用于治疗自身免疫性疾病的抗CD40抗体的制作方法

用于治疗自身免疫性疾病的抗cd40抗体
技术领域
[0001]
本发明大体上涉及用于诊断和治疗用途的人源化抗cd40抗体。更具体地，公开了用于治疗特征在于表达cd40的细胞的各种疾病或障碍的人源化抗cd40抗体和使用方法。还公开了包含所述人源化抗cd40抗体的药物组合物和试剂盒。


背景技术：

[0002]
cd40是48kda i型整合膜糖蛋白，并且是肿瘤坏死因子(tnf)受体超家族的成员。cd40在多种细胞类型上表达，所述细胞类型包括正常和赘生性b细胞、交错突细胞、癌细胞、上皮细胞(例如角质形成细胞)、成纤维细胞(例如滑膜细胞)和血小板。它也存在于单核细胞、巨噬细胞、一些内皮细胞和滤泡树突细胞上。cd40在b细胞个体发生中早期表达，在cd10和cd19出现之后但在cd21、cd23、cd24表达和表面免疫球蛋白m(sigm)出现之前出现在b细胞前体上(uckun等人,1990,blood 15:2449)。在扁桃体和骨髓来源的浆细胞上也已经检测到cd40(pellat-decounynck等人,1994,blood 84:2597)。
[0003]
cd40的配体是tnf超家族成员cd40l(也称为cd154、gp39和trap)。cd40l是主要在活化的cd4
+
t细胞和cd8+t细胞的小子集上表达的跨膜蛋白(综述于(van kooten c.和banchereau,2000)中)。
[0004]
cd40与cd40l的相互作用诱导体液和细胞介导的免疫应答。cd40调节此配体-受体对以活化b细胞和其他抗原呈递细胞(apc)，包括树突细胞(dc)(综述于(toubi和shoenfeld，2004)；(kiener等人，1995)中)。b细胞上的cd40的功能已得到广泛研究。b细胞上cd40的活化可诱导增殖、分化为抗体分泌细胞以及在次级淋巴器官生发中心中的同种型转换。体外研究已经显示了cd40活化对b淋巴细胞中的细胞因子产生(il-6、il-10、tnf-α、lt-α)、粘附分子和共刺激受体(icam、cd23、cd80和cd86)的表达以及增加的i类mhc、ii类mhc和tap转运蛋白的表达的直接作用(liu等人,1996)。对于大部分这些过程，cd40与细胞因子或其他受体-配体相互作用协同起作用。
[0005]
单核细胞和dc上的cd40信号传导引起存活率提高以及细胞因子(il-1、il-6、il-8、il-10、il-12、tnf-α和mip-1α)的分泌增加。这些apc上的cd40连接也导致共刺激分子(例如，icam-1、lfa-3、cd80和cd86)上调。cd40受体的活化是使dc完全成熟为有效apc从而驱动t细胞活化的关键信号之一(banchereau和steinman,1998)(van kooten c.和banchereau,2000)。
[0006]
小鼠模型的最新研究表明，树突细胞上的cd40信号传导也在th17细胞的生成中起重要作用，th17细胞被认为是诸如关节炎和多发性硬化的疾病中自身免疫的介质(iezzi等人,2009)(perona-wright等人,2009)。
[0007]
cd40和cd40l基因敲除小鼠的可用性以及激动性和拮抗性抗小鼠抗体提供了研究cd40-cd40l相互作用在几种疾病模型中的作用的可能性。已证明施用阻断性抗cd40l在几种自身免疫模型中是有益的，所述模型包括自发性疾病，如snf1小鼠的狼疮肾炎或nod小鼠的糖尿病，或者实验诱导的疾病形式，如胶原诱导性关节炎(cia)或实验性自身免疫性脑脊
髓炎(eae)(toubi和shoenfeld,2004)。小鼠中的cia受到抗cd40l mab的抑制，所述抗cd40l mab阻断关节炎症的发展、血清抗体对胶原的滴度、炎性细胞在滑膜下组织中的浸润、以及软骨和骨骼的侵蚀(durie等人,1993)。对于狼疮肾炎和eae二者，已证明抗cd40l也可以缓解正在进行的疾病，从而证实cd40-cd40l在疾病的效应期中的作用(kalled等人,1998)；(howard等人,1999)。
[0008]
也在携带对髓磷脂碱性蛋白具有特异性的转基因t细胞受体的cd40l缺陷型小鼠中研究了cd40-cd40l相互作用在eae发展中的作用。这些小鼠在用抗原初免后未能发展成eae，并且cd4+t细胞保持静止并且不产生inf-γ(grewal等人,1996)。
[0009]
另外，针对cd40的抑制性抗体在炎性疾病模型诸如eae中显示出有益的作用。lamann和同事证明，拮抗小鼠抗人类cd40 mab mu5d12和此mab的嵌合形式有效防止在远系杂交种狨猴中慢性脱髓鞘eae的临床表现(laman等人,2002)；(boon等人,2001)。随访研究表明，在狨猴eae模型中，用嵌合抗人类cd40抗体进行治疗性治疗减少了mri可检测到的炎症，并延迟了先前存在的脑部病变的扩大(hart等人,2005)。
[0010]
在小鼠关节炎模型中测试了具有激动活性的抗cd40抗体，其结果有些矛盾。如对免疫刺激剂所期望的，在cia的dba/1小鼠模型中显示激动性抗小鼠cd40 mab fgk45会加重疾病(tellander等人,2000)。但是，在另一种慢性cia模型fgk45中，和另一种激动性抗小鼠cd40 mab(即3/23)，二者均表现出积极的治疗作用(mauri等人,2000)。据此小组假设，该治疗性治疗方案中激动抗体因诱导朝向th2应答的免疫偏离而具有有益的作用，其中ifn-γ的水平降低并且il-4和il-10的水平升高(mauri等人,2000)。
[0011]
也已记录通过阻断cd40/cd154相互作用来预防移植排斥。在恒河猴的肾脏同种异体移植研究中使用嵌合抗cd40拮抗剂ch5d12表明，cd40的拮抗作用足以改善病情并延长平均存活时间超过100天。当将ch5d12与抗cd86抗体组合并仅在同种异体移植研究开始时给予，随后用环孢素进行延长治疗时，实现大于4年的平均存活时间，这表明这种组合可潜在地诱导耐受性(haanstra等人,2005)。
[0012]
因此，有大量的临床前研究提供了cd40-cd40l二联体在驱动有效的t细胞依赖性免疫应答中的关键作用的证据。因此，cd40信号传导的阻断被认为是在诸如ra、多发性硬化或牛皮癣的疾病中抑制致病性自身免疫应答的合适且需要的治疗策略。然而，由于发现先前开发中的抗cd40抗体被显示具有严重副作用，因此迄今为止，尚未批准将任何cd40抗体用于此类障碍的治疗性干预。因此，仍非常需要可用于干预cd40-cd40l的作用并阻断cd40信号传导的治疗剂。此需要可以通过新型人源化抗cd40抗体解决，所述抗体特异性结合cd40，并且显示允许其用于基于cd40的障碍的治疗性干预的抗原结合特异性、亲和力以及药代动力学和药效学特性。


技术实现要素：

[0013]
本发明提供了一种人源化单克隆抗体，其中所述抗体特异性结合人类cd40，所述抗体具有小于1nm的拮抗活性ic50并且在最高100μg/ml下对b细胞增殖不具有激动作用，并且其中所述抗体的特征进一步在于所述抗体在非人类灵长类动物中的体内半衰期为至少10天。
[0014]
所述人源化单克隆抗体的特征可进一步在于，所述抗体在小于30mg/kg的剂量下
在食蟹猴中的半衰期大于8天。
[0015]
在示例性实施方案中，本发明的抗体包含选自seq id no:1至seq id no:4中任一者的重链序列和选自seq id no:5至seq id no:8中任一者的轻链序列。
[0016]
在其他实施方案中，抗体是具有以下中任一者的重链可变区氨基酸序列的抗体的人源化抗体或抗原结合片段：seq id no:1至4、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id no.50、seq id no:53、seq id no:57、seq id no:58、seq id no:59、seq id no:60、seq id no:61、seq id no:62、seq id no:63、seq id no:64、seq id no:65、seq id no:66、seq id no:67、seq id no:68、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、或seq id no:73。
[0017]
在其他实施方案中，抗体是包含以下的轻链可变结构域氨基酸序列的抗体的人源化抗体或抗原结合片段：seq id no:5至seq id no:8、seq id no:26、seq id no:31、seq id no:36、seq id no:41、seq id no:43、seq id no:45、seq id no:47、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:52、seq id no:54、seq id no:55、seq id no:56、seq id no:74、seq id no:75或seq id no:76。
[0018]
在特定实施方案中，本文所述的单克隆抗体的特征在于其包含重链和轻链，其中重链cdr1序列选自seq id no:9至seq id no:11，重链cdr2序列选自seq id no:12至seq id no:15，并且重链cdr3序列选自seq id no:16至seq id no:17；并且其中轻链cdr1序列具有选自seq id no:18至seq id no:21的序列，轻链cdr2序列为seq id no:22至seq id no:23并且轻链cdr3序列选自seq id no:24至seq id no:25。
[0019]
在特定实施方案中，本文所述的单克隆抗体的特征在于其包含重链cdr1序列seq id no:10、重链cdr2序列seq id no:13和重链cdr3序列seq id no:16；并且其中所述抗体包含轻链cdr1序列seq id no:19、轻链cdr2序列seq id no:22和轻链cdr3序列seq id no:24。
[0020]
在其他特定实施方案中，本文所述的单克隆抗体的特征在于其包含重链cdr1序列seq id no:9、重链cdr2序列seq id no:14和重链cdr3序列seq id no:16；并且其中所述抗体包含轻链cdr1序列seq id no:20、轻链cdr2序列seq id no:22和轻链cdr3序列seq id no:24。
[0021]
在另一个特定实施方案中，本文所述的单克隆抗体的特征在于其包含重链cdr1序列seq id no:9、重链cdr2序列seq id no:14和重链cdr3序列seq id no:16；并且其中所述抗体包含轻链cdr1序列seq id no:20、轻链cdr2序列seq id no:22和轻链cdr3序列seq id no:24。
[0022]
