一种氯硝柳胺纳晶温敏凝胶及其制备方法、应用与流程

本发明涉及药物剂型和制剂技术领域，具体涉及一种局部缓释的氯硝柳胺纳晶温敏凝胶的制备方法及用途。

背景技术：

氯硝柳胺是二十世纪六十年代fda批准用于治疗肠道寄生虫感染的bcsii类化合物，后也常掺于饲料中用于治疗和预防家畜的寄生虫感染。近些年的药理学研究发现，氯硝柳胺对其他病原微生物和多种癌细胞也有较强的抑制作用，包括铜绿假单胞菌、裂头蚴、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、急性髓性白血病等。值得注意的是，研究发现氯硝柳胺对肿瘤干细胞也有很强的抑制作用，如若联合其他常用化疗药物，可以降低甚至避免肿瘤细胞的耐药现象。但氯硝柳胺的毒理学性质却比较特殊。拜耳公司披露的毒理学试验结果表明，氯硝柳胺小鼠口服急性ld50为1500mg/kg，是非常安全的；而静注急性ld50仅为8mg/kg，显示出较大的急性毒性。进一步的研究表明，氯硝柳胺可以使得外周血管舒张、回心血液减少血压降低，因此才有较大的急性静注毒性。

氯硝柳胺分子量为327g/mol，水溶解度较低，约为0.23μg/ml，具有酚羟基结构呈弱酸性。如若作为抗肿瘤药物应用，首先应克服其溶解度问题。为此，研究者们进行了诸多尝试。制备共晶、包合物或盐类是常用于提高溶解度的方法，氯硝柳胺乙醇胺盐、氯硝柳胺哌嗪盐、2-氨基噻唑/氯硝柳胺共晶、氯硝柳胺/环糊精包合物等均能够在一定程度上提高溶解度。但由于氯硝柳胺生物利用度较低，且代谢排泄均较快，口服给药往往不能实现肿瘤部位的药物富集，因此不能满足抗肿瘤治疗的需要。酚羟基是合成氯硝柳胺水溶性衍生物的良好靶点，通过引入聚乙二醇、磷酸、氨乙基等水溶性基团，大大提高了水溶解度，但新化合物的活性、毒理学、药动学行为还需要重新评估。学者们对氯硝柳胺纳米制剂也做了一些研究，但并未妥善解决载药量和稳定性问题；另外考虑到氯硝柳胺较大的急性静注毒性，直接静脉给药也必然存在一定的风险。

纳米晶体是指纳米尺度的药物晶体，与其他纳米制剂相比，纳晶可以以更少的辅料用量，实现更高的载药量。迄今为止共有6种包含纳晶制剂成功上市，除可供肌注外，其余均是口服片剂或胶囊。工业化生产纳晶的方法主要有两种，高压均质法和湿法介质研磨，均属于“top-down”法，意为将通过机械力将大颗粒的药物晶体粉碎至所需粒径。相比另一类控制药物分子结晶过程的“bottom-up”法，例如反溶剂法，“top-down”法更可控。而在实验室中，常将这两类方法相结合来制备纳晶。目前针对氯硝柳胺纳晶的研究十分有限，有限的两例报道中均采用吐温80作为纳晶的稳定剂，实现了10mg/ml的载药量；但是吐温类具有潜在的溶血和过敏风险，应尽量减少使用。而迄今未见静注安全性较好的辅料，如泊洛沙姆类，用作氯硝柳胺纳晶稳定剂的报道。

温敏凝胶是一类具有广阔应用前景的新兴材料，主要包括聚乙二醇类嵌段共聚物、壳聚糖类水凝胶等。温敏凝胶在浓度较低时，以胶束形式存在，当浓度足够高时即呈现温敏特性：在相变温度以下呈液态，在相变温度以上呈固态。温敏凝胶的相变温度随凝胶浓度升高而降低，相变温度低于37℃的温敏凝胶可以在体内形成凝胶药物储库，缓慢释放药物。在体温下，相变温度越低的凝胶固化越快；同时，凝胶聚合物分子具有良好的生物相容性，可在体内被降解，无需手术取出。

