异槲皮苷在制备治疗金黄色葡萄球菌感染性肺炎药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药领域，尤其涉及异槲皮苷的应用。

背景技术：

金黄色葡萄球菌是一种重要的革兰阳性致病菌，可引起人和动物的皮肤软组织化脓性感染、肺炎、心包炎、败血症以及脓毒血症等多种感染性疾病，具有很高的发病率和死亡率。金黄色葡萄球菌肺炎是一种由金黄色葡萄球菌介导的疾病，发病率很高，大约占所有侵袭性葡萄球菌感染的13.3％；该疾病由于具有病情进展快、组织破坏严重、耐药性严重等特点备受关注。

金黄色葡萄球菌的致病力主要与其的毒力因子密切相关，其中金黄色葡萄球菌分泌的凝固酶是一种重要的金黄色葡萄球菌的外毒素，可以结合凝血酶原与之形成复合物，并将其激活，进而可以将血液中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，形成纤维蛋白网络，导致宿主组织中形成脓肿，也可以帮助病原菌逃逸宿主免疫细胞的清除，是造成金黄色葡萄球菌持续性感染的重要毒力因子。因此凝固酶是金黄色葡萄球菌感染抗毒力药物研发的潜在靶标。

由于传统抗菌药物对金黄色葡萄球菌肺炎治疗性能的下降以及抗生素大量长期的使用诱导耐药菌的产生，因此迫切需要研发安全、有效、不易产生耐药性的新型抗感染制剂。

异槲皮苷，又称异槲皮素，槲皮素-3-o-葡萄糖苷，化学式为c21h20o12；其是一种存在于药用植物田基黄、罗布麻甲叶、桑叶等中药材中的黄酮类化合物，其也可以通过人工合成得到。作为天然活性黄酮药物，异槲皮苷在制备治疗心肌缺氧、缺血疾病以及抗血栓的药物上备受重视，但目前国内外未见异槲皮苷用于治疗金黄色葡萄球菌导致的肺炎的报道。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题在于提供异槲皮苷在制备治疗金黄色葡萄球菌感染性肺炎药物中的应用。

有鉴于此，本申请提供了异槲皮苷在制备抗金黄色葡萄球菌药物中的应用。

本申请还提供了异槲皮苷在制备治疗金黄色葡萄球菌感染肺炎药物中的应用。

优选的，所述异槲皮苷的剂量为80mg/kg～120mg/kg。

优选的，所述药物包括异槲皮苷和药学上可接受的辅料。

优选的，所述药物的剂型为口服制剂、注射剂、栓剂或吸入剂。

优选的，所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、注射液、凝胶剂或气雾剂。

优选的，所述异槲皮苷的纯度大于99％。

本申请提供了异槲皮苷在制备治疗金黄色葡萄球菌感染性肺炎药物中的应用；异槲皮苷通过抑制金黄色葡萄球菌凝固酶的活性，降低了金黄色葡萄球菌毒力发挥作用；与传统的治疗金黄色葡萄球菌的抗生素相比，异槲皮苷具有不对病菌产生生存压力，不会导致病菌耐药性的产生的优点。因此异槲皮苷在研发安全有效的金黄色葡萄球菌感染性肺炎的治疗药物上具有较好的潜在应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中，异槲皮苷对金黄色葡萄球菌凝血的抑制作用对比照片；

图2为本发明实施例2中，异槲皮苷对人肺上皮细胞a549的细胞毒性实验结果图；

图3为本发明实施例3中，异槲皮苷对金黄色葡萄球菌感染性肺炎小鼠的肺组织保护作用的病理结果图；

图4为本发明实施例3中，异槲皮苷治疗后显著降低对金黄色葡萄球菌感染性肺炎小鼠的肺组织金黄色葡萄球菌载量实验结果图；

图5为本发明实施例3中，异槲皮苷治疗提高金黄色葡萄球菌感染性肺炎小鼠生存率的实验结果图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本申请首次发现异槲皮苷可直接抑制金黄色葡萄球菌凝固酶的活性，从而显著降低金黄色片葡萄球菌的毒力，对金黄色葡萄球菌感染性肺炎具有良好的保护作用。由此，本发明实施例公开了异槲皮苷在制备抗金黄色葡萄球菌药物中的应用。

更具体的，本申请公开了异槲皮苷在制备治疗金黄色葡萄球菌感染肺炎药物中的应用。

本申请所述异槲皮苷的结构式如下所示，其来源本申请没有特别的限制，按照本领域技术人员熟知的方法制备得到或自中药材中提取得到；

在具体应用中，所述异槲皮苷的剂量80mg/kg～120mg/kg，在具体实施例中，所述异槲皮苷的剂量为100mg/kg。

在本申请中，包括异槲皮苷的药物还包括药学上可接受的辅料，即在制备的药物中，异槲皮苷作为药物活性成分，而辅料可根据实际情况选择性加入，对此本申请没有特别的限制。所述药物的剂型可以为口服制剂、注射剂、栓剂或吸入剂，具体可以为片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、注射液、凝胶剂或气雾剂。

