用于治疗糖尿病的药剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一种用于治疗糖尿病的药剂及其制备方法和应用。

背景技术：

苦豆子又名西豆根、苦甘草、布亚，属于豆科槐属多年生草本或基部木质化植物(sophoraalopecuroidesl.)，其生长在荒漠、半荒漠、半固定沙丘和固定沙丘的碱性沙质土壤中，主要分布在中国的新疆、甘肃、青海、宁夏、内蒙古、陕西等省。苦豆子耐盐碱、耐贫瘠、耐干旱，是西北地区防风、固沙、抗盐碱侵蚀的重要植被。苦豆子全株味苦、性寒，具有清热燥湿、止痛等功效，主治痢疾、胃痛、湿疹、疮疖和顽癣等病症。西北地区部分省区已将苦豆子列入重点保护的道地药材，纳入国家《中药现代化科技产业行动计划》中。

目前已有不少关于苦豆子的化学成分和药理作用报道，目前对于苦豆子的研究大多都集中在槐属药用植物所特有的生物碱成分。姚雯等从苦豆子的种子中分离出7种生物碱类成分，分别为苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、9α-羟基槐果碱、氧化槐果碱、9α-羟基槐胺碱、(-)-13,14-去氢槐定碱,并首次得到一种非生物碱化合物3-吲哚甲醛。高红英等从新疆苦豆子的种子中首次分得9α-羟基苦参碱，同时分离得到苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱。苦豆子中还含有黄酮类化学成分，热孜古丽·克依木等首次从新疆苦豆子中分离鉴定出3种黄酮类化学成分，分别为3′,4′-二羟基异黄酮-7-o-β-d-吡喃葡萄糖苷、7,3′-二羟基二氢黄酮-4′-o-β-d-吡喃葡萄糖苷及芦丁。卞海涛等从苦豆子中首次分离得到5,6-二羟基-3,7,3′,4′-四甲氧基黄酮、β-胡萝卜苷、3′-甲氧基-木犀草素3种化学成分，同时得到苦豆双黄酮苷、紫铆查尔酮。同时，苦豆子含有多种挥发油成分，盖静等利用气相色谱-质谱联用(gc-ms)法从苦豆子全草中分离得到糠醛、2-己烯醛及1,3-二甲基-苯等22种挥发油成分，并测得其全草含挥发油为1.9％。王凯等采用水蒸气蒸馏法和索氏提取法得到挥发油乙丁醚、4-甲基-4-羟基-2-戊酮、2-甲基萘、2-乙烯基萘及正十五碳烷。另外，苦豆子中还分离得到甾体、多糖、氨基酸酚类和一些非生物碱类化学成分。

在药理活性评价方面，张爽等研究发现苦参碱、槐定碱对小鼠的痛反应均有明显的抑制作用。余建强等发现氧化槐定碱和氧化苦参碱对小鼠有中枢抑制作用，表现为镇静催眠作用。侯延辉等研究发现苦参碱和槐果碱等均可以调节体温调节中枢，使正常体温降低，抑制直肠升温。这表明苦豆子具有影响中枢神经系统的作用。刘静等研究发现苦豆子的生物碱具有抗肿瘤作用，其机制主要是调控bcl-2,caspase蛋白家族和ask1-p38信号途径等细胞凋亡过程中的重要靶点。现代药理学实验研究也表明，苦豆子生物总碱在体内外均有抗肿瘤作用。而且其生物碱衍生物施普睿达也有明显抗肿瘤作用。韩燕等发现苦豆子的生物碱类成分可以明显减轻小鼠体内的炎症反应。tiana等发现苦豆子生物总碱对幽门螺旋杆菌引起的炎症反应有明显抑制作用。此外，钱慧发现苦豆子槐果碱可以显著减轻大鼠肝脏纤维化程度。申林卉等发现苦豆子的多糖进行羧甲基化修饰后有清除羟基自由基的能力。总而论之，苦豆子的药理活性主要有抗癌、消炎、抑菌、影响中枢神经系统、抗氧化等作用。

传统中医药是我国宝贵的文化遗产，为人类健康事业做出了巨大贡献。我国拥有丰富的中草药资源和几千年利用天然药物防病治病的临床经验，除了上述抗炎、影响中枢神经系统、抗菌、抗肿瘤等作用外，对于苦豆子在其他领域的药用价值的研究仍然有发展空间。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于治疗糖尿病的药剂及其制备方法和应用，以获得苦豆子在新的领域的药用价值。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种用于治疗糖尿病的药剂，其包括活性组分，活性组分包括紫铆素、紫铆因-4'-o-β-d-葡萄糖苷、黄豆苷元、7,3',4'-三羟基黄酮、7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮和紫铆因的至少一种。