考虑到氯硝柳胺较大的静注急性毒性，局部的缓控释给药是比较合适的给药方式。因此，将氯硝柳胺纳晶载入到温敏凝胶中，既能实现较高的载药量又能实现局部的药物缓释；综合氯硝柳胺的理化性质和药理活性，此给药策略较为合理。

技术实现要素：

本发明的目的是将具有较大急性静注毒性的氯硝柳胺载入plga-peg-plga类温敏凝胶中，经瘤内注射在实体瘤内部形成药物凝胶储库，缓慢释放药物并发挥长效抗肿瘤作用。因此，本发明涉及一种局部缓释的氯硝柳胺纳晶温敏凝胶的制备方法及用途。

一种氯硝柳胺纳晶温敏凝胶，其特征在于：含有氯硝柳胺，泊洛沙姆188，plga-peg-plga类温敏凝胶。

所述的氯硝柳胺和泊洛沙姆188的质量比为1:1-3:1。

所述的氯硝柳胺的浓度为2-3mg/ml，温敏凝胶的浓度包括10-20％，此浓度范围下相应的相变温度为38-35℃。

纳晶的粒径为160-230nm。

所述的氯硝柳胺纳晶温敏凝胶的制备方法，其特征在于：按步骤如下实现

a将氯硝柳胺溶于乙醇和丙酮的混合溶剂作为有机相；

b将泊洛沙姆188溶于水作为水相；

c在搅拌下将有机相逐滴加入水相中；

d旋蒸除去有机溶剂；

e高压均质数次即可得到氯硝柳胺纳晶混悬液；

f在搅拌下将凝胶基质溶于氯硝柳胺纳晶混悬液即可得到氯硝柳胺纳晶温敏凝胶。

所述的氯硝柳胺纳晶温敏凝胶的制备方法，其特征在于：

步骤a-c中所述的搅拌速率为500-1000rpm，步骤d中所述的旋蒸温度为42-45℃；步骤a中所述的乙醇和丙酮的混合溶剂比为1:1；步骤e中所述的高压均质压力为800-1200bar，均质次数为10-20次；步骤f中所述的搅拌速率为200-400rpm。

所述的氯硝柳胺纳晶温敏凝胶在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步来说：

所述的载氯硝柳胺纳晶温敏凝胶的制备方法，其特征在于：将氯硝柳胺溶于乙醇-丙酮(50/50,v/v)溶液中，然后逐滴分散于泊洛沙姆188水溶液中，旋蒸除去有机溶剂，高压均质制备得到氯硝柳胺纳晶，最后在磁搅拌下将前述得到的氯硝柳胺纳晶缓缓溶于凝胶基质中。

所述的泊洛沙姆188是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，水溶性良好，是一种常用于药剂学领域的非离子型表面活性剂的；同时它注射安全性较好，适合作为植入制剂的辅料。所述的温敏凝胶基质是plga-peg-plga类聚合物，其生物相容性好，可实现体内降解；配成10-20％的水溶液后具有温敏性质，凝胶基质浓度越高相变温度越低，如果相变温度低于体温即可在体内转变成固态的凝胶。

所述的氯硝柳胺和泊洛沙姆188的质量比为1:1-3:1，高压均质条件为1000bar，20次；所述的温敏凝胶为plga-peg-plga类温敏凝胶，其浓度为10-20％。

所述的载氯硝柳胺纳晶温敏凝胶可应用于实体肿瘤内部的缓释给药。经注射进入瘤内后，凝胶即转变成固态，固态凝胶在体内会缓慢的溶蚀释药，以此实现瘤内的长效缓释给药。

有益效果

1、本发明制备的关键点在于：氯硝柳胺溶液应逐滴分散到泊洛沙姆188溶液中，避免出现体积过大的晶体；所述的氯硝柳胺和泊洛沙姆188的质量比为1:1-3:1，泊洛沙姆188用量过高或过低都会导致纳晶不稳定；所述的高压均质条件为1000bar，20次，均质压力或次数不足均会导致粒径增大；所述的plga-peg-plga温敏凝胶浓度为10-20％，相变温度为38-35℃，其中以20％为最优浓度，此时相变温度为35℃。