异槲皮苷通过抑制金黄色葡萄球菌凝固酶的活性，可以显著抑制金黄色葡萄球菌的凝血，最终降低了金黄色葡萄球菌毒力发挥作用；与传统的治疗金黄色葡萄球菌的抗生素相比，异槲皮苷具有不对病菌产生生存压力，不会导致病菌耐药性的产生的优点。因此异槲皮苷在研发安全有效的金黄色葡萄球菌感染性肺炎的治疗药物上具有较好的潜在应用前景。实验结果表明：通过小鼠金黄色葡萄球菌感染性肺炎治疗模型，证实了异槲皮苷可以降低肺组织的细菌载量，改善病菌感染后肺组织的过度炎症反应，显著提高小鼠生存率，显示其对金黄色葡萄球菌感染性肺炎具有较好的治疗作用。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的异槲皮苷的应用效果进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1异槲皮苷对金黄色葡萄球菌凝固酶coa的凝血抑制实验

在超净台中取出若干个试管，将试管编号，分别加入490μl配制好的含有肝素钠的新鲜兔血浆。向试管中分别加入终浓度为64μg/ml、128μg/ml的异槲皮苷，小心摇晃试管，使之混匀；用蛋白缓冲液将coa蛋白稀释到50μm，每个试管中加入10μl稀释的coa蛋白；将稀释好的蛋白与加有不同浓度的异槲皮苷的血浆在37℃恒温箱中共孵育，每隔10分钟，45°倾斜离心管，通过肉眼观察血浆能否流动，判定不同浓度异槲皮苷对金葡菌的凝血活性的影响；

以含有dmso(＜0.5％)的蛋白血浆组为阴性对照组，以血浆组为空白对照组；所有实验重复三次以保证实验结果稳定性。

结果如图1所示：阴性对照组即coa+dmso组在10分钟内已完全凝固，形成稳定的固体团块；而64μg/ml异槲皮苷组在6小时内凝固，128μg/ml异槲皮苷在12小时尚未凝固；与阴性对照比相比，加药组凝固时间明显延长，且随着药物浓度升高而变长；空白血浆组一直未凝固；由此表明，异槲皮苷对coa的凝血活性有显著抑制作用，在64μg/ml的浓度下就能抑制coa活性。

实施例2异槲皮苷对人肺上皮细胞a549的细胞毒性实验

mtt，3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二甲苯基溴化四唑(商品名：噻唑蓝)，是一种检验细胞存活能力和生长率的常用试剂。

为了确定异槲皮苷对细胞生长存活的影响，采用mtt法测定异槲皮苷对人肺上皮细胞a549的细胞毒性。培养人肺上皮细胞a549至对数生长期，用0.25％的胰酶分散成单个细胞，以dmem/高葡萄糖培养基(含10％胎牛血清)重悬。按100μl/孔(约1×10⁴个细胞)在96孔细胞培养板中加入细胞悬液，将细胞培养板置于37℃，含5％co2的细胞培养箱中培养10小时，各组细胞分别加入0μg/ml，32μg/ml，64μg/ml，128μg/ml，256μg/ml异槲皮苷，每个浓度设3个重复；将培养板置于37℃，含5％co2的培养箱中继续培养72小时。将5×mtt用dilutionbuffer稀释成1×mtt；每孔加50μl1×mtt，在37℃孵育4小时，使mtt还原为甲瓒。将孔板中的培养基取出，吸出上清液，用pbs溶液清洗3次，每孔加入150μldmso后置摇床上低速振荡15分钟，充分溶解mtt甲瓒结晶物。用酶标仪测量各组在570nm波长下的吸光度，判定药物对细胞存活的影响。

结果如图2所示，不同浓度的异槲皮苷与人肺上皮细胞a549作用后，药物处理组细胞和未处理组细胞的存活无明显差异，由此表明，异槲皮苷对a549细胞无毒性。

实施例3异槲皮苷对金黄色葡萄球菌感染性肺炎的实验治疗学研究

3.1建立小鼠金黄色葡萄球菌感染性肺炎模型

实验小鼠为雄性，体重为18～22g的c57bl/6j小鼠；挑取金黄色葡萄球单菌落于bhi培养基中，37℃，200rpm培养过夜；次日，以1:100的比例传代到新鲜的bhi培养基，继续培养至od600＝1.0，将菌液离心(8000rpm，5分钟)收集菌体，用pbs洗涤3次，备用；使用乙醚麻醉小鼠，滴鼻给菌30μl，抓住小鼠背部使其直立，使菌液自然吸入，吸入后继续保持直立30秒使菌液充分吸收，再将小鼠放平，使其自然苏醒。