在另一个特定实施方案中，本文所述的单克隆抗体的特征在于其包含重链cdr1序列seq id no:11、重链cdr2序列seq id no:15和重链cdr3序列seq id no:17；并且其中所述抗体包含轻链cdr1序列seq id no:21、轻链cdr2序列seq id no:23和轻链cdr3序列seq id no:25。
[0023]
本文还描述了本发明的优选抗体的重链的单独序列。例如，本发明涉及抗cd40抗体，其包含seq id no:1至4中任一者的重链可变结构域序列。所述抗cd40抗体的特征进一
no:32、seq id no:33、seq id no:34或seq id no:35的人类可变结构域重链氨基酸序列的框架区的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的框架区，所述轻链氨基酸序列与seq id no:31的相应轻链可变结构域至少90％相同。
[0039]
在另一方面，本发明涉及在上一个实施方案中描述的分离的抗体或抗原结合片段，其中重链氨基酸序列是seq id no:32；在另一个实施方案中，重链氨基酸序列是seq id no:33；在另一个实施方案中，重链氨基酸序列是seq id no:34；并且在另一个实施方案中，重链氨基酸序列是seq id no:35，
[0040]
还考虑了特异性结合人类cd40的分离的抗体或抗原结合片段，其包含人源化重链可变结构域并且包含轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含具有与seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39或seq id no:40的人类可变结构域重链氨基酸序列的框架区的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的框架区，所述轻链氨基酸序列与seq id no:36的相应轻链至少90％相同。
[0041]
在另一方面，本发明涉及在上一个实施方案中描述的分离的抗体或抗原结合片段，其中重链氨基酸序列是seq id no:37；在另一个实施方案中，重链氨基酸序列是seq id no:38；在另一个实施方案中，重链氨基酸序列是seq id no:39；并且在另一个实施方案中，重链氨基酸序列是seq id no:40，
[0042]
本发明的抗体的特征可进一步在于，在不存在cd40l的情况下，所述抗体不能刺激b细胞产生细胞因子。
[0043]
本发明的抗体的特征可进一步在于，所述抗体在50％人类血清存在下结合人类cd40，其结合率的降低小于两倍。
[0044]
本发明的抗体的特征还可进一步在于，所述抗体在哺乳动物中以1mg/kg的浓度产生对igm和igg产生的抑制。
[0045]
本发明的抗体可以用于各种治疗、预防、诊断和其他方法。例如，本发明描述了一种在哺乳动物中阻断人类cd40的功能的方法，所述方法包括以足以阻断所述哺乳动物中cd40介导的免疫应答的量向所述哺乳动物施用包含本发明的抗体的组合物。
[0046]
本文还考虑了在哺乳动物中治疗或改善移植物抗宿主疾病的方法，所述方法包括以足以在所述动物中减轻移植物抗宿主疾病的一种或多种症状的量向所述哺乳动物施用包含本发明的抗体的组合物。
[0047]
举例来说，自身免疫性疾病或炎性疾病可包括但不限于类风湿性关节炎、狼疮肾炎、多发性硬化症、增生性狼疮肾小球肾炎、炎性肠病(ibd)、牛皮癣、特发性血小板减少性紫癜(itp)、克罗恩病(crohn's disease)和全身性红斑狼疮(sle)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto's thyroiditis)、原发性黏液水肿、甲状腺毒症/格雷夫斯病(graves disease)、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性心脏炎、阿迪森氏病(addison's disease)、早熟绝经、1型糖尿病、古德帕斯彻氏综合症(good pasture's syndrome)、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、特发性白细胞减少症、原发性胆汁性肝硬化、活动性慢性肝炎(hbs ag阴性)、隐源性肝硬化、舍格伦综合征(sjogren's syndrome)、皮肌炎、硬皮病、混合性结缔组织病、盘状红斑狼疮和全身性血管炎。在示例性实施方案中，哺乳动物患有类风湿性关节炎。
[0048]
本发明的方法可以进一步包括施用选自以下的第二治疗剂：tnf拮抗剂、改善疾病
的抗风湿药、ctla4拮抗剂、抗il-6受体mab和抗cd20mab。
[0049]
在特定实施方案中，炎性疾病或自身免疫性疾病是与表达cd40和cd20两者的细胞相关联的炎性疾病或自身免疫性疾病。
[0050]
在特定方法中，治疗涉及通过肠胃外施用途径来施用抗体组合物。
[0051]
在特定方法中，治疗涉及静脉内或皮下施用抗体组合物。
[0052]
本发明的其他方法包括抑制人类患者中b细胞的抗体产生，所述方法包括向所述人类患者施用有效量的本发明的抗cd40抗体。
[0053]
更具体地，人类患者患有与表达cd40的细胞相关联的炎性疾病或自身免疫性疾病。
[0054]
在示例性实施方案中，人类患者罹患选自以下的自身免疫性疾病：自身免疫性疾病或炎性疾病，其选自类风湿性关节炎、多发性硬化症、增生性狼疮肾小球肾炎、炎性肠病(ibd)、牛皮癣、特发性血小板减少性紫癜(itp)、克罗恩病和全身性红斑狼疮(sle)、桥本氏甲状腺炎、原发性黏液水肿、甲状腺毒症/格雷夫斯病、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性心脏炎、阿迪森氏病、早熟绝经、1型糖尿病、古德帕斯彻氏综合症、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、特发性白细胞减少症、原发性胆汁性肝硬化、活动性慢性肝炎(hbs ag阴性)、隐源性肝硬化、舍格伦综合征、皮肌炎、硬皮病、混合性结缔组织病、盘状红斑狼疮和全身性血管炎。
[0055]
本发明的另一种方法涉及抑制表达人类cd40抗原的细胞的生长，所述方法包括向所述细胞施用抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人类细胞表面cd40抗原，其中抗体或其抗原结合片段与cd40抗原的结合抑制了细胞的生长或分化。
[0056]
还考虑了治疗患有cd40相关障碍的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人类cd40，其中抗体或抗原结合片段与cd40的结合抑制了cd40相关障碍的细胞的生长或分化。所述细胞可以是但不限于b淋巴母细胞、胰腺细胞、肺细胞、乳腺细胞、卵巢细胞、结肠细胞、前列腺细胞、皮肤细胞、头颈细胞、膀胱细胞、骨细胞或肾细胞。
[0057]
用于抑制细胞生长或分化的治疗方法可用于治疗类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、慢性淋巴细胞性白血病、伯基特淋巴瘤(burkitt's lymphoma)、多发性骨髓瘤、t细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin's lymphoma)、霍奇金氏病(hodgkin's disease)、瓦尔登斯特罗姆巨球蛋白血症(waldenstrom's macroglobulinemia)或卡波西氏肉瘤(kaposi's sarcoma)。
[0058]
还考虑了用于诱导外周b细胞耗竭的方法，所述方法包括向所述细胞施用本发明的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人类细胞表面cd40抗原，其中抗体或抗原结合片段与cd40抗原的结合诱导所述细胞的耗竭。
[0059]
在特定实施方案中，向患有免疫障碍的受试者施用抗体或抗原结合片段。例如，免疫障碍是类风湿性关节炎或全身性红斑狼疮。
[0060]
还考虑了在受试者中治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体，其中所述抗体是在所述受试者中阻断cd40的功能的拮抗性抗体。
[0061]
还考虑了在受试者中治疗全身性红斑狼疮或狼疮肾炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体，其中所述抗体是在所述受试者中阻断cd40的功能的拮抗性抗
体。
[0062]
优选地，抗体以有效抑制所述受试者中的b细胞分化和抗体同种型转换的量施用。
[0063]
在其他实施方案中，抗体以有效抑制所述受试者的t细胞和巨噬细胞中的细胞因子和趋化因子产生以及粘附分子的上调的量施用。优选地，抗体以有效抑制所述受试者中树突细胞的活化的量施用。
[0064]
在其他实施方案中，所述方法的特征进一步在于抗体以有效抑制所述受试者的非免疫细胞中促炎细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶、前列腺素的产生并下调粘附分子的量施用。
[0065]
在特定实施方案中，抗体与包括甲氨蝶呤施用和/或enbrel/humira施用的方案组合施用。
[0066]
接受所述疗法的受试者是患有类风湿性关节炎并且对单独的甲氨蝶呤治疗无反应的受试者。
[0067]
在特定实施方案中，所述方法包括用包括甲氨蝶呤施用和/或enbrel/humira施用的方案治疗所述受试者。
[0068]
本发明的方法的特征可进一步在于，其中用所述拮抗性抗cd40抗体治疗所述受试者具有优于单独使用甲氨蝶呤、单独使用enbrel、使用enbrel+甲氨蝶呤的组合进行的治疗的功效。
[0069]
本发明的方法的特征可进一步在于，其中用所述拮抗性抗cd40抗体治疗所述受试者在对甲氨蝶呤的反应不足的患者中具有优于使用enbrel+mtx进行的治疗的功效。
[0070]
在特定实施方案中，抗体与包括抗tnf剂的方案联合施用。
[0071]
在特定实施方案中，受试者被表征为患有类风湿性关节炎并对单独用抗tnf剂的治疗无反应的受试者。在此类实施方案中，所述方法可以包括用包括用抗tnf剂与所述拮抗性抗cd40抗体的组合进行治疗的方案来治疗所述受试者。
[0072]
在特定实施方案中，用所述拮抗性抗cd40抗体治疗所述受试者具有优于用抗tnf剂治疗的功效。
[0073]
在仍其他实施方案中，所述方法的特征在于，在对单独的抗tnf剂的反应不足的患者中，用所述拮抗性抗cd40抗体治疗所述受试者具有优于用orencia或rituxan治疗的疗效。
[0074]
