微生物组合物的新用途的制作方法

微生物组合物的新用途


背景技术：

1.本发明涉及具有精神抑制(镇定)和精神兴奋(刺激)作用的微生物组合物，所述微生物组合物可用于保护健康受试者免于罹患因应激或焦虑引起或加剧的具有行为、心理和/或身体成分的病症，和/或积极影响因应激或焦虑引起或加剧的具有行为、心理和/或身体成分的现有病症。
2.肠道微生物群越来越被认为是中枢神经系统(cns)的主要调节剂，建立了重要的科学研究领域，其已被称为
‘
微生物群
‑
肠
‑
脑轴’，即一种包括神经连接、内分泌和免疫信号传导的双向通信系统。有令人信服的证据表明，肠道微生物群组成在关键应激激素皮质醇(在人中)和皮质酮(在小鼠中)以及其他物种中的相似激素类似物的调节中发挥了作用。包括益生菌和益生元的使用在内的肠道微生物群干预措施已对包括人在内的动物的一些认知和行为状况产生了积极影响。
3.肠道菌群已主要用于通过益生菌对大脑健康产生积极影响，各种双岐杆菌属(bifidobacterium)和乳杆菌属(lactobacillus)菌株已被证明对啮齿动物和人均具有抗焦虑和促认知作用。在进一步的报告，例如国际公布的专利申请号wo 2016/069795和wo 2014/036182中，益生菌(诸如拟杆菌属(bacteroides)细菌)已被证明对自闭症谱系障碍具有积极的影响。然而，尽管单菌株或多菌株益生菌具有修改认知功能和/或行为的潜力，但是它们倾向于对微生物群系产生相对狭窄的谱效应，这是一个局限。当用作治疗剂时，活生物治疗物也具有明显的缺点。胃酸、结肠中的消化过程和厌氧条件是远端肠内活生物治疗物的活力的巨大障碍。此外，活生物治疗物一般作为数十亿个菌落形成单位施用，并且在免疫受损的非常年轻和非常老的受试者中，活生物治疗物都可能变成感染危险。活生物治疗物还具有转移耐药性或细菌毒力基因盒的潜力。此外，活生物治疗物是难以稳定和标准化的产品，并且
‘
化学、制造和控制’是重大挑战。迄今为止，在现代监管良好的市场中，没有活生物治疗物被批准作为药物产品。
4.乳杆菌属(lactobacillus)是革兰氏阳性、兼性厌氧或微需氧、杆状、无芽孢形成的细菌的属。它们是乳酸菌菌群的主要组成部分(即，它们将糖转化为乳酸)。在人中，它们构成了许多身体部位处的微生物群的重要组成部分。乳杆菌属目前含有超过180个物种，并且涵盖各种各样的生物体。
5.我们现已令人惊讶地发现，含有特定乳杆菌属菌株的热灭活细胞的组合物，特别是当此类细胞与培养基组合时，具有精神抑制和精神兴奋作用。这些组合物尤其可用于治疗应激或焦虑，和/或预防因应激或焦虑引起或加剧的具有行为、心理和/或身体成分的病症，包括例如抑郁症、情绪紊乱、社交功能失调的病症、自闭症、自闭症谱系障碍、创伤后应激障碍、慢性应激和一系列其他应激相关疾病以及肠易激综合征。这些组合物还可用于保护受试者免受纤维肌痛、强迫性行为、成瘾或成瘾行为及其治疗的影响。含有特定乳杆菌属菌株的热灭活细胞的组合物，尤其是当此类细胞与培养基组合时，对于保护健康受试者免受由升高的应激和/或焦虑水平引起或加剧的病症特别有效。
6.不希望受任何一种机械理论的束缚，本发明的热灭活细菌还对肠道微生物群具有
深远的影响，肠道微生物群的组成和多样性均发生变化。因此，假定细菌是精神益生菌(psychobiotics)，即它们对大脑表现出细菌介导的影响。
7.本发明的一种特定产品是是作为补液和/或饮食措施的补充的成人和儿童腹泻对症治疗剂出售的。然而，其迄今尚未被报道为表现出精神抑制或精神兴奋作用，或对微生物群
‑
肠
‑
脑轴有任何影响。
8.中的活性组分是从含有乳杆菌lb菌株(发酵乳杆菌、德氏乳杆菌的组合)的热灭活细胞和发酵培养基的培养液得到的。与本发明的包含死乳杆菌属细胞的其他活性产品一起，当用于预防或积极影响因应激或焦虑引起或加剧的具有行为、心理和/或身体成分的病症时，具有优于含有活生物体(诸如益生菌)的产品的许多潜在优点。使用死生物体的特别优势包括组成和效果的一致性、易于存储、没有使易感染患者感染的风险、细菌毒力或抗生素抗性盒不会易位，并且当与抗生素或抗真菌剂结合使用时，该产品保持活性。


技术实现要素：

9.在整个本文件中，术语“治疗(treatment/treating)”还旨在涵盖本公开的组合物针对所陈述的病症或障碍的预防性和保护性使用。
10.本公开的一个方面提供了一种包含发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)死细胞和/或德氏乳杆菌(lactobacillus delbrueckii)死细胞的组合物，所述组合物用于在人或非人动物受试者中产生精神益生作用(psychobiotic effect)。
11.另一个方面提供了一种包含发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞的组合物，所述组合物用于在人或非人动物受试者中产生精神益生作用，其中所述精神益生作用是通过改变人或非人动物肠道微生物群的组成和/或多样性来实现。
12.进一步方面提供了一种包含发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞的组合物，所述组合物用于在人或非人动物受试者中产生精神益生作用，其中所述精神益生作用是通过修改(例如减少)人或非人动物肠道内存在的别样杆菌属(alistipes)和/或臭味菌属(odoribacter)物种的量来实现的。
13.另一个方面提供了一种治疗动物(包括人)患者的因应激或焦虑引起或加剧的具有行为、心理和/或身体成分的病症的方法，所述方法包括向所述患者施用精神抑制和/或精神兴奋有效量的包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞。
14.进一步的方面提供了一种治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的情绪紊乱的动物(包括人)患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞。
15.进一步的方面提供了一种治疗患有因应激或焦虑加剧的自闭症或自闭症谱系障碍(asd)的动物(包括人)患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞。
16.进一步的方面提供了一种治疗患有应激或焦虑的动物(包括人)患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德
氏乳杆菌死细胞。
17.进一步的方面提供了一种治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的社交性障碍的动物(包括人)患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞。