第二方面，本发明实施例提供了一种如前述实施方式所述的药剂的制备方法，其包括：提取获得所述活性组分；

可选地，从苦豆子中分离纯化获得活性组分；

可选地，分离纯化包括：采用溶剂法提取苦豆子，获得苦豆子提取液，将苦豆子提取液去除有机溶剂后得到残留物，加水稀释得到混悬液再用乙酸乙酯萃取苦豆子悬浮液；可选地，提取液为醇或醇水混合液，可选地，提取方式包括采用提取液回流、浸渍或渗漉苦豆子粉末。

可选地，将所述苦豆子提取液去除溶剂后，加水混合得到混悬液，再用所述乙酸乙酯对所述混悬液进行萃取；

可选地，所述溶剂和苦豆子的用量比为13～17：1，优选15：1；所述残留物和水的稀释比例为1:5～15，优选1:10；所述乙酸乙酯和苦豆子悬浮液的用量比为0.8～1.2：1，优选1：1。

可选地，分离纯化还包括：将经过乙酸乙酯萃取后得到的萃取物通过大孔树脂柱，用醇水混合液梯度洗脱；进一步可选地，以质量浓度分别为10％～30％、30％～50％、50％～70％、70％～90％和90％～100％的醇溶液进行梯度洗脱；更可选地，以质量浓度分别为10％、30％、50％、70％和90％的醇溶液进行梯度洗脱；可选地，收集质量浓度为70％～90％的醇溶液洗脱得到的洗脱液作为苦豆子乙酸乙酯提取物；可选地，醇溶液为乙醇溶液。

第三方面，本发明实施例还提供了一种如前述实施方式任一项所述的药剂或前述实施方式所述的制备方法制备得到的药剂在制备促进葡萄糖摄取的激动剂中的应用。

第四方面，本发明实施例还提供了一种如前述实施方式任一项所述的药剂或前述实施方式所述的制备方法制备得到的药剂在制备葡萄糖转运蛋白4激动剂中的应用；

可选地，葡萄糖转运蛋白4激动剂用于促进葡萄糖转运蛋白4囊泡转运至细胞膜上。

第五方面，本发明实施例还提供了一种如前述实施方式任一项所述的药剂或前述实施方式所述的制备方法制备得到的药剂在制备蛋白激酶c激动剂中的应用；

可选地，蛋白激酶c激动剂用于刺激增加pkc磷酸化作用，促使pkc信号通路被激活。

第六方面，本发明实施例还提供了一种如前述实施方式任一项所述的药剂或前述实施方式所述的制备方法制备得到的药剂在制备用于治疗或预防代谢异常所致疾病的药物或者保健食品中的应用；

可选地，代谢异常所致疾病为体内总胆固醇和/或甘油三酯含量降低引起的疾病；

可选地，代谢异常所致疾病为肥胖症或高血脂症。

第七方面，本发明实施例还提供了一种如前述实施方式任一项所述的药剂或前述实施方式所述的制备方法制备得到的药剂在制备用于治疗ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明从传统中药苦豆子中分离纯化得到对糖尿病具有治疗活性的活性组分：紫铆素、紫铆因-4'-o-β-d-葡萄糖苷、黄豆苷元、7,3',4'-三羟基黄酮、7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮和紫铆因，这六种活性成分无论是单独使用或是联合使用，均具有良好的降糖活性，可用于制备临床糖尿病用药。此外，上述六种活性成分以及含有上述活性组分的苦豆子提取物，能够降低由代谢异常所致疾病中的总胆固醇和甘油三酯的含量，能够缓解或治疗脂质代谢紊乱所引起的高血脂症、肥胖症、糖尿病等。同时还发现，上述六种活性成分，以及含有上述活性组分的苦豆子提取物和苦豆子乙酸乙酯萃取物，均能够在一定程度上激活蛋白激酶c和葡萄糖转运蛋白4上膜，从而促进葡萄糖的摄取。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例2中的苦豆子黄酮部位对l6细胞葡萄糖摄取的影响图；

图2为实施例2中的苦豆子黄酮部位对l6细胞glut4转位活性的影响图；

图3为实施例2中的苦豆子黄酮部位通过pkc信号通路促进l6细胞glut4的转位；

图4为实施例2中的苦豆子黄酮部位通过pkc信号通路促进l6细胞glut4的表达；

图5为实施例2中的苦豆子黄酮部位对ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖的影响；

图6为实施例2中的苦豆子黄酮部位对ⅱ型糖尿病小鼠口服糖耐量的影响；

图7为实施例2中的苦豆子黄酮部位对ⅱ型糖尿病小鼠血清胰岛素及胰岛素抵抗指数的影响；

图8为实施例2中的苦豆子黄酮部位对ⅱ型糖尿病小鼠血清脂质指标的影响；

图9为实施例2中的苦豆子黄酮部位对ⅱ型糖尿病小鼠肝脏形态学的影响；

图10为实施例2中的苦豆子黄酮部位对ⅱ型糖尿病小鼠胰腺损伤改善的影响；

图11为实施例2中的苦豆子黄酮部位对ⅱ型糖尿病小鼠胰岛素靶组织中ppkc，glut4蛋白的影响。

图1-图4中，control表示正常组，insulin表示胰岛素阳性组，pma表示pkc通路激动剂阳性对照组，sa-fre表示苦豆子黄酮部位。

图5-图11中，nc表示正常组，dc表示模型组，sfl表示苦豆子黄酮部位低剂量组，sfh表示苦豆子黄酮部位高剂量组，met表示阳性二甲双胍组。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施方式的涉及的用于治疗糖尿病的药剂及其制备方法和应用的合成方法进行具体说明。