本发明进一步涵盖药物组合物，其包含：(i)如本文所述的抗体或抗原结合片段；以及(ii)药学上可接受的赋形剂。在此类组合物中，抗体或其抗原结合片段可以有利地缀合至第二药剂，例如细胞毒性剂、peg载体、酶或标记。
[0075]
本文还考虑了编码以下任一者的重链可变区氨基酸序列的分离的多核苷酸：seq id no:1至4、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id.no.50、seq id no:53、seq id no:57、seq id no:58、seq id no:59、seq id no:60、seq id no:61、seq id no:62、seq id no:63、seq id no:64、seq id no:65、seq id no:66、seq id no:67、seq id no:68、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72或seq id no:73。
[0076]
本文还考虑了编码以下任一者的轻链可变区氨基酸序列的分离的多核苷酸：seq id no:5至seq id no:8、seq id no:26、seq id no:31、seq id no:36、seq id no:41、seq id no:43、seq id no:45、seq id no:47、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:52、seq id no:54、seq id no:55、seq id no:56、seq id no:74、seq id no:75或seq id no:76。
[0077]
本发明进一步涉及本文所述的抗体在制备用于阻断哺乳动物中人类cd40的功能的药物中的用途，其中所述药物阻断所述哺乳动物中cd40介导的免疫应答。
[0078]
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗或改善哺乳动物的移植物抗宿主疾病的药物的制备。
[0079]
在示例性实施方案中，制备所述药物用于治疗选自以下的自身免疫性疾病或炎性疾病：类风湿性关节炎、狼疮肾炎、多发性硬化症、增生性狼疮肾小球肾炎、炎性肠病(ibd)、牛皮癣、特发性血小板减少性紫癜(itp)、克罗恩病和全身性红斑狼疮(sle)、桥本氏甲状腺炎、原发性黏液水肿、甲状腺毒症/格雷夫斯病、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性心脏炎、阿迪森氏病、早熟绝经、1型糖尿病、古德帕斯彻氏综合症、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、特发性白细胞减少症、原发性胆汁性肝硬化、活动性慢性肝炎(hbs ag阴性)、隐源性肝硬化、舍格伦综合征、皮肌炎、硬皮病、混合性结缔组织病、盘状红斑狼疮和全身性血管炎。
[0080]
在一些实施方案中，所述药物可以进一步包括选自以下的第二治疗剂：tnf拮抗剂、改善疾病的抗风湿药、ctla4拮抗剂、抗il-6受体mab和抗cd20 mab。
[0081]
所述药物可以被制备用于肠胃外施用途径。所述药物可以被制备用于静脉内或皮下使用。
[0082]
另一个实施方案考虑了本文描述的抗体在制备用于抑制人类患者中b细胞的抗体产生的药物中的用途。
[0083]
另一个实施方案考虑了本文描述的抗体在制备用于抑制表达人类cd40抗原的细胞的生长和/或分化的药物中的用途。
[0084]
另一个实施方案考虑了本文描述的抗体在制备用于治疗患有cd40相关障碍的受试者的药物中的用途，其中所述药物中的抗体或抗原结合片段与cd40的结合抑制了cd40相关障碍的细胞的生长或分化。
[0085]
所述药物可以被制备用于治疗选自以下的cd40相关障碍的细胞：b淋巴母细胞、胰腺细胞、肺细胞、乳腺细胞、卵巢细胞、结肠细胞、前列腺细胞、皮肤细胞、头颈细胞、膀胱细胞、骨细胞或肾细胞。
[0086]
所述药物可以被制备用于治疗慢性淋巴细胞性白血病、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、t细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金氏病、瓦尔登斯特罗姆巨球蛋白血症或卡波西氏肉瘤。
[0087]
另一个实施方案考虑了本发明的抗体在制备用于诱导外周b细胞耗竭的药物中的用途，其中所述药物的抗体或抗原结合片段特异性结合人类细胞表面cd40抗原，其中抗体或抗原结合片段与cd40抗原的结合诱导细胞的耗竭。
[0088]
所述药物可以被制备用于治疗患有免疫障碍的受试者。
[0089]
所述药物可以被制备用于治疗类风湿性关节炎或全身性红斑狼疮。
[0090]
另一个实施方案考虑了本发明的抗体在制备用于治疗受试者的类风湿性关节炎的药物中的用途。
[0091]
另一个实施方案考虑了本发明的抗体在制备用于治疗受试者的全身性红斑狼疮或狼疮肾炎的药物中的用途。
[0092]
所述药物可以被制备用于抑制所述受试者中的b细胞分化和抗体同种型转换。
[0093]
所述药物可以被制备用于抑制所述受试者的t细胞和巨噬细胞中细胞因子和趋化因子的产生以及粘附分子的上调。
[0094]
所述药物可以被制备用于抑制所述受试者中树突细胞的活化。
[0095]
所述药物可以被制备用于抑制所述受试者的非免疫细胞中促炎细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶、前列腺素的产生以及粘附分子的下调。
[0096]
在某些实施方案中，所述药物被制备为组合药物，以与包括甲氨蝶呤施用和/或enbrel/humira施用的方案组合施用。
[0097]
在其他实施方案中，所述药物被制备为组合药物，并且所述药物除了包含本发明的抗体之外进一步包含抗tnf剂。
附图说明
[0098]
图1示出了简单的剂量递增设计。s-fu是安全性随访。*是指随机化至安慰剂的2名受试者和随机化至本发明的抗体的8名受试者。是指群组4的s-fu更长(56天而不是42天)。
[0099]
图2示出了本发明的抗体在第8、15和22天的给药前浓度(c
pre
)和在第29天的谷浓度。
[0100]
图3a示出了在不同剂量的治疗下cd40受体占有率的算术平均值百分比。
[0101]
图3b示出了不同剂量对cd54上调的抑制百分比。
具体实施方式
[0102]
现在已经认识到cd40介导的信号传导参与多种靶障碍。尽管可获得大量显示对这些疾病的干预将在治疗上有益的临床前数据，但仍需要可用于治疗自身免疫性疾病的拮抗性抗cd40抗体。在优选的实施方案中，本发明涉及识别cd40的人源化抗体。这些抗体还披露于美国专利号8,591,900和wo/2011/123489，所述专利各自的内容以引用方式并入本文。在特定实施方案中，已经基于某些先导小鼠抗体的序列鉴定了这些人源化抗体的序列。
[0103]
尽管近年来取得治疗进展，但对用于自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮和狼疮肾炎的新治疗的需求仍未满足。已知细胞表面受体cd40与其配体cd40l(cd154)的相互作用在体液免疫和细胞免疫的调节以及这些自身免疫性疾病的发病机理中起重要作用。因此，cd40-cd40l相互作用是调节自身免疫性疾病的有吸引力的靶标。
[0104]
cd40是一种细胞表面受体，其属于肿瘤坏死因子受体家族，并且在b细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、肾细胞和其他非免疫细胞上表达。cd40是通过活化b细胞和其他抗原呈递细胞(apc)(包括树突细胞和巨噬细胞)来参与抗原驱动的获得性免疫的发展的关键性共刺激分子，但也参与活化非免疫驻留细胞。4cd40l是肿瘤坏死因子超家族的成员，主要由活化的t细胞、活化的b细胞和血小板表达。cd40与cd40l的结合导致e-选择蛋白(cd62e)、血管细胞粘附分子1(cd106)和细胞间粘附分子1(cd54)上调，从而增加白细胞附壁和血细
胞渗出。
[0105]
最佳的apc-t细胞活化似乎需要cd40-cd40l相互作用。cd40-cd40l途径被认为对t细胞应答的放大特别重要，并且参与多种自身免疫性疾病。已显示阻断cd40信号传导途径可抑制t辅助1(th1)细胞分化和免疫应答维持。cd40和cd40l的表达增加与患有类风湿关节炎的患者的活动疾病相关联。b和t细胞上cd40l的水平升高与全身性红斑狼疮的疾病活动有关，并且系膜细胞上的肾cd40表达在患有iii类和iv类狼疮肾炎的患者中上调。
[0106]
先前针对cd40l的单克隆抗体的临床开发由于血小板的活化和聚集引发的血栓栓塞事件而失败，这可能是由于抗cd40l抗体的fc区活化了fcγriia(cd32a)血小板受体所致的。最近的研究表明，缺少功能性fc区的抗体不会诱导血栓栓塞事件，无法活化血小板并且保留药理活性以及临床活性。
[0107]
在一个实施方案中，本发明的抗体是选择性结合cd40并阻断cd40-cd40l相互作用的人源化拮抗性抗cd40单克隆抗体；它被设计为不具有激动活性，并预防刺激性细胞因子产生。在fc区中并入两个替代突变(leu234ala和leu235ala)以防止fc介导的抗体依赖性或补体介导的细胞毒性以及血小板活化。本发明的抗体在人类(ec90＝6.85
±
0.74nm)和食蟹猴b细胞中均显示出有效且相当的结合特性，并且显示出对cd40l诱导的外周血单核细胞增殖的有效抑制而无激动作用。当与血小板结合时，本发明的抗体似乎不会改变血小板的活化、聚集或功能。在食蟹猴的临床前评估中，在最多50mg/kg的多次剂量的本发明的抗体持续26周的情况下，显示出b细胞水平可逆降低、淋巴器官生发中心可逆减少、以及良好的总体耐受性，而没有血栓栓塞事件或相关细胞因子的释放(以及未公布的数据)。在这些评估中，未观察到不良影响的水平为50mg/kg，即施用的最高剂量(未公布的数据)。
[0108]
如实施例9中所示，在健康志愿者的单次上升剂量研究中，最多120mg本发明抗体的增加的静脉内(iv)和皮下(sc)单次剂量耐受良好，并显示出阻断cd40-cd40l途径的高潜力。在本发明抗体的iv和sc给药后，观察到cd40受体占有率(ro)和b细胞活化抑制(如通过对cd54上调的抑制来测量)的剂量相关性增加。定义
[0109]
术语“cd40”和“cd40表面抗原”是指在正常和赘生性b细胞表面上表达的约48kd糖蛋白，其充当参与细胞增殖和分化的信号的受体(ledbetter等人,1987,j.immunol.138:788-785)。已从由伯基特氏淋巴瘤细胞系raji制备的文库中分离出编码cd40的cdna分子(stamenkovic等人,1989,embo j.8:1403)。
[0110]