表1各实施例制备工艺对粒径，pdi，相变温度的影响

\：未能形成纳晶

2、本发明采用反溶剂沉淀法结合高压均质法、以适量泊洛沙姆188作为稳定剂制备氯硝柳胺纳晶。再在匀速搅拌下将适量温敏凝胶基质溶于纳晶溶液之中，最终得到载氯硝柳胺纳晶的温敏凝胶。该制备方法简单易行，载药量高，具有工业化潜力；所用材料生物相容性良好，可实现体内降解；可以在瘤体内部长时间储留，缓慢释放氯硝柳胺，实现长效抗肿瘤作用。

3、肿瘤部位的药物富集对化疗效果影响较大。因此，提高药物的瘤内滞留，一直是重要的研究课题之一。本发明的优点在于：将静注毒性较大的抗肿瘤化合物氯硝柳胺制备成纳晶再载到温敏凝胶中，经瘤内注射后在肿瘤内部形成药物储库，药物随凝胶的溶蚀慢慢释放；药物浓度和制剂稳定性都得到了显著提高；将氯硝柳胺富集在肿瘤内部，提高了抗肿瘤效果的同时降低了系统毒性。

4、本发明制备获得纳晶将氯硝柳胺溶解度提高了11122倍，载药量达到2.558mg/ml。

附图说明

图1是实施例1氯硝柳胺纳晶凝胶的透射电镜图；

图2是实施例2氯硝柳胺纳晶凝胶的粒径分布图；

图3是实施例2氯硝柳胺纳晶凝胶的体外累积释放曲线；

图4是实施例3氯硝柳胺纳晶凝胶的流变学曲线；

图5是实施例13氯硝柳胺纳晶凝胶的mtt实验结果；

图6是实施例14氯硝柳胺纳晶凝胶的细胞摄取实验结果；

图7是实施例15氯硝柳胺纳晶凝胶的药效学实验结果。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明，但本发明并不限于下列实施例包含的内容。

实施例1

将150mg氯硝柳胺溶于4ml乙醇/丙酮(50/50,v/v)混合溶剂中，再将50mg泊洛沙姆188溶于50ml去离子水中。将前述氯硝柳胺溶液在磁搅拌下缓慢滴加到泊洛沙姆188溶液中，旋蒸除去有机溶剂，得到氯硝柳胺粗混悬液。最后将氯硝柳胺粗混悬液在1000bar压力下高压均质20次，得到氯硝柳胺纳晶混悬液。称取约0.25g温敏凝胶基质，加入1ml前述制备得到的氯硝柳胺纳晶混悬液，冰浴下磁搅拌过夜，即可得到凝胶浓度为20％的氯硝柳胺纳晶凝胶。实际测得氯硝柳胺浓度为2.558mg/ml，粒径为172nm，pdi为0.191，凝胶相变温度约为35℃。

实施例2

将150mg氯硝柳胺溶于4ml乙醇/丙酮(50/50,v/v)混合溶剂中，再将75mg泊洛沙姆188溶于50ml去离子水中。将前述氯硝柳胺溶液在磁搅拌下缓慢滴加到泊洛沙姆188溶液中，旋蒸除去有机溶剂，得到氯硝柳胺粗混悬液。最后将氯硝柳胺粗混悬液在1000bar压力下高压均质20次，得到氯硝柳胺纳晶混悬液。称取约0.25g温敏凝胶基质，加入1ml前述制备得到的氯硝柳胺纳晶混悬液，冰浴下磁搅拌过夜，即可得到凝胶浓度为20％的氯硝柳胺纳晶凝胶。实际测得氯硝柳胺浓度为2.417mg/ml，粒径为178nm，pdi为0.187，凝胶相变温度约为35℃。