本发明的一些实施方式提供了一种用于治疗糖尿病的药剂，其包括活性组分，活性组分包括紫铆素、紫铆因-4'-o-β-d-葡萄糖苷、黄豆苷元、7,3',4'-三羟基黄酮、7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮和紫铆因的至少一种。即活性组分可以单独为紫铆素、紫铆因-4'-o-β-d-葡萄糖苷、黄豆苷元、7,3',4'-三羟基黄酮、7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮和紫铆因中的任意一种或者其中两种或两种以上的组分的组合。

在一些较佳的实施方式中，活性组分包括紫铆素、紫铆因-4'-o-β-d-葡萄糖苷、黄豆苷元、7,3',4'-三羟基黄酮、7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮和紫铆因。通过六种组分的相互作用配合，更有利于提高治疗效果。

优选地，按重量份计，活性组分包括16～20份紫铆素、3～5份紫铆因-4'-o-β-d-葡萄糖苷、22～26份黄豆苷元、5～8份7,3',4'-三羟基黄酮、38～42份7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮和6～10份紫铆因；例如，活性组分包括18份紫铆素、4份紫铆因-4'-o-β-d-葡萄糖苷、24份黄豆苷元、6份7,3',4'-三羟基黄酮、40份7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮和8份紫铆因。

其中，紫铆素的结构式为紫铆因-4'-o-β-d-葡萄糖苷的结构式为所述黄豆苷元的结构式为7,3',4'-三羟基黄酮的结构式为7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮的结构式为紫铆因的结构式为

在可选的实施方式中，药剂含有苦豆子提取物，苦豆子提取物中含有紫铆素、紫铆因-4'-o-β-d-葡萄糖苷、黄豆苷元、7,3',4'-三羟基黄酮、7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮和紫铆因。具体地，苦豆子提取物主要为苦豆子黄酮提取物。

一些实施方式中，苦豆子提取物为苦豆子乙酸乙酯萃取物。其中，苦豆子乙酸乙酯萃取物的制备过程为：采用醇-水混合溶液提取苦豆子，将所得到的苦豆子残留物加水稀释再用乙酸乙酯萃取，得到苦豆子乙酸乙酯萃取物。

在可选的实施方式中，药剂还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

需要说明的是，术语“药学上可接受的”指当化合物给人类施用时该化合物是生理上可接受的，且不会发生胃肠道紊乱、头晕等过敏反应或者类似这些过敏反应的全身过敏反应。

“药学上可接受的载体或辅料”包括但不限于：粘合剂(如微晶纤维素、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮)、填充剂(如淀粉、蔗糖、葡萄糖和无水乳酸)、崩解剂(如交联pvp、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、和低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(硬脂酸镁、硬脂酸铝、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠)、润湿剂(如甘油)、表面活性剂(如十六烷醇)以及吸收促进剂、矫味剂、甜味剂、稀释剂、包衣剂等。载体或辅料的用量为本领域技术人员根据现有技术采用的常规用量。

一些实施方式中，上述药剂可为包含上述活性组分的多种组分的组合物，也可以为含有上述活性组分组合物的制剂，制剂可以为片剂、软胶囊、硬胶囊、口服液、丸剂、栓剂、粉末、颗粒、乳剂、糖浆、气雾剂、灭菌注射剂或灭菌粉等。为了使该药物快速、连续并在很长一段时间里释放活性成分，本发明的药物组合物或制剂可以根据公开在那些本技术领域中的常规方法制造。本发明实施方式的药剂的给药途径可以为口服、鼻吸入或肠胃外给药。

本发明的一些实施方式还提供一种如前述实施方式的药剂的制备方法，其包括但不限于：提取获得上述活性组分。即可以通过在植物中提取得到以上活性组分，包括但不限于苦豆子。当然，也可以通过购买等途径直接从市场上获得上述活性组分。

一些较佳的实施方式中，该药剂的制备方法可为：从苦豆子中提取获得活性组分。具体地，可采用溶剂提取苦豆子，获得苦豆子提取液，将苦豆子提取液去除有机溶剂后得到残留物，加水稀释得到混悬液再用乙酸乙酯萃取苦豆子悬浮液；可选地，提取液为醇或醇水混合液，可选地，提取方式包括采用提取液回流、浸渍或渗漉苦豆子粉末。

可选地，将苦豆子提取液去除溶剂后，加水混合得到混悬液，再用乙酸乙酯对混悬液进行萃取；可选地，溶剂和苦豆子的用量比为15：1；乙残留物和水的稀释比例为1:10；酸乙酯和苦豆子悬浮液的用量比为1：1。