18.进一步的方面提供了一种治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的抑郁症的动物(包括人)患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞。
19.进一步的方面提供了一种治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的创伤后应激障碍的动物(包括人)患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞。
20.进一步的方面提供了一种治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的肠易激综合征的动物(包括人)的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞。
21.进一步的方面提供了包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞，所述死细胞用于治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的具有行为、心理和/或身体成分的病症的动物(包括人)患者。
22.进一步的方面提供了包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞，所述死细胞用于治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的情绪紊乱的动物(包括人)患者。
23.进一步的方面提供了包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞，所述死细胞用于治疗患有因应激或焦虑而加剧的自闭症或自闭症谱系障碍(asd)的动物(包括人)患者。
24.进一步的方面提供了包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞，所述死细胞用于在用于治疗患有应激或焦虑的动物(包括人)患者的药物组合物中使用。
25.进一步的方面提供了包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞，所述死细胞用于在用于治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的创伤后应激障碍的动物(包括人)患者的药物组合物中使用。
26.进一步的方面提供了包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞，所述死细胞用于在用于治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的社交性障碍的动物(包括人)患者的药物组合物中使用。
27.进一步的方面提供了包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞，所述死细胞用于在用于治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的抑郁症的动物(包括人)患者的药物组合物中使用。
28.进一步的方面提供了包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞，所述死细胞用于在用于治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的肠易激综合征的动物(包括人)患者的药物组合物中使用。
29.进一步的方面提供了一种包含包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞的药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有因应激或焦虑引起或加
剧的具有行为、心理和/或身体成分的病症的动物(包括人)患者。
30.进一步的方面提供了一种包含包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞的药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的情绪紊乱的动物(包括人)患者。
31.进一步的方面提供了一种包含包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞的药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有因应激或焦虑而加剧的自闭症或自闭症谱系障碍(asd)的动物(包括人)患者。
32.进一步的方面提供了一种包含包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞的药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有应激或焦虑的动物(包括人)患者。
33.进一步的方面提供了一种包含包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞的药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的社交性障碍的动物(包括人)患者。
34.进一步的方面提供了一种包含包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞的药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的抑郁症的动物(包括人)患者。
35.进一步的方面提供了一种包含包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞的药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的创伤后应激障碍的动物(包括人)患者。
36.进一步的方面提供了一种包含包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞的药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的肠易激综合征的动物(包括人)患者。
37.进一步的方面提供了一种包含包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞的药物组合物，所述药物组合物用于降低人或非人动物受试者中的皮质类固醇水平。因此，例如，此类死细胞能够降低人受试者中的皮质醇水平和啮齿动物诸如小鼠中的皮质酮水平。
38.在第一特定实施方案中，将上述方面1至25中任一项中的前述包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞与培养基一起施用。