如本文所用，内源性表达cd40的细胞是特征在于cd40的表面表达的任何细胞，包括但不限于正常和赘生性b细胞、交错突细胞、基底上皮细胞、癌细胞、巨噬细胞、内皮细胞、滤泡树突细胞、扁桃体细胞和骨髓来源的浆细胞。在一些实施方案中，cd40分子是人类cd40分子。
[0111]
本发明的抗体特异性结合人类重组和天然cd40。一种人源化单克隆抗体，其中所述抗体特异性结合人类cd40，所述抗体具有小于1nm的拮抗活性ic50并且在最多100μg/ml下对b细胞增殖不具有激动作用，并且其中所述抗体的特征进一步在于所述抗体在非人类灵长类动物中的体内半衰期为至少10天。
[0112]
优选地，抗体以小于1nm的ec50特异性结合cd40-fc缀合物中的cd40，并且以小于2.5nm的ec50特异性结合表达cd40的细胞中的cd40。如下定义抗体的拮抗特性，其具有小于
1nm的b细胞或树突细胞拮抗活性ic50。与其他抗cd40抗体(例如抗cd40抗体4d11)相比，所述抗体进一步具有优异的药代动力学特性，具有增加的体内半衰期。
[0113]
如本文所用，表达cd40的细胞是特征在于cd40的表面表达的任何细胞，包括但不限于正常和赘生性b细胞、交错突细胞、基底上皮细胞、癌细胞、巨噬细胞、内皮细胞、滤泡树突细胞、扁桃体细胞和骨髓来源的浆细胞。在一些实施方案中，cd40分子是人类cd40分子。
[0114]
本发明的抗体识别特异性的“cd40抗原表位”和“cd40表位”。如本文所用，这些术语是指能够与抗cd40抗体进行免疫反应的分子(例如，肽)或分子的片段，并且例如包括被具有以下重链/轻链序列组合的任何抗体识别的cd40抗原决定簇：轻链seq id no.26与重链seq id no:27、28、29或30中的任一者；或轻链seq id no:31与重链seq id no 32、33、34或35中的任一者；或轻链seq id no 36与重链seq id no 37、38、39或40中的任一者。cd40抗原表位可以包括在蛋白质、蛋白质片段、肽等中。表位是最常见的蛋白质、短寡肽、寡肽模拟物(即，模拟cd40抗原的抗体结合特性的有机化合物)或其组合。
[0115]
抗体或免疫球蛋白的一般性结构是本领域技术人员熟知的，这些分子是异四聚体糖蛋白，其通常为约150,000道尔顿，由两条相同的轻(l)链和两条相同的重(h)链构成。每条轻链通过一个二硫键共价连接至重链以形成异二聚体，并且异二聚体分子通过在异二聚体的两条相同重链之间的共价二硫键来形成。尽管轻链和重链通过一个二硫键连接在一起，但是两条重链之间的二硫键数量因免疫球蛋白同种型而不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在氨基端具有可变结构域(v
h
)，后接三个或四个恒定结构域(c
h1
、c
h2
、c
h3
和c
h4
)，以及c
h1
与c
h2
之间的铰链区。每条轻链具有两个结构域，即氨基端可变结构域(v
l
)和羧基端恒定结构域(c
l
)。v
l
结构域与v
h
结构域非共价缔合，而c
l
结构域通常通过二硫键共价连接至c
h1
结构域。据信特定氨基酸残基在轻链可变结构域与重链可变结构域之间形成界面(chothia等人,1985,j.mol.biol.186:651-663。)
[0116]
在不同抗体之间，可变结构域内的某些结构域差异很大，即是“高变的”。这些高变结构域含有直接参与每种特定抗体对其特异性抗原决定簇的结合和特异性的残基。轻链和重链可变结构域中的高变性都集中在被称为互补决定区(cdr)或高变环(hvl)的三个区段中。cdr由kabat等人,1991在以下文献中的序列比较来定义：sequences of proteins of immunological interest,第5版public health service,national institutes of health,贝塞斯达,马里兰州，而hvl在结构上根据可变结构域的三维结构来定义，如chothia和lesk,1987,j.mol.biol.196:901-917所述。在这两种方法得到的cdr的识别稍有不同时，结构定义优先。如kabat所定义，在轻链可变结构域中，cdr-l1位于约残基24-34，cdr-l2位于约残基50-56，并且cdr-l3位于约残基89-97；在重链可变结构域中，cdr-h1位于约残基31-35，cdr-h2位于约残基50-65，并且cdr-h3位于约残基95-102。因此，重链和轻链的cdr1、cdr2、cdr3定义了给定抗体所特有的独特和功能特性。
[0117]
每条重链和轻链内的三个cdr被框架区(fr)隔开，所述框架区包含的序列倾向于可变性较小。从重链和轻链可变结构域的氨基端到羧基端，fr和cdr按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。fr的主要β-折叠构型使每条链内的cdr彼此紧靠，并且紧靠另一条链的cdr。所得构象有助于抗原结合位点(参见kabat等人,1991,nih公布号91-3242，第i卷，第647-669页)，但并非所有cdr残基都一定直接参与抗原结合。
[0118]
fr残基和ig恒定结构域不直接参与抗原结合，但有助于抗原结合和/或介导抗体
效应子功能。一些fr残基被认为以至少以下三种方式对抗原结合具有显著作用：通过直接非共价结合至表位、通过与一个或多个cdr残基相互作用以及通过影响重链与轻链之间的界面。恒定结构域不直接参与抗原结合，但介导各种ig效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性(cdc)和抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)。
[0119]
基于恒定结构域的氨基酸序列，脊椎动物免疫球蛋白的轻链被分配给两个明显不同的类别(即卡帕(κ)和拉姆达(λ))之一。通过比较，根据恒定结构域的序列，将哺乳动物免疫球蛋白的重链分配给以下五个主要类别之一：iga、igd、ige、igg和igm。igg和iga进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。天然免疫球蛋白类别的亚基结构和三维构型是已熟知的。
[0120]
术语“抗体”、“抗cd40抗体”、“人源化抗cd40抗体”和“变体人源化抗cd40抗体”在本文中以最广泛含义使用，并且明确涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段(例如抗体的展现所需生物学活性(例如cd40结合)的可变结构域和其他部分)。
[0121]
术语“单克隆抗体”(mab)是指基本上均一的抗体的群体中的抗体；也就是说，该群体中单独抗体是相同的，除了可能少量存在的天然突变。单克隆抗体针对单个抗原决定簇“表位”具有高特异性。因此，修饰语“单克隆”表示针对相同表位的基本上均一的抗体群，并且不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。应该理解的是，单克隆抗体可以通过本领域已知的任何技术或方法制成；包括例如杂交瘤方法(kohler等人,1975,nature 256:495)；或本领域已知的重组dna方法(参见例如，美国专利号4,816,567)；或使用clackson等人,1991,nature 352:624-628以及marks等人,1991,j.mol.biol.222:581-597中所述的技术分离使用噬菌体抗体文库重组产生的单克隆抗体的方法。
[0122]
嵌合抗体由来自一个物种(例如非人类哺乳动物，例如小鼠)的抗体的重链和轻链可变区和另一个物种(例如，人类)抗体的重链和轻链恒定区组成，并且可以通过以下方式获得：将编码来自第一物种(例如小鼠)的抗体可变区的dna序列连接至来自第二物种(例如人类)的抗体恒定区的dna序列，并用含有连接的序列的表达载体转化宿主以使其产生嵌合抗体。可替代地，嵌合抗体也可以是这样一种抗体，其中重链和/或轻链的一个或多个区域或结构域与来自另一种免疫球蛋白类别或同种型或来自共有序列或种系序列的单克隆抗体中的相应序列相同、同源或为其变体。嵌合抗体可以包括此类抗体的片段，条件是所述抗体片段表现出其亲本抗体的所需生物学活性，例如与同一表位结合(参见，例如，美国专利号4,816,567；以及morrison等人,1984,proc.natl.acad.sci.usa 81:6851-6855)。
[0123]
术语“抗体片段”、“抗cd40抗体片段”、“人源化抗cd40抗体片段”、“变体人源化抗cd40抗体片段”是指全长抗cd40抗体的一部分，其中保留可变区或功能能力，例如特异性cd40表位结合。抗体片段的例子包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、scfv和scfv-fc片段、双抗体、线性抗体、单链抗体、微型抗体、由抗体片段形成的双抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0124]
全长抗体可用诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的酶处理以产生有用的抗体片段。木瓜蛋白酶消化用于产生两个相同的称为“fab”片段的抗原结合抗体片段(每个片段具有单个抗原结合位点)以及一个残余的“fc”片段。fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的c
h1
结
构域。胃蛋白酶处理产生f(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
[0125]
fab'片段与fab片段的差异在于存在另外的残基，包括来自c
h1
结构域c端的抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。f(ab')2抗体片段是通过铰链区中的半胱氨酸残基连接的fab'片段对。抗体片段的其他化学偶合也是已知的。
[0126]“fv”片段含有完整的抗原识别和结合位点，其由紧密地非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在此构型中，每个可变结构域的三个cdr相互作用以限定限定v
h-v
l
二聚体的表面上的抗原结合位点。总之，六个cdr为抗体赋予抗原结合特异性。
[0127]“单链fv”或“scfv”抗体片段是包含抗体的v
h
和v
l
结构域的单链fv变体，其中所述结构域存在于单个多肽链中。单链fv能够识别并结合抗原。scfv多肽还可任选地含有位于v
h
与v
l
结构域之间的多肽接头，以便有利于形成用于scfv的抗原结合的所需三维结构(参见例如，pluckthun,1994,in the pharmacology of monoclonal antibodies,第113卷,rosenburg和moore编辑,springer-verlag,纽约,第269-315页)。