一些实施方式中，用醇或者醇水混合液回流、浸渍或渗漉苦豆子粉末，过滤后得到提取液；将提取液中的溶剂蒸发得到浸膏；再将浸膏加水搅拌，得到混悬液；最后，用乙酸乙酯对上述的混悬液进行萃取，得到乙酸乙酯萃取物以及水溶性部位。

进一步地，将经过乙酸乙酯萃取后得到的萃取物通过大孔树脂柱，用醇水混合液梯度洗脱；优选地，以质量浓度分别为10～30％、30～50％、50～70％、70～90％和90～100％的醇溶液进行梯度洗脱。更优选地，以质量浓度分别为10％、30％、50％、70％、80％和90％的醇溶液进行梯度洗脱。优选地，收集质量浓度为70％～90％的醇溶液洗脱得到的洗脱液作为苦豆子乙酸乙酯提取物。通过将不同梯度醇溶液洗脱得到的组分分别合并，并分别进行活性筛选，活性筛选结果显示，70％～90％质量浓度的醇溶液洗脱下来的组分活性最好，其可以作为苦豆子乙酸乙酯萃取物。一些实施方式中，醇溶液为乙醇溶液。

本发明的一些实施方式还提供了一种前述任一实施方式的药剂在制备促进葡萄糖摄取的激动剂中的应用。

发明人通过研究发现，含有上述活性组分的苦豆子黄酮提取物和苦豆子乙酸乙酯提取物、以及紫铆素、紫铆因-4'-o-β-d-葡萄糖苷、黄豆苷元、7,3',4'-三羟基黄酮、7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮和紫铆因，均能提高葡萄糖摄取水平，其中苦豆子黄酮提取物、紫铆素、紫铆因-4'-o-β-d-葡萄糖苷、黄豆苷元、7,3',4'-三羟基黄酮、7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮和紫铆因对基础水平下和胰岛素刺激下的葡萄糖摄取具有显著性的促进作用。

本发明的一些实施方式还提供了一种前述任一实施方式的药剂在制备葡萄糖转运蛋白4激动剂中的应用。

葡萄糖转运蛋白4(glut4)，是一种跨膜蛋白，它主要在脂肪以及肌肉细胞中表达，是动物机体中负责转运葡萄搪的主要蛋白。在脂肪细胞及骨骼肌细胞中，glut4存在于特殊的膜结构中,称为glut4囊泡。胰岛素刺激是促使胞内的glut4囊泡大量向细胞膜转运的直接原因。胰岛素的刺激胞内glut4囊泡转运至膜上释放，导致膜上glut4含量的增加。膜上有活性的glut4将葡萄糖转运入肌肉、脂肪等组织中代谢、储存，以维持机体的糖代谢平衡。在未刺激的状态下，约有95％的glut4位于贮存胞内的囊泡内。当运动或信号刺激激发胰岛素与受体结合，激发一系列的信号反应，导致富含glut4的囊泡向质膜移动，glut4转位至质膜且活性增加，与葡萄糖结合并发生构象的改变，此时葡萄糖被转运至细胞内。

前期实验中，建立了一种以glut4为筛选靶点的细胞模型，通过检测细胞膜上荧光强度来寻找以glut4为靶点的有效提取物或单体化合物。人类与小鼠的glut4具有高度的序列同源性，在体外实验中可以采用小鼠l6肌管细胞代替人肌肉细胞。未刺激的状态下，约有95％的glut4位于贮存胞内的囊泡内。当运动或信号刺激激发胰岛素与受体结合，激发一系列的信号反应，导致富含glut4的囊泡向质膜移动，glut4转位至质膜且活性增加，与葡萄糖结合并发生构象的改变，此时葡萄糖被转运至细胞内。基于此，发明人创建了基于l6细胞glut4荧光标记的药物筛选体系；通过直接采用激光共聚焦显微镜来追踪l6细胞中荧光标记的glut4的运动，判断样品对glut4转位活性的影响程度。

发明人通过上述研究发现，含有上述活性组分的苦豆子黄酮提取物和苦豆子乙酸乙酯提取物、以及紫铆素、紫铆因-4'-o-β-d-葡萄糖苷、黄豆苷元、7,3',4'-三羟基黄酮、7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮和紫铆因，均能够促进glut4囊泡转运至细胞膜上，葡萄糖结合并将葡萄糖转运至细胞内，从而增加细胞对葡萄糖的摄取。由此可知，上述葡萄糖转运蛋白4激动剂用于促进葡萄糖转运蛋白4囊泡转运至细胞膜上。