39.在第二特定实施方案中，将上述方面1至25中任一项中的前述包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞作为培养溶液的一部分施用，所述培养溶液任选地还含有培养基。
40.在第三特定实施方案中，在施用之前将上述特定实施方案2的培养溶液干燥，例如冷冻干燥。
41.在第四特定实施方案中，在施用之前将上述特定实施方案3的经干燥的培养溶液与乳糖混合。
42.在第五特定实施方案中，根据上述方面1至25中任一项的施用的产品是
43.进一步的实施方案是一种包含包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞的药物组合物，所述药物组合物用于治疗可通过改变人或非人动物肠道微生物群的组成和/或多样性，例如通过减少肠道中存在的别样杆菌属或臭味菌属物种
的量来改善的病症。
44.另一个实施方案是一种包含包括乳杆菌lb死细胞在内的发酵乳杆菌死细胞和/或德氏乳杆菌死细胞的药物组合物，所述药物组合物用于通过改变人或非人动物肠道微生物群的组成和/或多样性，例如通过减少肠道中存在的别样杆菌属或臭味菌属物种的量来治疗患有因应激或焦虑引起或加剧的具有行为、心理和/或身体成分的病症。
附图说明
45.图1是用于进行行为学动物实验的时间线的示意图。
46.图2是旷场(open field,of)测试和新奇物体识别(novel object recognition,nor)测试以及用于nor测试的物体的示意图。
47.图3示出了在埋珠(marble burying,mb)实验期间在30分钟探索之前和之后的测试笼。
48.图4是3室社交测试(3
‑
chambered social test,3ct)的示意图。
49.图5示出了用于高架十字迷宫(elevated plus maze,epm)测试的装置。
50.图6示出了用于悬尾测试(tail suspension test,tst)的装置。
51.图7示出了of测试期间使用对照(蓝色)或adr
‑
159(橙色)饮食的动物的平均行进距离(左曲线图)、在中部区域中耗费的平均时间(中间曲线图)和行进速度(右曲线图)。误差条代表sem。*p≤0.05；**p≤0.01。
52.图8示出了在of测试期间使用对照(左迹线)和adr
‑
159(右迹线)饮食的代表性动物的运动迹线。
53.图9示出了在nor测试期间使用对照(蓝色)或adr
‑
159(橙色)饮食的动物对新奇物体的平均偏好。误差条代表sem。
54.图10示出了在mb测试中由使用对照(蓝色)或adr
‑
159(橙色)饮食的动物掩埋的弹珠的数量。误差条代表sem。
55.图11示出了在3ct的居住(左迹线)、社交性(中间迹线)和社交新奇(右迹线)阶段期间使用对照(顶部迹线)或adr
‑
159(底部迹线)饮食的代表性动物的运动迹线。
56.图12示出了在3ct期间由使用对照(蓝色)或adr
‑
159(橙色)饮食的动物在居住(a、b、c)、社交性(d、e、f)和社交新奇(g、h、i)阶段期间在各个室中所耗费的平均时间。误差条代表sem。
57.图13示出了在3ct期间使用对照(蓝色)或adr
‑
159(橙色)饮食的动物的平均速度(右曲线图)和行进距离(左曲线图)。误差条代表sem。
58.图14示出了在3ct期间使用对照(蓝色)或adr
‑
159(橙色)饮食的动物在居住(a、b)、社交性(d、e)和社交新奇(g、h)阶段期间与各物体互动所耗费的平均时间(总互动时间)(a、d、g)或与单个物体互动所耗费的平均时间(b、e、h)。曲线图(c)、(f)和(i)的每一者中分别示出了在居住、社交性和社交新奇阶段期间的辨别率。误差条代表sem。
59.图15示出了在epm测试期间使用对照(蓝色)或adr
‑
159(橙色)饮食的动物在闭(a)或开(d)臂中所耗费的时间、进入闭(b)或开(e)臂的频率以及进入闭(c)或开(f)臂的迟延。误差条代表sem。
60.图16示出了在epm测试期间使用对照(蓝色)或adr
‑
159(橙色)饮食的动物的平均
速度(左曲线图)和行进距离(右曲线图)。误差条代表sem。
61.图17示出了在胭脂红测试期间使用对照(蓝色)或adr
‑
159(橙色)饮食的小鼠中的平均肠转变时间。误差条代表sem。
62.图18示出了在tst期间使用对照(蓝色)或adr
‑
159(橙色)饮食的动物的平均不动时间。误差条代表sem。***p≤0.001
63.图19示出了在fst期间使用对照(蓝色)或adr
‑
159(橙色)饮食的动物被动游泳的平均时间。误差条代表sem。
64.图20示出了使用对照(蓝色)或adr
‑
159(橙色)饮食的动物在fst之前(t0)和之后30、60、90和120分钟的平均基线(t0)皮质酮水平(左曲线图)和皮质酮水平的变化(右曲线图)。误差条代表sem。*p<0.05。
65.图21示出了使用对照和adr
‑
159饮食的动物中基于16s rrna序列的主要属在整个时间点的中值相对丰度。在底部处示出了颜色图例。为简单起见，将丰度低于1％的所有属分组到一起。
66.图22示出了在用对照(粉红色)和adr
‑
159(蓝色)饮食进行饮食干预之前(第0周)和期间的微生物群组成的pcoa图。每个点代表每个给定时间点处的单独动物。椭圆表示每个组的75％的置信区间。
67.图23示出了在使用对照和adr
‑
159饮食的动物内选择的差异丰富的otu。在最后三个时间点(第5周、第6周和第8周)中的至少两个处，基于差异丰度标准选择otu。
68.图24示出了当与使用对照饮食的动物的微生物群相比时，在任何时间点在使用adr
‑
159饮食的动物中显著不同的所有otu的补充列表。
具体实施方式
69.本公开涉及具有精神抑制(镇定)和精神兴奋(刺激)作用的微生物组合物，所述微生物组合物可用于保护健康受试者免于罹患因应激或焦虑引起或加剧的具有行为、心理和/或身体成分的病症，并且可积极影响因应激或焦虑引起或加剧的具有行为、心理和/或身体成分的现有病症。
70.本公开还涉及包含包括乳酸杆菌lb在内的发酵乳杆菌、德氏乳杆菌或它们的混合物的死细胞的组合物用于治疗应激或焦虑，或者治疗或预防因应激或焦虑引起或加剧的具有行为、心理和/或身体成分的病症的用途，所述病症包括例如抑郁症、情绪紊乱、社交功能失调的病症、自闭症、自闭症谱系障碍、创伤后应激障碍、慢性应激和一系列其他应激相关疾病以及肠易激综合征。此类组合物还可用于保护受试者免受纤维肌痛、强迫性行为或成瘾行为的影响。
71.乳酸杆菌lb菌株可以方便地从人粪便中分离，并且由两个独立的物种，即发酵乳杆菌和德氏乳杆菌组成。发酵培养基中的乳酸杆菌lb于1992年8月26日以参考代码ma 65/4e保藏在collection nationale de cultures de microorganismes(cncm)中(发酵乳杆菌ma65/4e
‑