3.2异槲皮苷对小鼠肺脏组织的保护作用

将30只c57bl/6j小鼠随机分为三组：金黄色葡萄球菌感染对照组、异槲皮苷治疗组，空白对照组。

使用乙醚麻醉小鼠，对于金黄色葡萄球菌感染组和异槲皮苷治疗组小鼠，用30μl含有1×10⁹菌落形成单位(cfu)的金黄色葡萄球菌悬浮液滴鼻感染小鼠，空白对照组滴鼻等量的含有5％dmso的生理盐水，滴鼻时抓住小鼠背部使其直立，使菌液自然吸入，吸入后继续保持直立30秒使菌液充分吸收，再将小鼠放平，使其自然苏醒。2小时后，感染病菌的小鼠腹膜内注射100mg/kg的异槲皮苷或相同体积的生理盐水，每12小时给药一次。给药24小时后，颈椎脱臼处死小鼠，于超净台内无菌取小鼠左肺，用眼观察肺组织病理变化，并采集图像，然后用10％福尔马林溶液固定，进行组织病理学切片和苏木精-伊红染色，通过光学显微镜观察并采集图像。

结果如图3所示：空白对照组的小鼠肺组织比较柔软，呈淡红色。感染对照组的小鼠肺组织呈现暗红色，弹性降低，大面积充血；使用异槲皮苷治疗后小鼠的肺组织呈现淡红色，弹性有所恢复，充血减弱明显降低。通过肺部病理学组织切片分析发现，感染对照组小鼠肺组织显著充血，并且肺泡沟中大量炎性细胞积聚；用异槲皮苷治疗后，肺组织充血较轻，肺泡腔的炎症细胞浸润明显减少，肺泡结构较完整，由此表明，肺部炎症得到缓解。

3.3异槲皮苷治疗显著降低小鼠肺脏组织金黄色葡萄球菌载量

将30只c57bl/6j雄性小鼠随机分为二组：金黄色葡萄球菌感染对照组、异槲皮苷治疗组。

用乙醚麻醉后，用30μl含有1×10⁹菌落形成单位(cfu)金黄色葡萄球菌悬浮液鼻内感染小鼠。2小时后，感染金黄色葡萄球菌的小鼠腹膜内注射100mg/kg的异槲皮苷或相同体积的生理盐水，每12小时给药一次。给药24小时后，颈椎脱臼处死小鼠，于超净台内无菌取小鼠肺脏，称重、组织匀浆后，1000rpm离心5分钟收集上清、将菌液分别系列稀释后滴在琼脂糖bhi固体培养皿上，置于37℃恒温培养箱中培养12小时后，计数培养皿上各稀释度菌落数。每次做三组重复，取菌落数的平均值。

结果如图4所示：感染对照组的小鼠肺部载菌量为10.1cfu/g，经异槲皮苷治疗，载菌量显著降低，仅为6.9cfu/g，由此说明，异槲皮苷对金葡菌感染性肺炎具有一定的治疗效果。

3.4异槲皮苷治疗显著降低金黄色葡萄球菌感染性肺炎小鼠的死亡率

将30只雄性，体重为18～22g的c57bl/6j小鼠随机分为三组：金黄色葡萄球菌感染对照组、异槲皮苷治疗组，空白对照组。

使用乙醚麻醉小鼠，对于金黄色葡萄球菌感染组和异槲皮苷治疗组小鼠，用30μl含有2×10⁹菌落形成单位(cfu)的金黄色葡萄球菌悬浮液滴鼻感染小鼠，空白对照组滴鼻等量的含有5％dmso的生理盐水。滴鼻感染2小时后，感染金黄色葡萄球菌的小鼠腹膜内注射100mg/kg的异槲皮苷或相同体积的生理盐水，每12小时给药一次。滴鼻后于12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时和96小时统计小鼠存活情况，计算生存率。

结果如图5所示：感染组(dmso处理组)在12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时的死亡率分别为10％、40％、50％、70％、80％、80％、80％、80％；在注射100mg/kg的异槲皮苷后，治疗组在12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时的死亡率分别为0、0、10％、20％、20％、20％、20％、20％。通过生存分析显示，治疗组显示出显著的生存优势，特别是在感染后的早期时间点。这些结果表明，异槲皮苷可以使感染小鼠的存活时间增长，并且能保护小鼠不在感染初期死亡。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。