本发明的一些实施方式还提供了一种如前述任一实施方式的药剂在制备蛋白激酶c激动剂中的应用。

真核细胞中，主要存在两条信号通路可以对glut4的转运进行调节。其一为胰岛素诱导的glut4转运途径；其二为glut4转运的非胰岛素信号依赖途径。其中，胰岛素诱导的信号通路包括pi3k/akt/pkb，pkcs，cap/cbl/tc10与mapks等。蛋白激酶c(pkc)是一种钙或/和磷脂依赖性蛋白磷酸化酶，是g蛋白偶联受体系统中的效应物，也是一种细胞酯酶，广泛存在于人体的各种组织细胞中，主要分布在未受刺激细胞的细胞质中和受刺激细胞的细胞膜上。它能被细胞外生物活性因素(生长因素、神经递质、细胞因子等)激活，完成靶细胞蛋白的磷酸化，通过蛋白磷酸化后生物活性的改变而完成细胞外源性信号的应答，构成细胞内重要的信息网络系统。在胰岛素信号途径中，激活pkc与pkc下游的一系列未知途径，将促进glut4的转运。由此可知，它能激活细胞质中的酶，参与生化反应的调控。pkc还是机体代谢的重要靶点，在控制肝脏糖原代谢，调控细胞分化，调节脂质代谢，基因表达调控，长时程抑制和调控肿瘤生长方面有重要作用。大量研究显示pkc调控大量不同的代谢通路，它是安全有效的治疗ⅱ型糖尿病和脂代谢异常的靶点。glut4是骨骼肌和脂肪组织吸收葡萄糖的限速步骤，而pkc是glut4的主要调控蛋白之一。在糖脂代谢中，外界刺激增加pkc磷酸化作用，促使pkc信号通路被激活，从而促进glut4由胞质内转运至细胞膜上，最终增强细胞对葡萄糖的摄取。

为了进一步的研究上述活性组分对glut4促进作用的具体信号通路，发明人采用ampk信号通路抑制剂(compoundc)、pi3k/akt信号通路抑制剂(wortmannin)和pkc信号通路抑制剂研究其是否能抑制上述活性组分对glut4表达及转位的调控从而初步确定上述活性组分作用的信号通路。发明人通过研究发现，含有上述活性组分的苦豆子黄酮提取物和苦豆子乙酸乙酯提取物，能够增加pkc磷酸化作用，激活pkc信号通路，从而促进glut4蛋白的转膜和表达，最终起到改善ⅱ型糖尿病症状的效果。由此可知，蛋白激酶c激动剂用于刺激增加pkc磷酸化作用，促使pkc信号通路被激活。

本发明的一些实施方式还提供了一种如前述任一实施方式的药剂在制备用于治疗或预防代谢异常所致疾病的药物或者保健食品中的应用。可选地，代谢异常所致疾病为体内总胆固醇和/或甘油三酯含量降低引起的疾病；可选地，代谢异常所致疾病为肥胖症或高血脂症。

本发明的一些实施方式还提供了一种如前述任一实施方式的药剂在制备用于治疗ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

由于上述活性组分能够激活pkc，而pkc是调控代谢疾病的重要靶标；且通过研究发现，苦豆子黄酮提取物、以及活性成分紫铆素、紫铆因-4'-o-β-d-葡萄糖苷、黄豆苷元、7,3',4'-三羟基黄酮、7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮和紫铆因，这六种成分均能够降低由代谢异常所致疾病中的总胆固醇和甘油三酯的含量，因此，能够用于缓解或治疗治疗或预防由代谢异常所致的疾病，例如糖尿病、肥胖症和高血脂症。其中，对ⅱ型糖尿病有显著的治疗作用。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

苦豆子全株购于青海省西宁药材市场，为药用植物苦豆子(sophoraalopecuroidesl)的干燥种子。取苦豆子种子的干燥粉末500g，按料液比1:15(1.0kg药材对应15.0l的溶剂)用体积浓度为95％的乙醇水溶液浸渍3天，过滤取滤液，滤渣按照上述的提取方法再用95％乙醇水溶液提取4次，过滤合并四次提取的滤液，减压浓缩得到88g黄褐色残留物；按体积比1:10加水溶解稀释，用与水部位等体积的乙酸乙酯萃取水液4次，减压回收浓缩得到16g的苦豆子乙酸乙酯萃取物。

实施例2

取苦豆子乙酸乙酯提取物12g，以50ml氯仿溶解，加入大孔树脂(d101型号)25g搅拌均匀，减压干燥后分散均匀充分添加至大孔树脂柱(d101，300g)上，以质量浓度为10％、30％、50％、70％、80％、90％的含水乙醇梯度洗脱，不同浓度的醇水洗脱液分别进行减压浓缩干燥，并对不同浓度的洗脱液采用glut4转膜活性筛选方法筛选，70％-90％的部位显示好的促glut4转膜活性，即苦豆子黄酮部位(sa-fre，4.2g)。100mg的sa-fre溶解于2.0ml甲醇，过滤。200μl的sd-pre采用waters半制备液相与waterssunfirec18hplc柱(5μm,19×250mmi.d.)进行分离，以纯水和乙腈作为流动相(两相分别含0.1％的甲酸)梯度洗脱，0–40min，20–35％乙腈；40–45min,35–95％乙腈；45-50min,95％乙腈。手动收集6个主要的色谱峰，重复进样20次，合并相同时间段流分，收集的6个峰采用一根葡聚糖凝胶柱(350×10mm,65％meoh:35％ch2cl2，分别包含0.1％甲酸)进行纯化，得到6个纯化合物，分别为紫铆素(16.6mg)、紫铆因-4'-o-β-d-葡萄糖苷(2.9mg)、黄豆苷元(21.3mg)、7,3',4'-三羟基黄酮(5.6mg)、7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮(35.5mg)和紫铆因(6.7mg)。