1b根据《布达佩斯条约》的规定于2003年3月27日转化为国际保藏，保藏单位为国家微生物保藏中心(cncm；保藏单位地址为法国巴黎15区多克特鲁大街28号巴斯德研究所，邮编：75724)，保藏号为cncm i
‑
2998；德氏乳杆菌ma65/4e
‑
2z根据《布达佩斯条约》的规定于2013年12月20日转换为国际保藏，保藏单位为国家微生物保藏中心(cncm；保藏单位地
址为法国巴黎15区多克特鲁大街28号巴斯德研究所，邮编：75724)，保藏号为cncm i
‑
4831)。死乳杆菌lb细胞可以通过将活细胞在发酵培养基中在约110℃下加热约1小时而获得。发酵乳杆菌、德氏乳杆菌或它们的混合物的死细胞可以以类似方式通过热杀灭过程获得。
72.当用作混合物时，发酵乳杆菌与德氏乳杆菌的重量比可以是约99:1至约1:99，例如约9:1至1:9(包括9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9)的任何合适的比率。发酵乳杆菌与德氏乳杆菌的重量比可特别地为约9:1。
73.可以通过如下方式制备：将乳杆菌lb死细胞与发酵培养基一起干燥(例如，通过冻干、喷雾干燥或流化床干燥)来制备，然后配制成用于在本发明中使用的合适的组合物。在一个特定方面中，可以在干燥之前将乳糖添加到经湿发酵的产品中。在另一方面中，乳糖也可以在干燥后作为配制步骤的一部分添加。
74.和adr
‑
159都含有约9:1比率的热灭活的发酵乳杆菌和德氏乳杆菌在培养基中的干燥组合。adr
‑
159可以以与类似的方式制备，不同之处在于adr
‑
159是在流化床中干燥而不是冷冻干燥的。
75.包括乳杆菌lb在内的发酵乳杆菌、德氏乳杆菌或它们的混合物的死细胞也可以通过省略干燥步骤或用合适的液体诸如水重构干燥的产品来以含有或不含乳糖的液体形式使用。
76.在代表性的鼠科动物行为测试中，将adr
‑
159掺入到小鼠食物中。使长时间连续暴露于adr
‑
159的小鼠经受一组鼠科动物行为测试。对使用不含adr
‑
159的饮食的对照小鼠执行类似的行为测试。
77.以下行为测试是根据或使用与文献中牢固确立的测试非常相关的程序执行的。然而，一些测试与随后引用的文献程序略有不同和偏离，因此请注意后面的实施例部分，其中详细描述了所执行的测试。
78.鼠科动物行为测试：
79.1.nor：使用新奇物体识别(nor)测试评估认知功能和记忆—参见bevins r.a.等人，nature protocols,2016，第1(3)卷，第1306
‑
1311页。
80.2.of和epm：使用旷场(of)和高架十字迷宫(epm)测试评估类焦虑行为
–
参见sweeney ff、o'leary of、cryan jf,activation but not blockade of gabab receptors during early
‑
life alters anxiety in adulthood in balb/c mice.neuropharmacology.81:303
‑
10(2014)。
81.3.3ct：在三室测试(3ct)中评估类焦虑行为和社交性—参见desbonnet l、clarke g、shanahan f、dinan tg、cryan jf,microbiota is essential for social development in the mouse,mol.psychiatry.19(2):146
‑
8(2014)。
82.4.mb：使用埋珠(mb)测试评估与新奇恐怖症(恐惧新事物)有关的行为的量化—参见savignac h.m.等人，official journal of the european gastrointestinal motility society，第26(11)卷，第1615
‑
1627页(2014)。mb测试也是焦虑、强迫性行为和刻板行为的量度。
83.5.tst：悬尾测试(tst)被广泛用于筛选具有潜在抗抑郁作用的化合物—参见
steru l.等人，psychopharmacology，第85(3)卷，第367
‑
370页(1985)。
84.6.fst：强迫游泳测试(fst)也被用来测量抑郁行为—参见porsoit r.d.等人，archives internationales de pharmacodynamie et de therapie，第229(2)卷，第327
‑
336页(1977)和cryan j.f.等人，molecular psychiatry，第9(4)卷，第326
‑
357页(2004)。它是比tst更加应激的测试，因此在该测试之前采集血样并且在该测试之后以规律间隔采集血样，以测量皮质酮水平。
85.出乎意料的是，在许多上述测试中，使用adr
‑
159饮食的小鼠表现出与使用不含adr
‑
159的饮食的小鼠的行为差异，包括增加的社会互动(3ct)和增加的不动(tst)。此外，生理读出表明，使用adr
‑
159饮食的小鼠中皮质酮(一种应激相关激素)的基线水平相对于对照小鼠较低。与此同时，使用adr
‑
159饮食的小鼠的微生物群发生变化，表明微生物群组成的改变是所看到的行为变化的潜在机制。
86.鼠科动物测试结果提供了对以下的支持：向动物(包括人)患者施用包括乳杆菌lb在内的发酵乳杆菌、德氏乳杆菌或它们的混合物的死细胞，例如在经配制产品诸如adr
‑
159或内的所述死细胞，能有效地管理应激和焦虑，增强行为模式，并且还能保护免于罹患因应激或焦虑引起或加剧的病症，或者还能治疗所述病症。
87.在另一方面中，本公开的组合物可用于保护免于罹患由酒精和/或药物使用引起的情绪或社交功能障碍，包括减轻应激缓解剂诸如吸烟的使用。在药物使用的情况下，该障碍可能是由于药物滥用或治疗剂量的药物的副作用引起的。
88.在进一步的方面中，本公开的组合物可用于治疗由于使药物成瘾的人受试者戒除药物(例如尼古丁)而产生的应激以及应激相关病症。
89.包括乳杆菌lb在内的发酵乳杆菌、德氏乳杆菌或它们的混合物的死细胞在本发明的组合物中以足以实现所需作用的量存在。在本发明的一个示例性实施方案中，乳杆菌lb菌株的死细胞以约10亿或更多个细胞/g，例如约100亿至约1000亿个细胞/g(包括约400亿至约800亿个细胞/g(例如约600亿个细胞/g))的比例存在于本发明的组合物中。
90.本公开的组合物可以以合适的剂量经口施用，所述剂量将根据诸如受试者的年龄、体重和性别，待治疗的病症，施用的持续时间和施用途径的因素变化。普通训练有素的医生或兽医可以容易地确定和开出本公开的药物组合物针对相应人或非人动物患者的有效剂量。可以方便地每天一次或两次地向患者施用呈合适剂型形式的本公开的药物组合物。在婴儿或幼儿中，基于在20kg至40kg范围内的体重，可以施用成人剂量的约1/2，并且基于小于20kg的体重，可以施用成人剂量的约1/4。
91.呈例如标准药物剂型(诸如胶囊或片剂)的形式的本公开组合物的方便单位剂量可以是每天一次或两次向成年人患者施用的至多约2000mg的任何有效剂量。