实施例3

将150mg氯硝柳胺溶于4ml乙醇/丙酮(50/50,v/v)混合溶剂中，再将150mg泊洛沙姆188溶于50ml去离子水中。将前述氯硝柳胺溶液在磁搅拌下缓慢滴加到泊洛沙姆188溶液中，旋蒸除去有机溶剂，得到氯硝柳胺粗混悬液。最后将氯硝柳胺粗混悬液在1000bar压力下高压均质20次，得到氯硝柳胺纳晶混悬液。称取约0.25g温敏凝胶基质，加入1ml前述制备得到的氯硝柳胺纳晶混悬液，冰浴下磁搅拌过夜，即可得到凝胶浓度为20％的氯硝柳胺纳晶凝胶。实际测得氯硝柳胺浓度为2.397mg/ml，粒径为194nm，pdi为0.215，凝胶相变温度约为35℃。

实施例4

将150mg氯硝柳胺溶于4ml乙醇/丙酮(50/50,v/v)混合溶剂中，再将38mg泊洛沙姆188溶于50ml去离子水中。将前述氯硝柳胺溶液在磁搅拌下缓慢滴加到泊洛沙姆188溶液中，旋蒸除去有机溶剂，得到氯硝柳胺粗混悬液。最后将氯硝柳胺粗混悬液在1000bar压力下高压均质20次。因氯硝柳胺和泊洛沙姆188比例不合适，所以未能得到氯硝柳胺纳晶混悬液，也未能继续制备得到氯硝柳胺纳晶凝胶。

实施例5

将150mg氯硝柳胺溶于4ml乙醇/丙酮(50/50,v/v)混合溶剂中，再将30mg泊洛沙姆188溶于50ml去离子水中。将前述氯硝柳胺溶液在磁搅拌下缓慢滴加到泊洛沙姆188溶液中，旋蒸除去有机溶剂，得到氯硝柳胺粗混悬液。最后将氯硝柳胺粗混悬液在1000bar压力下高压均质20次。因氯硝柳胺和泊洛沙姆188比例不合适，所以未能得到氯硝柳胺纳晶混悬液，也未能继续制备得到氯硝柳胺纳晶凝胶。

实施例6

将150mg氯硝柳胺溶于4ml乙醇/丙酮(50/50,v/v)混合溶剂中，再将300mg泊洛沙姆188溶于50ml去离子水中。将前述氯硝柳胺溶液在磁搅拌下缓慢滴加到泊洛沙姆188溶液中，旋蒸除去有机溶剂，得到氯硝柳胺粗混悬液。最后将氯硝柳胺粗混悬液在1000bar压力下高压均质20次。因氯硝柳胺和泊洛沙姆188比例不合适，所以未能得到氯硝柳胺纳晶混悬液，也未能继续制备得到氯硝柳胺纳晶凝胶。

实施例7

将150mg氯硝柳胺溶于4ml乙醇/丙酮(50/50,v/v)混合溶剂中，再将450mg泊洛沙姆188溶于50ml去离子水中。将前述氯硝柳胺溶液在磁搅拌下缓慢滴加到泊洛沙姆188溶液中，旋蒸除去有机溶剂，得到氯硝柳胺粗混悬液。最后将氯硝柳胺粗混悬液在1000bar压力下高压均质20次。因氯硝柳胺和泊洛沙姆188比例不合适，所以未能得到氯硝柳胺纳晶混悬液，也未能继续制备得到氯硝柳胺纳晶凝胶。