实施例3

苦豆子黄酮部位(含有六种活性组分的提取物)对l6肌肉细胞葡萄糖摄取的影响：

将冻存的l6细胞复苏，用含10％fbs以及1％双抗的α-mem培养基进行培养，待其生长至对数期时，换用含2％fbs以及1％双抗的α-mem培养基进行分化，待其完全分化为肌管后，按照1×10⁴–5×10⁴细胞/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100μl的培养液。然后用含2％fbs的α-mem培养基使96孔板中的l6细胞分化6天。分化之后将96孔板中的细胞用无血清的α-mem培养基饥饿2h。将实施例2中的苦豆子黄酮部位以1mg/50μl的浓度溶于dmso溶液中，制成20μg/μl的苦豆子黄酮部位母液，然后向每100μl的α-mem培养基中加入0.25μl的苦豆子黄酮部位母液，制成苦豆子黄酮浓度为50μg/ml的α-mem培养基，以制成的含药培养基孵育l6细胞。如上所述配制2-nbdg的母液并在α-mem培养基中稀释，使含药的α-mem培养基中含有2-nbdg的浓度为150μg/ml。

将细胞放入37℃和5％co2的恒温培养箱中培养30min，每个组均有三个以上的重复，并设空白对照，insulin阳性对照(100nm)。30min后将96孔板在室温和400g的条件下离心5min。弃上清，向每个孔中再加入200μl的试剂盒缓冲液然后混匀，继续在室温和400g的条件下离心5min。又一次弃上清，最后向每个孔中再加入100μl的试剂盒缓冲液然后混匀。用酶标仪在485nm激发波长和535nm发射波长下检测各个孔的2-nbdg的荧光吸收值。

结果见图1，相比于正常组(空白对照组)，苦豆子黄酮部位以50μg/ml剂量能够明显增强l6细胞的葡萄糖摄取，并呈现出显著性差异(**p<0.01)。

实施例4

苦豆子黄酮部位(含有六种活性组分的提取物)对glut4转位上膜应用：

将稳定表达glut4-morange的l6细胞接种于6cm的培养皿中，加入含10％胎牛血清的mem-α培养基，37℃、5％co2细胞培养箱培养。首先，将glut4-morange-l6细胞用胰酶消化后接种在无菌的盖玻片上，放入37℃和5％co2的恒温培养箱中培养过夜使其完全贴壁。然后弃培养基，加入无血清培养基饥饿2小时，再用pbs溶液轻轻洗涤。加入50μg/ml实施例2中的苦豆子黄酮部位，用激光扫描共聚焦显微镜来监测加入药物后glut4-morange转运的动态变化，观察细胞内荧光强度变化，以此来反应glut4上膜情况。

从图2可见，苦豆子黄酮部位表现出极强的促进glut4转位上膜的作用。具体而言，图2的a中加入50μg/ml苦豆子黄酮部位后，膜上glut4荧光强度逐渐增强，从图2的b中可以看出，加入50μg/mlsa-fre后的30min内，细胞膜上的glut4-morange荧光强度逐渐增强，并且50min时达到1.85倍(**p<0.01，***p<0.001，与正常组相比)。

实施例5

在实施例2的实验步骤的基础上，选用l6irap-morange细胞，给药前分别加入compoundc(10μm)、wortmannin(100nm)、(10μm)孵育细胞30min后再加入测试药物，观察膜上荧光变化，间接反映glut4上膜情况。

通过图3可知，在加入ampk的抑制剂compoundc(图3b)后，荧光强度没有明显变化，没有抑制苦豆子黄酮部位引起的glut4的转位，pi3k的抑制剂wortmannin(图3a)也没有抑制苦豆子黄酮部位引起的glut4转位，因此，pi3k的抑制剂wortmannin和(b)ampk的抑制剂compoundc无法抑制sa-fre引起的l6细胞glut4转位。pkc的抑制剂(图3c)明显抑制了苦豆子黄酮部位引起的glut4的转位(^***p<0.001，^**p<0.01，与正常组相比)。由此说明，测试化合物是通过pkc信号通路促进glut4转位上膜，从而增加葡萄糖摄取。