[0128]
其他公认的抗体片段包括含有一对串联fd区段(v
h-c
h1-v
h-c
h1
)以形成一对抗原结合区的那些抗体片段。这些“线性抗体”可以是双特异性或单特异性的，如例如zapata等人1995,protein eng.8(10):1057-1062所述。
[0129]
人源化抗体或人源化抗体片段是特定类型的嵌合抗体，所述嵌合抗体包括免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段，所述嵌合抗体能够结合预定抗原，并且包含一个或多个基本上具有人类免疫球蛋白氨基酸序列的fr和一个或多个基本上具有非人类免疫球蛋白氨基酸序列的cdr。通常被称为“输入”序列的此非人类氨基酸序列通常得自“输入”抗体结构域，特别是可变结构域。通常，人源化抗体至少包含非人类抗体的cdr或hvl，所述cdr或hvl插入在人类重链或轻链可变结构域的fr之间。本发明描述了特异性人源化抗cd40抗体，其包含源自表3和表4中所示的鼠类单克隆抗体的cdr，所述cdr插入在人类种系序列重链和轻链可变结构域的fr之间。应当理解，某些鼠类fr残基可能对于人源化抗体的功能十分重要，并且因此人类种系序列重链和轻链可变结构域的某些残基被修饰为与相应鼠类序列的那些残基相同。
[0130]
在另一方面，人源化抗cd40抗体包含至少一个且通常是两个可变结构域的基本上全部(如包含在例如fab、fab'、f(ab')2、fabc和fv片段中)，其中所有或基本上所有的cdr都对应于非人类免疫球蛋白的那些cdr，并且特别是在本文中，所有cdr都是下文表1至表4所详述的鼠类序列，并且所有或基本上所有的fr都是人类免疫球蛋白共有序列或种系序列的那些。在另一方面，人源化抗cd40抗体还包含免疫球蛋白fc区(通常是人类免疫球蛋白的fc区)的至少一部分。通常，所述抗体将包含轻链以及至少重链的可变结构域二者。所述抗体适当时还可以包含重链的c
h1
、铰链、c
h2
、c
h3
和/或c
h4
区中的一个或多个。
[0131]
人源化抗cd40抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括igm、igg、igd、iga和ige，以及任何同种型，包括igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。例如，恒定结构域可以是补体固定恒定结构域，其中期望人源化抗体表现出细胞毒性活性，并且同种型通常是igg1。当不需要这种细胞毒性活性时，恒定结构域可以是另一种同种型，例如igg2。替代性人源化抗cd40抗体可包含来自多于一种免疫球蛋白类别或同种型的序列，并且选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能是在本领域普通技术范围内。在特定实施方案中，本发明提供
了抗体，其是igg1抗体并且更具体地，是其中敲除效应子功能的igg1抗体。
[0132]
人源化抗cd40抗体的fr和cdr或hvl不需要精确地对应于亲本序列。例如，可以通过取代、插入或缺失来改变(例如，诱变)输入cdr或hvl或者共有或种系fr序列中的一个或多个残基，使得所得氨基酸残基不再与任一亲本序列的对应位置中的原始残基相同，但所述抗体仍然保留与cd40结合的功能。这种改变通常不会是广泛的并且将是保守改变。通常，至少75％(更经常地至少90％，并且最经常地大于95％或大于98％或大于99％)的人源化抗体残基将对应于亲本共有或种系fr和输入cdr序列的那些残基。
[0133]
影响重链可变区与轻链可变区之间的界面(“v
l-v
h
界面”)的免疫球蛋白残基是影响两条链相对于彼此的接近或取向的那些残基。可能参与链间相互作用的某些残基包括v
l
残基34、36、38、44、46、87、89、91、96和98，以及v
h
残基35、37、39、45、47、91、93、95、100和103(利用kabat等人,sequences of proteins of immunological interest(national institutes of health,贝塞斯达,马里兰州,1987)中提出的编号系统)。美国专利号6,407,213还讨论，诸如v
l
残基43和85以及v
h
残基43和60的残基也可能参与此相互作用。尽管这些残基仅针对人类igg而指示，但它们可跨物种适用。选择合理预期会参与链间相互作用的重要抗体残基来取代到共有序列中。
[0134]
术语“共有序列”和“共有抗体”是指在任何特定类别、同种型或亚基结构的所有免疫球蛋白(例如人类免疫球蛋白可变结构域)的每个位置处包含最频繁出现的氨基酸残基的氨基酸序列。共有序列可以是基于特定物种或许多物种的免疫球蛋白。“共有”序列、结构或抗体应理解为涵盖如某些实施方案中所述的共有人类序列，并且是指在任何特定类别、同种型或亚基结构的所有人类免疫球蛋白的每个位置处包含最频繁出现的氨基酸残基的氨基酸序列。因此，共有序列含有如下氨基酸序列：其在每个位置具有存在于一个或多个已知免疫球蛋白中的氨基酸，但可能不完全复制任何单个免疫球蛋白的整个氨基酸序列。可变区共有序列并非从任何天然产生的抗体或免疫球蛋白获得。kabat等人,1991,sequences of proteins of immunological interest,第5版public health service,national institutes of health,贝塞斯达,马里兰州，以及其变体。重链和轻链共有序列的fr及其变体提供了用于制备人源化抗cd40抗体的有用序列。参见例如，美国专利号6,037,454和6,054,297。
[0135]
人类种系序列是在人类群体中自然发现的。这些种系基因的组合产生抗体多样性。抗体轻链的种系抗体序列来自保守的人类种系κ或λv基因和j基因。类似地，重链序列来自种系v、d和j基因(lefranc,m-p和lefranc,g,“the immunoglobulin facts book”academic press,2001)。
[0136]
如本文所用，“变体”、“抗cd40变体”、“人源化抗cd40变体”或“变体人源化抗cd40”各自是指至少具有以下的人源化抗cd40抗体：来自seq id no:1至4中的任一序列的重链可变鼠类cdr、或源自如seq id no:5至seq id no:8中任一者所示的鼠类单克隆抗体的轻链鼠类cdr序列，以及源自人类共有序列的fr序列。变体包括在轻链或重链可变结构域之一者或二者中具有一个或多个氨基酸变化的那些变体，条件是所述氨基酸变化基本上不损害抗体与cd40的结合。本文产生的示例性人源化抗体包括命名为抗体a、抗体b和抗体c的那些抗体，并且所述抗体的各种重链和轻链序列示出于seq id no:26至seq id no:40。
[0137]“分离的”抗体是已鉴定并且与其天然环境的组分分离和/或从其天然环境的组分
回收的抗体。抗体的天然环境中的污染组分是可能干扰抗体的诊断或治疗用途的那些物质，并且可以是酶、激素或其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一方面，抗体将被纯化到以抗体重量计至少大于95％隔离。
[0138]
分离的抗体包括在产生所述抗体的重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备，其中去除重组细胞材料。
[0139]
术语“抗体性能”是指有助于抗体识别抗原或抗体在体内的有效性的因素。抗体氨基酸序列的变化可能影响抗体特性(例如折叠)，并且可能影响物理因素，例如抗体与抗原结合的初始速率(k
a
)、抗体与抗原的解离常数(k
d
)、抗体对抗原的亲和常数(kd)、抗体的构象、蛋白质稳定性和抗体的半衰期。
[0140]
当在本文中使用时，术语“表位标记的”是指与“表位标签”融合的抗cd40抗体。“表位标签”是具有足够氨基酸数量以提供用于抗体产生的表位的多肽，但被设计为使其不干扰人源化抗cd40抗体的所需活性。表位标签通常是足够独特的，使得针对所述表位标签产生的抗体基本上不会与其他表位交叉反应。合适的标签多肽通常含有至少6个氨基酸残基，并且通常含有约8至50个氨基酸残基或约9至30个残基。表位标签和结合表位的抗体的例子包括流感ha标签多肽及其抗体12ca5(field等人,1988mol.cell.biol.8:2159-2165；c-myc标签及其8f9、3c7、6e10、g4、b7和9e10抗体(evan等人,1985,mol.cell.biol.5(12):3610-3616；以及单纯疱疹病毒糖蛋白d(gd)标签及其抗体(paborsky等人1990,protein engineering 3(6):547-553)。在某些实施方案中，表位标签是“补救受体结合表位”。如本文所用，术语“补救受体结合表位”是指igg分子(例如igg1、igg2、igg3或igg4)的fc区的表位，其负责增加igg分子的体内血清半衰期。
[0141]
在一些实施方案中，本发明的抗体可以缀合至细胞毒性剂。这是抑制或预防细胞功能和/或引起细胞破坏的任何物质。所述术语旨在包括放射性同位素(例如i
131
、i
125
、y
90
和re
186
)、化学治疗剂和毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素及其片段。此类细胞毒性剂可以使用标准程序来缀合至本发明的人源化抗体，并且例如用于治疗被指示使用所述抗体治疗的患者。
[0142]“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化合物。可以与本发明的治疗性抗体缀合的化学治疗剂存在许多例子。此类化学治疗剂的例子包括烷化剂，例如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯并替派、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；多聚乙酰(特别是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡利司他汀；cc-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；瑞奥斯他汀(auristatin)(包括类似物单甲基-瑞奥斯他汀e和单甲基-瑞奥斯他汀f)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物kw-2189和cb1-tm1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)(例如苯丁酸氮芥)、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧
氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1i和卡奇霉素(参见例如，agnew,chem.intl.ed.engl.,33:183-186)；达尼霉素(dynemicin)，包括达尼霉素a；双磷酸盐，如氯膦酸盐；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素c(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(adriamycin
tm
)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(如丝裂霉素c)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泛霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁多柔比星(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，如卡普睾酮(calusterone)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯；抗肾上腺素，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲络司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲酯(edatraxate)；去氧胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依法磷酸(elfornithine)；依利醋氨；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；类美登素(maytansinoids)，如美登素(maytansine)和安丝菌素；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫吡坦(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；丙亚胺(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2
”-
三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其是t-2毒素、维拉库林a(verracurin a)、漆斑菌素a(roridin a)和蛇形菌素(anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加息托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“ara-c”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇(bristol-myers squibb oncology，普林斯顿，新泽西州)和多西他赛(doxetaxel)(
rhone-poulenc rorer，安斯艾尔，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemzar
tm
)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨navelbine
tm
)；米托恩醌；替尼泊苷；依达曲塞；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类维生素a，例如视黄酸；卡培他滨；以及上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义中还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药，例如抗雌激素药和选择性雌激素受体调节剂(serm)，包括例如他莫昔芬(包括nolvadex
tm
)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、可莫昔芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(fareston
tm
)；抑制调节肾上腺的雌激素产生的酶芳香酶的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、乙酸甲地孕酮(megace
tm
)、依西美坦、福美斯坦、法倔唑、伏洛唑(rivisor
tm
)、来曲唑(femara
tm
)和阿那曲唑(arimidex
tm
)；以及抗雄激素，诸如氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这些药剂中的任何一种或多种可以缀合至本发明的人源化抗体，以提供用于治疗各种障碍的有用治疗剂。
[0143]
抗体也可以缀合至前药。“前药”是药学活性物质的前体或衍生物形式，其与亲本药物相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小，并且能够被酶促活化或转化为活性更高的形式。参见例如，wilman,1986,“prodrugs in cancer chemotherapy”,in biochemical society transactions,14,第375-382页,第615次会议；belfast和stella等人,1985,“prodrugs:a chemical approach to targeted drug delivery,in:”directed drug delivery,borchardt等人(编辑)，第247-267页,humana press。有用的前药包括但不限于含有磷酸酯的前药、含有硫代磷酸酯的前药、含有硫酸酯的前药、含有肽的前药、d-氨基酸修饰的前药、糖基化的前药、含有β-内酰胺的前药、含有任选地取代的苯氧基乙酰胺的前药以及含有任选地取代的苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和可以转化为活性更强的无细胞毒性药物的其他5-氟尿苷前药。可以衍生为前药形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文所述的那些化学治疗剂。
[0144]
对于诊断以及治疗监测的目的，本发明的抗体也可以缀合至标记物，所述标记物可以是单独的标记物或者标记物和另外的第二药剂(前药、化学治疗剂等)。与其他第二药剂区分开的标记物是指作为可检测化合物或组合物的药剂，并且其可以直接或间接缀合至本发明的人源化抗体。标记物本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况下，可以催化底物化合物或组合物的可检测的化学改变。可以制备标记的人源化抗cd40抗体，并将其用于各种应用中，包括体外和体内诊断。
[0145]
本发明的抗体可以配制成脂质体制剂的一部分，以便实现其在体内的递送。“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的小囊泡。脂质体可用于向哺乳动物递送化合物或配制品，如本文公开的人源化抗cd40抗体，其任选地与一种或多种药物活性剂和/或标记物偶合或组合。脂质体的组分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。
[0146]
本发明的某些方面涉及编码本发明的人源化抗体的一个或多个结构域的分离的核酸。“分离的”核酸分子是从至少一种污染核酸分子中鉴定和分离的核酸分子，所述核酸分子在抗体核酸的天然来源中通常与所述污染核酸分子缔合。分离的核酸分子与天然细胞
中存在的核酸分子区别。
[0147]
在本发明的各个方面，将重组表达人源化抗体的一个或多个结构域。这种重组表达可以采用一个或多个控制序列，即在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的多核苷酸序列。适用于原核细胞的控制序列包括例如启动子、操纵基因和核糖体结合位点序列。真核生物控制序列包括但不限于启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。这些控制序列可用于在原核和真核宿主细胞中表达并产生人源化抗cd40抗体。
[0148]
当核酸序列与另一核酸序列处于功能关系时，所述核酸序列是“可操作连接的”。例如，如果核酸前序列或分泌前导序列被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与编码所述多肽的核酸可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其可操作地与所述序列连接；或者如果核糖体结合位点的定位有助于翻译，则其可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”意指被连接的dna序列是邻接的，并且在分泌前导序列的情况下，是邻接的并且在阅读框中。然而，增强子任选地是邻接的。可以通过在方便的限制性位点处进行连接来实现连接。如果不存在此类位点，则可以使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
[0149]
如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称均包括其后代。因此，“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和源自它的培养物，无需考虑转移次数。
[0150]
用于治疗目的的术语“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家畜和农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人类。
[0151]
如本文所用，“障碍”是将受益于使用本文所述的人源化抗cd40抗体进行的治疗的任何病症。这包括慢性和急性障碍或疾病，包括使哺乳动物易患讨论中的障碍的那些病理病症。本文要治疗的障碍的非限制性例子包括癌症、血液恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、白血病和淋巴样恶性肿瘤以及炎性障碍、血管生成障碍、自身免疫性障碍和免疫学障碍。
[0152]
术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。