92.本公开的组合物也可以作为食物或营养补充剂或在食物(例如酸奶)中施用。在这种情况下，可摄入高达约100g的非常高的剂量。
93.本公开的药物组合物可以使用药学上可用的载体和/或赋形剂配制，并且根据本领域普通技术人员可以容易地执行的方法以单位容量制备或容纳在高剂量容器中。在此，剂型可以是片剂、胶囊、颗粒剂、粉剂、含有粉末的小袋，或液体(诸如含有水性介质的溶液、悬浮液或乳液)。
94.例如，为了将药物组合物配制成胶囊，可以将经干燥的(例如冻干的)包括乳杆菌
lb在内的发酵乳杆菌、德氏乳杆菌或它们的混合物的死细胞(任选地与发酵培养基和/或冻干添加剂一起)与一种或多种合适、无毒的药学上可用的无活性载体和赋形剂混合。示例包括粘合剂、润滑剂、崩解剂、稀释剂、着色剂和干燥剂。合适的粘合剂可以是但不限于天然糖，例如淀粉、明胶、葡萄糖或β
‑
乳糖；天然或合成树胶，例如玉米甜味剂、阿拉伯胶、黄蓍胶；或油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠或氯化钠。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土或黄原胶。合适的润滑剂包括滑石和硬脂酸镁。合适的干燥剂包括硅酸，并且合适的稀释剂包括乳糖，诸如无水乳糖。合适的冻干添加剂包括乳糖一水合物和金属碳酸盐(诸如碳酸钙)。产品混合物可以容纳在任何标准的胶囊外壳中，例如容纳在明胶胶囊中。
95.在另一个示例中，可以通过如下方式来制备用于口服混悬剂的呈粉末形式的本公开的药物组合物：将经干燥的(例如冻干的)发酵乳杆菌和/或德氏乳杆菌的死细胞(任选地与发酵培养基和/或冻干添加剂一起)与一种或多种合适、无毒的药学上可用的无活性载体和赋形剂混合。示例包括稀释剂、调味剂、甜味剂和干燥剂。合适的干燥剂包括硅酸，并且合适的稀释剂包括乳糖，例如无水乳糖或蔗糖，后者也可以用作甜味剂。合适的冻干添加剂包括乳糖一水合物和金属碳酸盐(诸如碳酸钙)。粉末产品可容纳在准备好与可饮用液体混合的任何标准小袋中。
96.用于口服施用的组合物也可以是液体或固体食物或营养产品(例如营养补充剂)的一部分。示例包括奶、酸奶或酸奶型产品、奶酪、冰淇淋、基于谷物的产品、基于奶的粉末、营养配方食品、婴儿配方食品、营养配方食品、经干燥的口服磨粒或粉末、湿的口服糊剂或胶状物、用于干管饲喂的磨粒或粉末，或用于湿管饲喂的流体。
97.此外，还可存在任选的另外的活性成分以与本公开的组合物一起使用。任选的活性成分包括例如维生素、抗生素、益生菌、益生元、抗焦虑药、抗抑郁药和情绪增强剂。一种或多种另外的活性成分和本公开的组合物可以共施用或作为单独的组合物分开(例如顺序地)施用。替代地，可以将一种或多种活性成分与发酵乳杆菌和/或德氏乳杆菌的死细胞掺入到同一组合物中。
98.用于与本公开的组合物组合使用的合适药物产品包括：选择性血清素再摄取抑制剂(ssri)；血清素
‑
去甲肾上腺素再摄取抑制剂；三环类抗抑郁药；四环类抗抑郁药；苯二氮卓类；单胺氧化酶抑制剂；阿片类药物和具有阿片样副作用的药物。
99.虽然本文参考某些例示性实施方案和具体实施例对本公开进行了描述，但是本领域的技术人员应理解，可在不背离本发明的精神和范围的情况下在形式和细节方面进行修改。
100.实施例部分
101.a.材料和方法
102.1.制备补充有adr
‑
159的小鼠食物
103.将的研究变体经编码adr
‑
159掺入到标准小鼠食物[2018s teklad global 18％蛋白质啮齿动物饮食(envigo)]中至最终浓度为5％。
[0104]
2.动物和笼养条件
[0105]
使用24只八周龄的雄性c57bl/6小鼠。将动物随机分入六个丰富化(纸卷芯和碎纸)笼子中，每个笼子存放4只小鼠，并让所述小鼠在6天内适应环境。12只动物(3个笼子)在
整个研究中自由采食小鼠食物[2018s teklad global 18％蛋白质啮齿动物饮食(envigo)]，而其他12只动物(3个笼子)在整个研究中自由采食补充有5％adr
‑
159的小鼠食物。存放室是温度(21
±
1℃)和湿度(55
±
10％)受控的并且处于12小时光/暗循环中。所有实验均是按照欧洲指令86/609/eec、2007/526/65/ec的建议进行的，并且是由科克大学动物实验伦理委员会(animal experimentation ethics committee of university college cork)批准的。每周给动物称重，并收集粪便样品进行16s宏基因组学研究。另外，通过称量喂料器来监测饲料消耗。
[0106]
在给小鼠饲喂食物或补充有5％adr
‑
159的食物3周后，根据图1中的方案使动物顺序地经受一系列行为测试。让各个动物(或各笼的动物)在测试前适应测试室30
‑
60分钟，并随机测试以防止偏倚。从初次给动物饲喂食物或补充有5％adr
‑
159的食物起总共8周后，处死小鼠，并且收集其躯干血和全脑(在干冰上急速冷冻)。
[0107]
b.行为测试
[0108]
1.旷场/新奇物体识别(of/nor)
–
参见图2
[0109]
将小鼠放在弱光(在场地水平下的60lux)下的灰色塑料矩形盒子(40
×
32
×
23cm，长
×
宽
×
高)的中间10分钟，以评定其对新奇的应激的环境的反应并测量其自发活动。这被称为“居住阶段”。在24小时后，将同一个小鼠放在同一个盒子的中间10分钟，这次该盒子具有两个相同的物体(瓶子或罐头)。这被称为“熟悉阶段”。再过24小时后，将同一个小鼠放在同一个盒子中10分钟，该盒子中两个相同的物品中的一个被替换成一个新物体(结果是每个盒子里有一个瓶子和一个罐子)。这被称为“新奇阶段”。一次用四只不同的小鼠并行地进行该实验。在每个阶段之后，将小鼠放回它们的居住笼中。将盒子和物体用70％的酒精清洁，以避免各个阶段之间的任何提示气味。使用天花板相机对实验进行录像，以用于进一步的参数分析。使用秒表对与物体的互动(包括与嘴、鼻子或爪的任何接触)进行评分，并计算出相对于熟悉物体而言对新奇物体的偏好百分比。在物体的顶部上攀爬不被视为互动。此外，在居住阶段期间，使用ethovision xt软件8.5版(noldus,tracksys,nottingham,uk)来测量在盒子内行进的距离和在中心区域(表面的50％)中耗费的时间。
[0110]
2.埋珠(mb)
–
参见图3
[0111]
将小鼠单独放入新盒子(38
×
25
×
18cm，长
×
宽
×
高)中，该盒子里装满了木屑(5cm)，并且在表面上含有20颗弹珠(5排弹珠均匀地离墙2cm远并且间隔2cm)。在三十分钟后，记录超过2/3的表面被掩埋的弹珠的数量。被掩埋的弹珠数量越高，表示焦虑程度越高。在各个实验之间用70％酒精清洁盒子和弹珠，以避免任何提示气味。
[0112]
3.三室社交测试(3ct)
–
参见图4
[0113]
(a)装置
[0114]
该装置是矩形的三室盒子(36cm
