg细胞，培养至汇合度为70％时，分别加入终浓度500μm、1000μm银杏内酯b继续培养48h。

2、brdu标记：

a.48小时后加入终浓度为90g/l的brdu(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)，于37℃环境中孵育2小时。

b.培养基孵育2小时后，弃培养基，pbs清洗细胞2次，每次5分钟。

3、细胞固定化：

每孔加入200μl细胞固定液(4％多聚甲醛)室温孵育30分钟，弃固定液，pbs清洗3次，每次5分钟。

4、hcl固定：

向步骤3的培养孔中每孔加入足以覆盖细胞的2m的hcl水溶液，于37℃环境中孵育20分钟后，pbs清洗2次，再每孔加入足以覆盖细胞的ph8.5、0.1m硼酸缓冲液静置孵育10分钟，pbs清洗3次。

5、封闭：

用5％的羊血清室温封闭1小时。

6、孵育一抗、二抗

一抗(小鼠brdu单抗)孵育4℃过夜，pbs洗涤3次后，孵育二抗(goat-anti-mouseigg1(r1),594)1小时，在二抗孵育结束前5分钟按照体积比1:10000的比例加入dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，pbs清洗三次。荧光显微镜下拍照。

同样条件下，以a172细胞代替u-87mg细胞进行试验，结果如图5所示，统计结果图5中b表示经过银杏内酯b处理的u-87mg细胞与未加药处理的细胞相比增殖程度显著降低。

7、动物实验

在3-4周c57b6小鼠颅内移植5×10⁴～1×10⁵的gl261细胞，约2周即可形成脑胶质瘤，设立银杏内酯b药物处理组(口服灌胃)和对照组，结果如图6所示：通过口服给药5mg/kg体重的银杏内酯b能有效抑制颅内胶质瘤的生长，统计结果如图6中b所示。

图1中的增殖曲线，三种肿瘤细胞系与对照正常胶质细胞在不同银杏内酯b浓度下的细胞活性，并据此计算不同银杏内酯b对细胞系的半致死剂量；图2生长曲线(u87)，不同浓度银杏内酯b对胶质瘤细胞u87生长随时间的变化，可见半致死浓度下银杏内酯b完全抑制了胶质瘤细胞的生长，而1/2半致死浓度银杏内酯b处理也可部分抑制胶质瘤细胞的生长；图3细胞形态观察，不同浓度银杏内酯b对三种胶质瘤细胞系生长抑制及细胞形态学变化，可见在银杏内酯b作用下细胞不仅数目减少而且细胞形态皱缩变圆甚至漂浮；图4细胞迁移，胶质瘤细胞的迁移随着银杏内酯b浓度的增加而明显抑制。在高浓度银杏内酯b处理下，细胞划痕愈合变慢；图5brdu标记法分析银杏内酯b对胶质瘤细胞增殖的影响，ki-67标记非静息态细胞brdu标记增殖细胞，可见在银杏内酯b处理下，非静息态和增殖中的胶质瘤细胞都被抑制，相应定量结果见图5(b)的柱状图。同时，如图6所示，通过动物实验研究可见，银杏内酯b抑制胶质瘤细胞的生长不仅对体外细胞系有效，对于体内形成的胶质瘤也有很好的抑制效果,相应定量结果见图6(b)的柱状图。

因此，银杏内酯b作为一种活性物质，对恶性胶质瘤有较好的治疗作用，并且是天然产物，银杏内酯b能对胶质瘤细胞的迁移和增殖有不同程度的抑制，严格控制胶质瘤细胞的增殖率，对生物体的副作用小。

由上述实施例相关的数据可知，只有在本发明权利要求范围内的方案，才能够在各方面均能满足上述要求，得出最优化的方案，得到活性最优的含有银杏内酯b的胶质瘤细胞活性抑制剂。而对于配比的改动、原料的替换/加减，或者加料顺序的改变，均会带来相应的负面影响。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。