[0153]
如本文所用，术语“cd40相关障碍”或“cd40相关疾病”是指其中指示表达cd40的细胞的修饰或消除的病症。这些细胞包括表现出异常增殖的表达cd40的细胞或与癌性或恶性生长相关联的表达cd40的细胞。表现出cd40抗原的异常表达的癌症的更具体例子包括b淋巴母细胞、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、t细胞淋巴瘤、卡波西氏肉瘤、骨肉瘤、表皮和内皮肿瘤、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、皮肤癌(黑色素瘤)、膀胱癌和肾癌。此类障碍包括但不限于白血病、淋巴瘤(包括b细胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特罗姆巨球蛋白血症；实体瘤，包括肉瘤，例如骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性黑色素瘤、腺癌(包括卵巢腺癌)、卡波西氏肉瘤/卡波西氏肿瘤和鳞状细胞癌。
[0154]
与cd40相关的障碍还包括免疫系统疾病和障碍，例如自身免疫性障碍和炎性障碍。此类病症包括但不限于类风湿性关节炎(ra)、全身性红斑狼疮(sle)、硬皮病、舍格伦综合征、多发性硬化症、牛皮癣、炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)、肺部炎症、哮喘和特发性血小板减少性紫癜(itp)。
[0155]
当在本文中使用时，短语“阻止...的生长”或“生长抑制”是指抑制细胞、尤其表达cd40抗原的赘生性细胞类型的生长或增殖。因此，生长抑制例如显著降低了s期赘生性细胞
的百分比。
[0156]
术语“静脉内输注”是指在超过大约15分钟、通常在大约30至90分钟之间的时间段内，将药剂引入动物或人类患者的静脉中。
[0157]
术语“静脉团注”或“静脉推注”是指将药物施用至动物或人类的静脉中，使得身体在大约15分钟或更短的时间内，通常在5分钟或更短的时间内接受所述药物。
[0158]
术语“皮下施用”是指通过从药物容器相对缓慢的持续递送，将药剂引入动物或人类患者的皮肤下，优选在皮肤与下层组织之间的囊袋内。向上且远离下层组织掐捏或拉拔皮肤可以产生囊袋。
[0159]
术语“皮下输注”是指通过在包括但不限于30分钟或更短或者90分钟或更短的时间段中从药物容器相对缓慢的持续递送，将药剂引入动物或人类患者的皮肤下，优选在皮肤与下层组织之间的囊袋内。任选地，输注可以通过皮下植入在动物或人类患者的皮肤下植入的药物递送泵来进行，其中所述泵在预定的时间段(例如30分钟、90分钟或跨越治疗方案的长度的时间段)中递送预定量的药物。
[0160]
术语“皮下团注”是指在动物或人类患者的皮肤下进行药物施用，其中团注药物递送少于大约15分钟；在另一方面，少于5分钟，并且在又另一方面，少于60秒。在还又另一个方面，施用在皮肤与下层组织之间的囊袋内进行，其中所述囊袋可以通过向上且远离下层组织掐捏或拉拔皮肤来产生。
[0161]
术语“治疗有效量”用于指代活性剂缓解或改善所治疗障碍的一种或多种症状的量。在这种情况下，该量具有有益的患者结果，例如生长停滞效应或引起细胞缺失。在一方面，治疗有效量具有细胞凋亡活性，或者能够诱导细胞死亡。在另一方面，治疗有效量是指已经显示出在例如减慢疾病进展中有效的目标血清浓度。根据待治疗的病症，可以按常规方式测量功效。例如，在特征为表达cd40的细胞的赘生性疾病或障碍中，可以通过评估至疾病进展的时间或确定反应率来测量功效。
[0162]
如本文所用，术语“治疗”和“疗法”等意指包括导致任何临床上需要或有益的效果的对疾病或障碍的治疗性以及预防性或抑制性措施，包括但不限于改善或缓解一种或多种症状、消除、减慢或停止疾病或障碍的进展。因此，例如，术语治疗包括在疾病或障碍的症状发作之前或之后施用药剂，从而预防或去除所述疾病或障碍的一种或多种体征。作为另一个例子，所述术语包括在疾病的临床表现后施用药剂以对抗疾病的症状。此外，在施用影响疾病或障碍的临床参数(例如组织损伤的程度或者转移的量或程度)的情况下，无论所述治疗是否导致疾病的改善，在发作之后并且在临床症状已发展之后施用药剂都构成如本文所用的“治疗”或“疗法”。此外，只要与不使用人源化cd40抗体组合物的情况下的症状相比，单独的或与另一种治疗剂组合的本发明的组合物减轻或改善所治疗障碍的至少一种症状，则无论是否缓解了所述障碍的所有症状，结果都应被认为是对潜在障碍的有效治疗。
[0163]
术语“包装说明书”用于指代通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，所述说明书包含关于此类治疗产品的适应症、用法、施用、禁忌症和/或有关使用的警告的信息。
[0164]
抗体
[0165]
本文描述并公开了人源化抗cd40抗体，以及包含一种或多种本发明的人源化抗cd40抗体的组合物和制品。本发明的抗体还披露于美国专利号8,591,900和wo/2011/123489，所述专利各自的内容以引用方式并入本文。还描述了包括人源化抗cd40抗体的抗
原结合片段的结合剂。人源化抗cd40抗体和结合剂可以阻止细胞生长，引起表达cd40的细胞的缺失，或者以其他方式诱导或引起对靶细胞的细胞毒性或细胞抑制作用。人源化抗cd40抗体和结合剂可用于治疗特征在于表达cd40表面抗原的细胞增殖的多种疾病或障碍。人源化抗cd40抗体和cd40结合剂各自包含特异性识别cd40表位的至少一部分(即抗原结合片段)。
[0166]
在初始表征中，基于cd40结合表征选择鼠类抗体。
[0167]
根据这些初步研究，选择具有以下表1所示的重链可变区和表2所示的轻链可变区的鼠类抗体：表1：cd40鼠类前导序列-vh序列表2：cd40鼠类前导序列-vk序列
[0168]
基于框架同源性、cdr结构、保守的典范残基、保守的界面包装残基和其他参数，为每个小鼠前导序列选择人类框架序列。
[0169]
各种鼠类抗体选择抗体的鼠类重链和轻链cdr分别显示于表3和表4中：表3：重链cdr序列
上文列出的h-cdr1是利用使用chothia编号系统的序列(al-lazikani等人,(1997)jmb 273,927-948)。所述序列的kabats编号由粗体斜体文本表示，并且imgt编号由上表中cdr1和cdr2的残基的加下划线文本示出。2h11、10f2和19b10各自的h-cdr3的序列是ttsyyvgtygy(seq id no:77)，并且20e2的h-cdr3的序列是arqdgyryamdy(seq id no:78)。表4：轻链cdr序列
同样，在表4中使用chothia编号系统，其中序列的kabats编号由粗体斜体文本表示，并且imgt编号由加下划线文本示出。
[0170]
选择与嵌合亲本fab相比显示更好或同等结合的fab用于转化为igg。来自20e2系列的克隆被转换为两种不同的igg形式：a)igg4dm(双突变体)在fc/铰链区具有两个突变，即减少半分子形成的ser228pro和进一步减少fcγr结合的leu235glu。b)igg1ko(效应子功能的敲除)在fc区具有两个突变，即降低效应子功能例如fcγr和补体结合的leu234ala和leu235ala。两种igg形式均描述于文献中。实施例1更详细地描述了三种候选物的人源化。这种人源化的结果产生人源化抗体序列，其具有如下所示的重链和轻链序列：
[0171]
在一些实施方案中，抗原结合片段可以例如通过结合cd40表面抗原来阻断细胞的增殖或以其他方式阻止细胞的生长或引起其耗竭、死亡或以其他方式使其缺失。例如，在t和b细胞恶性肿瘤中，当恶性细胞暴露于导致正常淋巴细胞活化的刺激时，通常会产生抗肿瘤作用(例如，生长停滞,伴随或不伴随细胞缺失或凋亡)。已经用经由抗原受体或共刺激受体的信号观察到了这种活化诱导的生长停滞(参见例如，ashwell等人,1987,science237:61；bridges等人,1987,j.immunol.139:4242；page和defranco,1988,j.immunol.140:
3717；以及beckwith等人,1990,j.natl.cancer inst.82:501)。由于抗体或可溶性配体的特异性结合，cd40刺激抑制b细胞淋巴瘤生长(参见例如，funakoshi等人,1994,blood 83:2787-2794)。以此方式抑制恶性细胞生长并针对cd40表面抗原的药剂是合适药剂的例子。
[0172]
cd40特异性药剂包括与cd40(例如人类cd40或其变体)结合的人源化抗cd40抗体的抗原结合片段。cd40特异性药剂和抗体可以任选地与细胞毒性剂或化学治疗剂缀合或融合。在人源化抗体与cd40表面抗原结合并导致cd40表达细胞类型耗竭的方面，结合的特征通常在于在体内寻靶至cd40表面抗原细胞。合适的结合剂以足够的亲和力和/或亲合力结合cd40抗原，使得cd40特异性药剂通过特异性地靶向表达抗原的细胞而可用作治疗剂。
[0173]
在一些方面，人源化抗体使cd40配体与cd40的结合降低至少45％、至少50％、至少60％、或至少75％、或至少80％、或至少90％、或至少95％。
[0174]
在一些实施方案中，人源化抗cd40抗体(包括其抗原结合片段，例如重链和轻链可变结构域)包含源自上文描述的抗体a(重链序列＝seq id no:27；seq id no:28；seq id no:29或seq id no:30；轻链序列＝seq id no:26)、抗体b(重链序列＝seq id no:32；seq id no:33；seq id no:34；或seq id no:35；轻链序列＝seq id no:31)和抗体c(重链序列＝seq id no:37；seq id no:38；seq id no:39或seq id no：40；轻链序列＝seq id no:36；)的cdr的残基的氨基酸序列，以及源自人类免疫球蛋白的框架区的氨基酸残基。人源化抗cd40抗体任选地在共有或种系框架区中包括特异性氨基酸取代。
[0175]
这些框架位置的氨基酸残基的特异性取代可以改善抗体性能的各个方面，包括结合亲和力和/或稳定性，这优于在通过将cdr或hvl“直接交换”到人类种系框架区中而形成的人源化抗体中显示的结合亲和力和/或稳定性，如下文例子中所示。
[0176]
在一些实施方案中，本发明描述了具有重链(vh)序列seq id no:1至seq id no:4和轻链(vl)序列seq id no:5至seq id no:8(参见以上表1和表2)的其他单克隆抗体。这些鼠类抗体的cdr序列示出于表3和表4中，将这些cdr置于人类共有重链和轻链可变结构域的fr中，将产生本发明的有用的人源化抗体。
[0177]