然后通过westernblot进行了进一步的检测，如图2所示，发现在加入50μg/ml苦豆子黄酮部位孵育后，l6细胞中glut4的表达水平明显增强，pkc的磷酸化水平显著升高(图4a和图4b)。具体而言，图4a中，50μg/mlsa-fre显著提升了l6细胞中pkc磷酸化水平；图4b中，50μg/mlsa-fre显著促进了l6细胞中glut4的表达水平(^**p<0.01，^*p<0.05，与正常组相比)。综合以上数据，表明实施例1的苦豆子黄酮部位通过pkc信号通路促进l6细胞glut4的转位及表达。

动物实验：苦豆子黄酮部位对糖尿病小鼠的降糖作用

1.材料与仪器

1.1实验动物

8周龄雄性c57/bl6j小鼠，spf级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证编号:scxk(京)2009-0004。鼠料经60℃灭菌，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。高脂饲料购自江苏美迪森生物医药有限公司。饲养环境：室温23±2℃，湿度50-60％，自由进食进水，12h光照周期。

1.2药品与试剂

上述实施例2获取的苦豆子黄酮部位，胰岛素放射免疫试剂盒(天津九鼎医学生物工程有限公司)，葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司，批号：20130328)，盐酸二甲双胍片(阳中美上海施贵宝制药有限公司)，ripa细胞裂解液(碧云天生物技术有限公司)，pmsf(碧云天生物技术有限公司)，bca蛋白浓度试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，glut4、β-actin、ppkc、二抗等抗体(cellsignalingtechnology)。

1.3实验仪器

血糖仪(三诺安稳血糖仪)，血糖试纸(三诺安稳血糖试纸)，分析天平cp214(奥豪斯仪器上海有限公司)，allegrax-22r高速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特公司)，全自动生化分析仪(日立7180+ise)。

2.实验方法

2.1待测样品的制备

参照一、苦豆子黄酮部位制备方法获得待测样品，用于下述实验。

2.2实验模型的建立

65只c57bl/6j小鼠用普通饲料喂养一周使其适应环境，10只c57bl/6j小鼠作为正常对照组，其余50只小鼠饲喂高脂饲料三周，诱导小鼠产生肥胖和胰岛素抵抗，之后以40mg/kg的剂量为小鼠腹腔注射溶于柠檬酸铵溶液中的stz溶液(ph4.5),三天后尾部取血测定小鼠的空腹血糖浓度，血糖浓度大于11mmol/l为合格模型小鼠，可用于下一步实验。按空腹血糖值随机分为模型对照组、阳性对照组(盐酸二甲双胍片200mg/kg)、苦豆子黄酮部位给药组(100mg/kg、200mg/kg)4组，每组8只。各组采用等体积不等浓度灌胃给药(正常对照组和模型对照组给予等体积生理盐水)，每日定时给药一次，灌胃体积均为0.1ml/10g，连续灌胃四周。

2.3实验数据采集

分别于给药前、给药后、给药第7d、15d、21d和28d于尾静脉取血测定小鼠血糖值。小鼠体重分别于给药前、给药后、给药间隔每两天测定一次。末次给药后小鼠禁食12小时，测定小鼠血糖浓度作为0h的血糖值，以2.0g/kg灌胃葡萄糖，分别测定30min、60min、90min、120min小鼠的小鼠血糖值，观察各组小鼠血糖值的变化，比较各组之间是否存在差异。

血糖指标测定结束后采用摘取眼球取血，以转速3000rpm离心15min分离血清。使用全自动生化分析仪分别测定小鼠血清中总胆固醇和甘油三酯的血清胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量，试剂盒检测游离脂肪酸含量。免疫法测定血清胰岛素含量。

采血结束后，将小鼠处死，然后收集小鼠骨骼肌、肝脏、脂肪组织。取部分肝脏和胰腺置于4％甲醛溶液中进行固定。随后使用石蜡对这些组织进行包埋，最后使用中性树脂封片后干燥。将这些组织切成5μm厚的切片，伊红和苏木精染色。胰腺进行免疫组化染色。于显微镜观察组织切片，并拍照，以进行形态学分析。

小鼠组织相关蛋白的检测：ripa裂解液提取总蛋白，bca蛋白试剂盒确定蛋白浓度，取各组样品相等量蛋白质，进行sds-page胶分离蛋白。并将蛋白电转移至pvdf膜上。再用含0.5％脱脂奶粉的tbst封闭1h；加入稀释的一抗glut4、ppkc、β-actin抗体4℃过夜；洗膜后加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗鼠igg，室温轻摇1h，充分洗涤后加入ecl显色液，使用凝胶成像系统(aplegen,inc,usa)进行成像分析。

3.实验结果

数据以平均值±标准误(mean±sem)表示，组间显著性差异检验用t检验及相关分析。

3.1对ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖的影响

高脂饲养四周后，模型组糖尿病小鼠空腹血糖值明显高于正常组c57小鼠血糖，具有显著性差异(⁺⁺⁺p＜0.001)，而给药组与模型组的血糖水平无显著性差异。给药四周后，各给药组血糖水平均显著下降，与模型组相比，具有显著性差异(***p＜0.001)。由此可以看出，苦豆子黄酮部位具有降低ⅱ型糖尿病小鼠的血糖的功效。实验结果见图5，图5中，纵坐标为血糖水平，横坐标为时间，单位周。