×
19cm)。带有半圆形开口(高3.5cm，宽4.5cm)的分隔壁允许进入每个室。在每个侧室内的两侧对称位置处放置两个相同的杯状丝线(wire)笼子(底部直径为9cm并且高度为17cm，并且笼条间隔开以允许接触，但阻止打架)。
[0115]
(b)测试
[0116]
该测试具有以下各10分钟的三个阶段：1)居住；2)小鼠与物体；
[0117]
3)新的小鼠与熟悉的小鼠。使用天花板相机对实验录像，以供使用两个秒表进行进一步的参数分析。对于第一阶段，将测试小鼠放入中间室内，并让其探索整个盒子(盒子
里面有空的小丝线笼)以进行10分钟的习惯训练。在习惯时期之后，通过将隔板翻转短间距而将测试小鼠容纳在中间区段中，同时将物体(黄色鸭子)放在一个侧室中的网笼中，并将陌生的同种雄性小鼠(事先未接触测试物体)放在另一侧室中的网笼中。在第二阶段期间，将隔板翻转过来，从而允许小鼠探索整个盒子10分钟。在第三阶段中，用充当新小鼠的陌生小鼠代替物体(黄色的塑料鸭子)，并且在另一个室中，在第二阶段中使用的小鼠保持不变，现在充当熟悉的小鼠。在每次试验后，所有腔室和杯状丝线笼均用70％乙醇清洁，并干燥以防止嗅觉提示偏倚并确保适当的消毒。评估了在每个室中探索物体或小鼠所耗费的时间。将陌生小鼠在左侧室和右侧室中的位置在各次试验之间系统地交替。在习惯整个场地的最初10分钟期间，确认了先天性侧偏爱的缺乏。针对每个阶段单独地测量和分析与每个丝线笼互动的时间(以秒为单位)。针对每个阶段如下那样计算鉴别比(dr)：
[0118][0119]
计算每个阶段的鉴别指数(di)：
[0120][0121]
其中x和y代表：
[0122][0123][0124]
另外，使用ethovision xt软件第8.5版来测量在每个室中耗费的时间以及每个阶段期间的速度和行进距离。
[0125]
4.高架十字迷宫(epm)—参见图5
[0126]
将灰色的塑料十字形迷宫从地面抬高一米，包括两个开(恐惧的)臂和两个闭(安全的)臂(臂长30cm；臂宽5cm；壁高20cm或无壁)。实验是在红光(约5lux)下进行的。将小鼠单独放置到面对开臂的迷宫中心处(以避免直接进入闭臂)，并让其自由探索5分钟。将迷宫用70％酒精清洁以避免各次试验之间的任何提示气味。使用天花板相机对实验进行录像，以便使用ethovision软件(第8.5版，noldus,tracksys,nottingham,uk)进行进一步参数分析。测量在臂中耗费的时间、进入臂的次数(进入臂被定义为所有四个爪子都在臂内)和在每个臂中的迟延(进入的延迟)以及移动的速度和距离。
[0127]
5.胭脂红(c)
[0128]
将小鼠单独地在不能获得食物或水的情况下饲养3小时，在此之后用100
‑
200μl不可消化的胭脂红(6％的在0.5％甲基纤维素中的溶液)对动物进行管饲。在管饲后，以20分钟的间隔监测具有各个动物的笼子，直到每只小鼠首次出现红色粪便颗粒(最多长达7小时)，在此之后将小鼠放回居住笼。过渡时间(分钟)计算如下：
[0129]
过渡时间＝(检测到第一个红色颗粒的时间)
‑
(管饲时间)
[0130]
6.悬尾测试(tst)
–
参见图6
effects.methods ecol evol 3:89
–
101(2012)]所建议的那样执行的。其次，为了鉴定与对照相比在治疗中差异表达的所有物种，执行了以下两项测试：使用不太严格的校正模式(相当于错误发现率(false discovery rate))执行社区分析(ancom；mandal s等人，microbial ecology in health and disease 2015，第26卷，第27663页)；以及使用沃德检验(wald test)执行基于负二项式分布的差异表达分析(deseq2；[love mi等人，moderated estimation of fold change and dispersion for rna
‑
seq data with deseq2.genome biol 15:550(2014)]。第三，为了评估每周对照与治疗之间的潜在微生物多样性差异，在考虑香农指数和逆辛普森指数时执行嵌套anova。使用十进制对数计算香农指数。第四，为了描述微生物多样性随时间推移变化的时间趋势，执行mann
–
kendall趋势测试[mann hb.econometrica 1945，第13(3)卷，第245
‑
259页]。所有这些统计途径均在0.05的α水平下进行(除了deseq2分析，deseq2分析是在0.01的α水平下进行的)，并且是在r v.3.4.1中使用ancom.r[mandal s等人，microbial ecology in health and disease 2015，第26卷，第27663页]、kendall[hipel k等人,time series modelling of water resources and environmental systems,elsevier 1994])、deseq2[love mi等人，moderated estimation of fold change and dispersion for rna
‑
seq data with deseq2.genome biol 15:550(2014)]、labdsv[roberts d.labdsv:ordination and multivariate analysis for ecology 2016]、mvabund[wang y等人，mvabund:anr package for model
‑
based analysis on multivariate data.methods ecol evol3:471
–
474(2012)]和vegan[oksanen j等人，vegan:community ecology package 2015]包来执行。
[0147]
d.结果
[0148]
1.旷场
–
参见图7和图8
[0149]
在of测试期间测试使用对照饮食的动物在中心区域中所耗费的时间(n＝12，均值34.23，sd＝19.263)和使用adr
‑
159饮食的动物在中心区域中所耗费的时间(n＝11，均值11.11，sd＝12.155)。来自adr
‑
159组的数据不是呈正态分布的，因此使用曼
‑
惠特尼u检验，发现在中心区域中所耗费的时间的分布在各饮食之间存在统计学差异(p＝0.003)。
[0150]
在of测试期间还测试了使用对照饮食的动物的行进速度(n＝12，均值5.24，sd＝0.787)和使用adr
‑
159饮食的动物的行进速度(n＝12，均值4.27，sd＝1.584)。此外，在of测试期间测试了使用对照饮食的动物的行进距离(n＝11，均值1606.92，sd＝192.860)和使用adr
‑
159饮食的动物的行进距离(n＝12，均值1272.34，sd＝473.656)。将独立的t检验用于违反方差同质性的条件的正态分布数据。这表明，334.58cm的平均距离差值(对照