实施例8

将150mg氯硝柳胺溶于4ml乙醇/丙酮(50/50,v/v)混合溶剂中，再将50mg泊洛沙姆188溶于50ml去离子水中。将前述氯硝柳胺溶液在磁搅拌下缓慢滴加到泊洛沙姆188溶液中，旋蒸除去有机溶剂，得到氯硝柳胺粗混悬液。最后将氯硝柳胺粗混悬液在1000bar压力下高压均质20次，得到氯硝柳胺纳晶混悬液。称取约0.25g温敏凝胶基质，加入1.42ml前述制备得到的氯硝柳胺纳晶混悬液，冰浴下磁搅拌过夜，即可得到凝胶浓度为15％的氯硝柳胺纳晶凝胶。实际测得氯硝柳胺浓度为2.688mg/ml，粒径为181nm，pdi为0.205，凝胶相变温度约为37℃。因凝胶基质浓度降低，使得相变温度接近体温，凝胶不能在体内快速转变为固态，因而不适用于瘤内注射。

实施例9

将150mg氯硝柳胺溶于4ml乙醇/丙酮(50/50,v/v)混合溶剂中，再将50mg泊洛沙姆188溶于50ml去离子水中。将前述氯硝柳胺溶液在磁搅拌下缓慢滴加到泊洛沙姆188溶液中，旋蒸除去有机溶剂，得到氯硝柳胺粗混悬液。最后将氯硝柳胺粗混悬液在1000bar压力下高压均质20次，得到氯硝柳胺纳晶混悬液。称取约0.25g温敏凝胶基质，加入2.25ml前述制备得到的氯硝柳胺纳晶混悬液，冰浴下磁搅拌过夜，即可得到凝胶浓度为10％的氯硝柳胺纳晶凝胶。实际测得氯硝柳胺浓度为2.770mg/ml，粒径为177nm，pdi为0.199，凝胶相变温度约为38℃。因凝胶基质浓度降低，使得相变温度超过体温，凝胶不能在体内转变为固态，因而不适用于瘤内注射。

实施例10

将150mg氯硝柳胺溶于4ml乙醇/丙酮(50/50,v/v)混合溶剂中，再将50mg泊洛沙姆188溶于50ml去离子水中。将前述氯硝柳胺溶液在磁搅拌下缓慢滴加到泊洛沙姆188溶液中，旋蒸除去有机溶剂，得到氯硝柳胺粗混悬液。最后将氯硝柳胺粗混悬液在500bar压力下高压均质20次，得到氯硝柳胺纳晶混悬液。称取约0.25g温敏凝胶基质，加入1ml前述制备得到的氯硝柳胺纳晶混悬液，冰浴下磁搅拌过夜，即可得到凝胶浓度为20％的氯硝柳胺纳晶凝胶。实际测得氯硝柳胺浓度为2.424mg/ml，粒径为205nm，pdi为0.245，凝胶相变温度约为35℃。均质压力低，导致纳晶粒径和pdi都增大。

实施例11

将150mg氯硝柳胺溶于4ml乙醇/丙酮(50/50,v/v)混合溶剂中，再将50mg泊洛沙姆188溶于50ml去离子水中。将前述氯硝柳胺溶液在磁搅拌下缓慢滴加到泊洛沙姆188溶液中，旋蒸除去有机溶剂，得到氯硝柳胺粗混悬液。最后将氯硝柳胺粗混悬液在1000bar压力下高压均质10次，得到氯硝柳胺纳晶混悬液。称取约0.25g温敏凝胶基质，加入1ml前述制备得到的氯硝柳胺纳晶混悬液，冰浴下磁搅拌过夜，即可得到凝胶浓度为20％的氯硝柳胺纳晶凝胶。实际测得氯硝柳胺浓度为2.390mg/ml，粒径为198nm，pdi为0.251，凝胶相变温度约为35℃。均质次数不足，导致纳晶粒径和pdi都增大。

实施例12：体外释放实验

采用透析法进行体外释放实验考察。分别将含药约0.6mg的氯硝柳胺纳晶(按实施例1制备)和氯硝柳胺纳晶凝胶(按实施例1制备)加入到透析袋(分子量截留3500da)中，在37℃下静置至凝胶固化，再将透析袋浸入至37±0.5℃的200ml释放介质(0.01mph7.4pbs,0.5％tween80)中，以100rpm的速率振摇。在预设的时间点取样0.5ml送液相检测，另外补加等量新鲜溶出介质以维持漏槽条件。