3.2对ⅱ型糖尿病小鼠口服糖耐量的影响

正常组小鼠在口服葡萄糖后的30min血糖水平达到最大值，120min血糖已经基本恢复到给药前水平。模型组在口服葡萄糖30min后血糖值达到最大，此后虽然有所下降但一直保持在较高的水平。苦豆子黄酮部位低、高剂量治疗组口服葡萄糖后30min血糖值达到最高水平，30min后均有显著性的下降，120min后基本达到口服葡萄糖前水平。统计血糖曲线下面积(auc)，结果显示，苦豆子黄酮部位低、高剂量组与模型组相比均存在显著性的差异(***p＜0.001)。由此说明，苦豆子黄酮部位能够改善ⅱ型糖尿病小鼠的口服糖耐量。实验结果见图6，其中，图6中的a为灌胃2.0g/kg葡萄糖后，2h内小鼠血糖水平；图6中的b为血糖曲线下面积(auc)。

3.4对ⅱ型糖尿病小鼠血清胰岛素及胰岛素抵抗指数的影响

正常组小鼠胰岛素处于正常水平，模型组小鼠胰岛素水平比正常组明显高出很多，具有显著性差异(⁺⁺⁺p＜0.001)，说明糖尿病小鼠存在胰岛素抵抗。苦豆子黄酮部位治疗组胰岛素水平相比模型组明显降低，高剂量组存在显著性差异(**p＜0.01)。采用matthews等在1985年提出的稳态模型法用于评价胰岛素抵抗状态，抵抗指数(homa-ir)＝空腹血糖(mmol/l)×(miu/l)/22.5。与模型组小鼠比较,各给药组均可显著降低糖尿病小鼠胰岛素抵抗指数。这些结果说明，苦豆子黄酮部位治疗后，糖尿病小鼠胰岛素抵抗程度明显降低，苦豆子黄酮部位的降糖作用可能与改善胰岛素抵抗有关，实验结果见图7。

3.5苦豆子黄酮部位对ⅱ型糖尿病小鼠血清脂质指标的影响

正常组小鼠血清血清胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、游离脂肪酸(ffa)水平处于正常水平,模型组小鼠各指标显著高于正常组。经由苦豆子黄酮部位治疗四周后，各治疗组小鼠血清中tc，tg，ffa，和ldl-c含量均明显低于模型组，而hdl-c水平明显高于模型组，说明苦豆子黄酮部位具有改善糖尿病小鼠血脂异常的作用，实验结果见图8，图8中的a、b、c、d、e分别依次对应苦豆子黄酮部位对糖尿病小鼠的甘油三酯、总胆固醇、游离脂肪酸、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇的影响。

3.6苦豆子黄酮部位对ⅱ型糖尿病小鼠肝脏形态学的影响

肝脏切片he染色结果如图9(标尺，50μm)所示，正常组c57bl/6j小鼠肝脏切片表现出正常的形态，模型组小鼠则呈现出明显的脂肪肝症状，肝脏切片中含有许多脂肪空泡。在苦豆子黄酮部位及二甲双胍治疗后的糖尿病小鼠的肝脏切片中，虽然能看到一些肝脏脂肪病变，但是相比模型组，该症状明显减轻，且以二甲双胍和苦豆子黄酮部位高剂量组效果最好。结果表明，苦豆子黄酮部位口服给药，可以有效防止糖尿病小鼠肝脏脂肪病变的发生和发展。

3.7苦豆子黄酮部位对ⅱ型糖尿病小鼠胰腺功能损伤的改善

胰腺切片免疫组化染色结果如图10(标尺，50μm)所示，正常组c57bl/6j小鼠胰岛与周围外分泌部界限清楚，形态正常，胰岛细胞排列紧密，胰岛素抗体染色区域大，形状规则；模型组糖尿病小鼠胰腺组织出现胰岛体积缩小，胰岛细胞受损严重，外周边缘不清等诸多病理形态学改变。经灌胃给药后，与模型组相比，各治疗组胰岛形态接近规则，体积变大，免疫信号逐渐增强。

3.8苦豆子黄酮部位对ⅱ型糖尿病小鼠胰岛素靶组织(骨骼肌、脂肪组织、肝脏)中相关蛋白的影响

通过相应抗体检测小鼠骨骼肌、脂肪组织、肝脏中ppkc、glut4蛋白水平。由图11可以看出，与模型组相比，苦豆子黄酮部位低、高剂量组均能提高糖尿病小鼠骨骼肌及脂肪组织中glut4、ppkc水平，提高糖尿病小鼠肝脏中ppkc水平。结合体外机制研究结果，可以说明，苦豆子黄酮部位主要通过pkc信号通路促进glut4转位及表达，改善糖尿病小鼠胰岛素抵抗，调节糖脂代谢，改善ⅱ型糖尿病症状。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。