‑
adr
‑
159)是统计学上显著的(p＝0.040，差值的95％ci为[17.516,651.638])，而0.98cm/s的行进速度平均差值(对照
‑
adr
‑
159)在统计学上不显著(p＝0.073，差值的95％ci为[
‑
0.103,2.060])。
[0151]
2.新奇物体识别
–
参见图9
[0152]
测试使用对照饮食的动物对新奇物体的偏好(n＝11，均值61.66，sd＝5.100)和使用adr
‑
159饮食的动物对新奇物体的偏好(n＝12，均值58.95，sd＝14.451)。来自这两个组的数据均呈正态分布，并且违反了方差同质性的条件。因此，使用独立的t检验，显示平均差值为2.70(对照:adr
‑
159)在统计学上不显著(p＝0.553，差值的95％ci为[
‑
6.841,12.243])。
[0153]
3.埋珠
–
参见图10
[0154]
测试使用对照饮食的12只动物的埋珠数量(均值17.17，sd＝2.406)和使用adr
‑
159饮食的11只动物的埋珠数量(均值17.09，sd＝3.113)。来自adr
‑
159组的数据未呈正态分布，因此使用曼
‑
惠特尼u检验，揭示了饮食之间的埋珠数量分布不是统计学上显著的(p＝0.833)。
[0155]
4.三室测试—参见图11至图14
[0156]
在这项研究中，测试了饮食对在中央室或具有物体(空筐或装有鸭子或小鼠的筐)的每个侧室中所耗费的时间的影响。使用独立的t检验来分析呈正态分布的数据(必要时对违反等方差假设进行修正)，而曼
‑
惠特尼u检验则用于非参数数据。在每个实验阶段期间都追踪动物运动。
[0157]
在居住(图12；顶排)阶段期间，使用对照饮食(n＝11，均值245.19，sd＝29.550)或adr
‑
159饮食(n＝12，均值263.43，sd＝38.051)的动物在空室1(p＝0.216)中耗费的时间相对于它们在空室2中耗费的时间(p＝0.268)(分别为n＝12，均值235.41，sd＝38.297；n＝12，均值255.06，sd＝46.111)没有显著差异。然而，在使用对照饮食的动物(n＝12，均值111.20，sd＝32.389)或使用adr
‑
159饮食的动物(n＝11，均值77.26，sd＝15.143)之间在中心区域中所耗费的时间存在33.94s的显著差异(p＝0.003)。
[0158]
在社交性(图12；中排)阶段期间，使用对照饮食(n＝12，均值238.20，sd＝127.681)或adr
‑
159饮食(n＝12，均值408.24，sd＝60.516)的动物在具有小鼠的室内所耗费的时间存在显著差异(p＝0.001；平均差值(adr
‑
159
‑
对照)为169.25s；差的95％ci为[82.65,255.85])。使用对照饮食(n＝11，均值132.62，sd＝39.976)或adr
‑
159饮食(n＝12，均值73.72，sd＝38.666)的动物在中央室中所耗费的时间也存在显著的差异(p＝0.002；平均差值(对照
‑
adr
‑
159)为58.90s；差值的95％ci为[24.79,93.01])。最后，使用对照饮食(n＝12，均值215.04，sd＝102.651)或adr
‑
159饮食(n＝12，均值118.07，sd＝46.472)的动物在具有塑料鸭子的室内所耗费的时间存在显著的差异(p＝0.020；平均差值(对照
‑
adr
‑
159)为96.97s)。
[0159]
在社交新奇(图12；最底排)阶段期间，在任一室中所耗费的时间都没有显著差异。特别地，使用对照饮食(n＝11，均值206.01，sd＝48.405)和adr
‑
159饮食(n＝12，均值200.64，sd＝71.597)的动物在具有熟悉的小鼠的室中所耗费的时间(p＝0.837；平均差值(对照
‑
adr
‑
159)为5.37；差值的95％ci为[
‑
48.14,58.89])，或在中央室中所耗费的时间(p＝0.052)(分别为n＝12，均值123.36，sd＝43.23；n＝12，均值89.75，sd＝43.70)没有显著差异。最后，在使用对照饮食(n＝12，均值259.27，sd＝41.040)或adr
‑
159饮食(n＝12，均值309.65，sd＝79.135)的动物之间在具有新小鼠的室中所耗费的时间上没有显著差异(p＝0.067)。
[0160]
在3ct测试中测试了使用对照饮食(分别为n＝12，均值2931.74，sd＝217.760和n＝11，均值4.97，sd＝0.298)和adr
‑
159饮食(分别为n＝11，均值3106.77，sd＝236.013和n＝11，均值5.20，sd＝0.396)的动物在居住期间的行进距离和速度。在社交性阶段期间，使用对照饮食的动物的距离和速度如下(分别为n＝12，平均值2467.41，sd＝337.515和n＝12，均值4.13，sd＝0.565)并且使用adr
‑
159饮食的动物的距离和速度如下(分别为n＝12，均值2585.44，sd＝429.874和n＝12，均值4.32，sd＝0.720)。最后，在社交新奇阶段期间，使
用对照饮食的动物的测试参数是(分别为n＝11，均值2435.93，sd＝253.744和n＝11，均值4.07，sd＝0.424)并且使用adr
‑
159饮食的动物的测试参数是(分别为n＝11，均值2584.58，sd＝373.289和n＝11，均值4.32，sd＝0.627)。所有数据均呈正态分布，并且不违反方差同质性的条件。因此，使用独立的t检验，揭示了使用对照饮食的动物与使用adr
‑
159饮食的动物之间在行进距离和速度方面的平均差异在统计学上不显著(p>0.05)。
[0161]
另外，在这项研究中测试了饮食对与物体(空筐或装有鸭或小鼠的筐)的直接互动的影响。测试了在居住、社交性和社交新奇阶段期间，使用对照饮食的12名受试者与任一物体的总互动时间(分别为均值129.33，sd＝39.246；均值177.83，sd＝71.730；和均值223.42，sd＝54.755)，以及使用adr
‑
159饮食的12名受试者与任一物体的总互动时间(分别为均值151.58，sd＝29.432；均值237.50，sd＝34.503；和均值241.75，sd＝47.858)(图14，曲线图a、d和g)。所有数据均呈正态分布，并且在居住和社会新奇阶段没有违反方差同质性的条件。因此，使用独立的t检验，揭示了在社交性阶段期间59.67s的互动时间平均差值(p＝0.020，差值的95％ci为[10.91,108.42])是统计学上显著的。然而，在居住阶段和社交新奇阶段期间分别为22.25s(p＝0.130，差值的95％ci为[
‑
7.12,51.62])和18.33s(p＝0.392，差值的95％ci为[
‑
25.20,61.87])的互动时间平均差值不是统计学上显著的。
[0162]