图4结果显示，氯硝柳胺纳晶释放速率较快，48小时即可接近完全释放；而氯硝柳胺纳晶凝胶的释放速率则相对更缓慢，到第6天仍然只释放了不到80％。因此，体外释放实验证明，温敏凝胶的使用可以有效延缓药物的释放。

实施例13：mtt实验

取对数生长期的mda-mb-231细胞，消化后按照每孔10⁴的密度接种在96孔板中，在37℃、5％co2条件下培养24小时。然后吸去培养基，每孔用pbs清洗三遍，加入200μl相应浓度的实施例1制备获得氯硝柳胺纳晶凝胶或氯硝柳胺原料药。将细胞放入孵箱中继续培养24或48小时，加入20μl5mg/ml的mtt溶液继续孵育4小时形成甲瓒结晶。最后，吸去培养基并加入150μldmso，37℃下震荡10分钟摇匀后，在酶标仪上测定各孔490nm处的光密度值。以空白组作为参比计算各给药浓度下的细胞活力，最后用graphpadprism7.0软件计算各组的半数抑制浓度(ic50)。

图5结果显示，实施例1氯硝柳胺纳晶凝胶组在24或48小时给药时间下对mda-mb-231细胞的抑制效果均强于氯硝柳胺原料药。氯硝柳胺处理24小时、氯硝柳胺纳晶凝胶处理24小时、氯硝柳胺处理48小时、氯硝柳胺纳晶凝胶处理48小时的ic50分别为8.029、3.297、0.2658、0.1086μm，纳晶凝胶组的ic50均低于相同给药时间下的氯硝柳胺原料药。因此，氯硝柳胺纳晶凝胶在体外对三阴性乳腺癌细胞有着显著的抑制作用。

实施例14：细胞摄取实验

取对数生长期的mda-mb-231细胞，消化后按照每孔2×10⁵的密度接种在6孔板中，在37℃、5％co2条件下培养24小时。然后吸去培养基，每孔用pbs清洗三遍，加入2ml相当于0.05、1、20μm的实施例1制备获得的氯硝柳胺纳晶凝胶或氯硝柳胺原料药。将细胞放入孵箱中继续培养4小时。然后吸去培养基，用pbs清洗三遍后，每孔加入0.5ml去离子水，在-20℃和室温下反复冻融三次破碎细胞。取100μl悬液，加入三倍体积的乙腈提取并溶解药物，12000rpm离心30分钟取上清进样测定。再用bca比色法定量总蛋白质浓度，用来代表细胞总量；药物浓度除以总蛋白浓度即为每个细胞的药物摄取量。

图6结果显示，实施例1氯硝柳胺纳晶凝胶组在较低浓度下与原料药的摄取量没有显著性差异，在高浓度下摄取量明显多于原料药，这体现了纳晶更高效的摄取方式。

实施例15：体内药效学实验

取4-6周大的雌性裸鼠，每只皮下注射2×10⁶个mda-mb-231细胞，待肿瘤长到约200mm³时，将荷瘤鼠随机平均分为3组，每组5只。每组荷瘤鼠分别瘤内注射100μl生理盐水、空白凝胶、15mg/kg氯硝柳胺纳晶凝胶(按实施例1制备)，给药后观察20天并测量荷瘤鼠的体重、瘤体积。给药第20天处死荷瘤鼠并取下瘤体称重。瘤体积计算公式为：体积＝长×宽²×0.5。

图7结果显示，氯硝柳胺纳晶凝胶组荷瘤鼠的瘤体积和瘤重均低于生理盐水和空白凝胶组，且体重没有显著性差异。这说明氯硝柳胺纳晶凝胶在体内对三阴性乳腺癌细胞有显著的抑制作用，并且表现出较低的毒性。