分析在居住阶段、社交性阶段和社交新奇阶段期间使用对照饮食的动物在两个物体之间的鉴别比(分别为n＝11，均值49.93，sd＝4.579；n＝12，均值77.71，sd＝12.525；和n＝11，均值59.81，sd＝9.224)，以及使用adr
‑
159饮食的12名受试者在两个物体之间的鉴别比(分别为均值53.29，sd＝4.341；均值85.10，sd＝6.028；和均值59.81，sd＝9.224)(图14，图表c、f和i)。居住阶段和社交新奇阶段的数据呈正态分布，并且不违反方差同质性的条件。因此，使用独立的t检验，揭示了在居住阶段和社交新奇阶段期间分别为3.36(p＝0.086，差值的95％ci为[
‑
0.511,7.225])和0.21(p＝0.963，差值的95％ci为[
‑
9.166,9.592])的鉴别比平均差值在统计学上是不显著的。社交性的数据未呈正态分布，因此使用曼
‑
惠特尼u检验，揭示了饮食之间的鉴别比分布没有统计学差异(p＝0.114)。
[0163]
5.高架十字迷宫
–
参见图15和图16
[0164]
针对每组至多12只动物测试adr
‑
159饮食对比对照饮食。使用独立的t检验分析不违反等方差假设的正态分布数据，而曼
‑
惠特尼u检验则用于非参数数据。在闭臂(p＝0.416)或开臂(p＝0.237)中所耗费的时间、进入频率(p＝0.695；p＝0.724)和进入的迟延(p＝0.319；p＝0.519)的差异在统计学上不是显著的。
[0165]
在epm期间测试使用对照饮食的11只动物的速度和行进距离(分别为均值3.58，sd＝0.691和均值1069.57，sd＝208.827)以及使用adr
‑
159饮食的11只动物的速度和行进距离(分别为均值3.42，sd＝0.695和均值1023.61，sd＝211.157)。所有数据均呈正态分布，并且不违反方差同质性的条件。因此，使用独立的t检验，揭示了为0.15cm/s的平均速度差值(对照
‑
adr
‑
159)在统计学上不是显著的(p＝0.607，差值的95％ci为[
‑
0.46,0.77])。同样，为45.96cm的行进距离平均差值(对照
‑
adr
‑
159)在统计学上也不是显著的(p＝0.613，差值的95％ci为[
‑
140.83,232.74])。
[0166]
6.胭脂红—参见图17
[0167]
测试了饮食对肠道过渡时间的影响。来自adr
‑
159组的数据不是呈正态分布的，因此使用曼
‑
惠特尼u检验，并且发现使用对照饮食(n＝11，均值283.00，sd＝62.495)和adr
‑
159饮食(n＝12，均值272.18，sd＝74.737)的动物之间的过渡时间分布是在统计学上相同的(p＝0.748)。
[0168]
7.悬尾测试—参见图18
[0169]
针对使用对照饮食的11只动物(均值37.63，sd＝28.608)和使用adr
‑
159饮食的11只动物(均值89.18，sd＝33.828)，测试了在tst期间饮食对一动不动时间的影响(图18)。来自这两个组的数据均呈正态分布，并且不违反方差同质性的条件。因此，使用独立的t检验，揭示了为51.55的平均差值(adr
‑
159
‑
对照)在统计学上是显著的(p＝0.001，差值的95％ci为[23.682,79.410])。
[0170]
8.强迫游泳测试—参见图19
[0171]
针对使用对照饮食(n＝11，均值118.86，sd＝45.994)和adr
‑
159饮食(n＝11，均值136.57，sd＝47.607)的动物，测试在fst期间饮食对被动游泳时间的影响。来自这两个组的数据均呈正态分布，并且不违反方差同质性的条件。因此，使用独立的t检验，并且为17.71的平均差值(adr
‑
159
‑
对照)在统计学上不是显著的(p＝0.364，差值的95％ci为[
‑
21.92,57.34])。
[0172]
9.皮质酮水平—参见图20
[0173]
在fst之前，测试使用照饮食(n＝11，均值16.10，sd＝13.855)和adr
‑
159饮食(n＝10，均值4.33，sd＝4.469)的动物的基线皮质酮水平。来自这两个组的数据均呈正态分布，并且违反了方差同质性的条件。因此，使用独立的t检验，揭示了为11.77的平均差值(对照
‑
adr
‑
159)是统计学上显著的(p＝0.020，差值的95％ci为[2.18,21.36])。
[0174]
在fst后，测试饮食对皮质酮水平随时间变化的影响。重复测量使用对照饮食的11名受试者和使用adr
‑
159饮食的10名受试者的anova，揭示在各治疗之间没有统计学上显著的意义p＝0.230，f＝1.537。
[0175]
10.微生物群分析
–
参见图21至图24
[0176]
针对使用对照和adr
‑
159饮食的动物，测试饮食对鼠科动物微生物群的影响。厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroidetes)和疣微菌门(verrucomicrobia)是使用对照和adr
‑
159饮食的动物的粪便中最丰富的具代表性的三种门。在属水平上，所有动物的微生物群主要是未分类的紫单胞菌科(porphyromonadaceae)和未分类的毛螺菌科(lachnospiraceae)(图21)。总体而言，使用对照饮食的动物与使用adr
‑
159饮食的动物之间在属水平上的微生物组成是可比的。与使用对照饮食的动物相比，使用adr
‑
159的动物中的别样杆菌属和臭味菌属的中值相对丰度持续降低，而普氏菌属(prevotella)的中值相对丰度则增加。
[0177]
将个体之间的微生物群多样性借助于主坐标分析(pcoa)图可视化，并通过permanova进行分析。pcoa图揭示使用对照和adr
‑
159饮食的动物的微生物群有明显的时间相关性分离(图22)。虽然在饮食差异化之前，所有动物的微生物群都是可比的并且紧密聚集，但是在饮食八周后，使用adr
‑
159饮食的动物的微生物群明显与对照微生物群分离。
[0178]
接下来，在otu水平上分析使用对照饮食和adr
‑
159饮食的动物之间的相对丰度变化(图23、图24)，其中在至少一个时间点有229个otu是不同丰富化的(图24。为了关注饮食干预的长期影响，我们特别研究了在实验的5至8周时段中表现出丰度变化(仅包括那些在最后三个时间点中的至少两个时间点表现出变化的out)的41个otu(图23)。有趣的是，otu
中的一些属于未分类的紫单胞菌科和未分类的毛螺菌科的otu在adr
‑
159动物中表现出增加的丰度，而来自同一分类群的其他otu则表现出降低的丰度。
[0179]
e.讨论
[0180]
组成16s测序证实，在小鼠饮食中包含adr
‑
159对微生物群的组成和动物行为的方面均具有显著影响。我们认为这是证明此类同时效应的首项研究。所述结果为热灭活细菌及其代谢产物对肠
‑
脑轴的影响提供了潜在新颖机理的洞悉。