在一些特定实施方案中，本文公开的人源化抗cd40抗体至少包含含有如上文表1至表4中所示的鼠类单克隆抗体的cdr或hvl以及人类种系重链和轻链可变结构域的fr的重链或轻链可变结构域。在示例性实施方案中，本文产生的人源化抗体为：抗体a、抗体b和抗体c，并且所述抗体的各种重链和轻链序列示出于seq id no:26至seq id no:40。
[0178]
在特定实施方案中，考虑了具有seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29或seq id no:30中任一者的重链序列与轻链序列seq id no:26的组合的抗体。替代性抗体包括具有重链序列seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34或seq id no seq id no:35与轻链序列seq id no:31的组合的那些抗体。在仍另外的实施方案中，提供了具有重链序列seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39或seq id no:40与轻链序列seq id no:36的组合的人源化抗体。
[0179]
这些序列的cdr示出在表3和表4中。在特定实施方案中，考虑在这些示例性免疫球蛋白之间具有交换的cdr区(即，例如将抗体a的一个或两个cdr与来自抗体c的类似cdr交换)的嵌合抗体可以产生有用的抗体。
[0180]
在某些实施方案中，人源化抗cd40抗体是抗体片段。上文已经总体上讨论了各种抗体片段，并且已经开发了用于产生抗体片段的技术。片段可通过对完整抗体进行蛋白水
解消化而获得(参见例如，morimoto等人,1992,journal of biochemical and biophysical methods 24:107-117；以及brennan等人,1985,science 229:81)。可替代地，片段可以在重组宿主细胞中直接产生。例如，可以直接从大肠杆菌(e.coli)回收fab'-sh片段并且将其化学偶合以形成f(ab')2片段(参见例如，carter等人,1992,bio/technology10:163-167)。通过另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离f(ab')2片段。用于产生抗体片段的其他技术对于熟练从业人员会是显而易见的。
[0181]
某些实施方案包括人源化抗cd40抗体的f(ab')2片段，其包含seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29或seq id no:30中任一者的重链序列与轻链序列seq id no:26的组合。替代性抗体包括具有重链序列seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34或seq id no:35与轻链序列seq id no:31的组合的那些抗体。在仍另外的实施方案中，提供了具有重链序列seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39或seq id no:40与轻链序列seq id no:36的组合的人源化抗体。此类实施方案可包括含有这种f(ab')2的完整抗体。
[0182]
在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含介导效应子功能的恒定区。恒定区可以提供针对表达cd40的靶细胞的抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)应答。一个或多个效应子结构域可以是例如ig分子的fc区。通常，cd40结合剂募集和/或活化细胞毒性白细胞(例如，自然杀伤(nk)细胞、吞噬作用细胞(例如，巨噬细胞)和/或血清补体组分)。
[0183]
抗体的效应子结构域可以来自任何合适的脊椎动物物种和同种型。来自不同动物物种的同种型介导效应子功能的能力不同。例如，人类免疫球蛋白介导cdc和adcc/adcp的能力的次序通常分别为igm≈igg1≈igg3>igg2>igg4，并且igg1≈igg3>igg2/igm/igg4。鼠类免疫球蛋白介导cdc和adcc/adcp的次序通常分别为鼠类igm≈igg3>>igg
2b
>igg
2a
>>igg1，并且igg
2b
>igg
2a
>igg1>>igg3。在另一个例子中，鼠类igg
2a
介导adcc，而鼠类igg
2a
和igm均介导cdc。
[0184]
抗体修饰
[0185]
人源化抗cd40抗体和药剂可包括人源化抗cd40抗体或其抗原结合片段的修饰。例如，可能需要就效应子功能修饰抗体，以便增强抗体在治疗癌症中的有效性。一种此类修饰是将一个或多个半胱氨酸残基引入fc区，从而允许在此区域中形成链间二硫键。由此生成的同二聚抗体可以具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和/或抗体依赖性细胞毒性(adcc)。参见例如，caron等人,1992,j.exp med.176:1191-1195；以及shopes,1992,j.immunol.148:2918-2922。还可以使用异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚抗体，如wolff等人,1993,cancer research 53:2560-2565中所描述。可替代地，抗体可以被工程化为含有双fc区，从而增强抗体的补体裂解和adcc能力。参见stevenson等人,1989,anti-cancer drug design 3:219-230。
[0186]
已经通过修饰抗体fc区的糖基化模式产生了具有改善的支持adcc能力的抗体。这是可能的，因为c
h2
结构域中天冬酰胺残基n297处的抗体糖基化参与adcc必需的igg和fcγ受体之间的相互作用。宿主细胞系已被工程化以表达具有改变的糖基化的抗体，例如增加的二等分n-乙酰基葡萄糖胺或减少的岩藻糖。与增加二等分n-乙酰基葡萄糖胺的存在相比，减少岩藻糖更大程度地增强adcc活性。此外，低岩藻糖抗体对adcc的增强与fcγriiia v/f多态性无关。
[0187]
修饰抗体fc区的氨基酸序列是增强adcc的糖基化工程化的替代方案。已经通过广泛的突变分析确定了人类igg1上用于fcγ受体的结合位点。从而产生了具有增加对fcγriiia的结合亲和力并增强体外adcc的fc突变的人源化igg1抗体。另外，已经获得具有结合特性的许多不同排列的fc变体，所述排列例如改善的与特定fcγr受体的结合以及不变或减弱的与其他fcγr受体的结合。
[0188]
另一方面包括免疫缀合物，其包含与细胞毒性剂缀合的人源化抗体或其片段，所述细胞毒性剂例如化学治疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)。
[0189]
上文已经描述了可用于产生此类免疫缀合物的化学治疗剂。可以用于形成有用的免疫缀合物的酶活性毒素以及其片段包括白喉a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链(来自铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素a链、相思豆毒素a链、蒴莲根毒素a链、α-八叠球菌素、油桐(aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(phytolaca americana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素、单端孢霉烯等。多种放射性核素可用于产生放射性缀合的人源化抗cd40抗体。例子包括
212
bi、
131
i、
131
in、
90
y和
186
re。
[0190]
人源化抗cd40抗体与细胞毒性剂或化学治疗剂的缀合物可以通过已知方法使用多种双功能蛋白偶合剂来制备，所述双功能蛋白偶合剂例如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(spdp)、亚氨基硫杂环戊烷(it)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如己二亚氨酸二甲酯hcl)、活性酯(诸如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(诸如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如vitetta等人,1987,science 238:1098中所述制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。缀合物也可以使用可切割接头形成。
[0191]
在另一个实施方案中，抗体可以缀合至“受体”(例如链霉亲和素)以用于肿瘤预靶向。在此程序中，将抗体-受体缀合物施用于患者，然后使用清除剂从循环中除去未结合的缀合物，并且然后施用选择性结合受体(例如抗生物素蛋白)的“配体”，所述配体缀合至细胞毒性剂(例如，放射性核素)。
[0192]
本文公开的人源化抗cd40抗体也可以配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，例如epstein等人,1985,proc.natl.acad.sci.usa 82:3688；hwang等人,1980,proc.natl.acad.sci.usa77:4030；以及美国专利号4,485,045和4,544,545所述。具有延长的循环时间的脂质体披露于例如美国专利号5,013,556。
[0193]
特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法使用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和peg-衍生的磷脂酰乙醇胺(peg-pe)的脂质组合物产生。通过具有确定孔径的过滤器挤出脂质体，以产生具有所需直径的脂质体。本文公开的抗体的fab'片段可以通过二硫互换反应缀合至脂质体，如martin等人,1982,j.biol.chem.257:286-288所述。脂质体内任选地包含化学治疗剂(例如多柔比星)。参见例如，gabizon等人,1989,j.national cancer inst.81(19):1484。
[0194]
本文所描述且公开的抗体可以通过将抗体缀合至前药活化酶来用于adept(抗体导向的酶前药治疗)程序中，所述前药活化酶将前药(例如，肽基化学治疗剂)转化成活性抗癌药。参见例如，wo 81/01145、wo 88/07378和美国专利号4,975,278。可用于adept的免疫缀合物的酶组分是能够以这样的方式作用于前药以便将其转化成其更具活性的细胞毒性形式的酶。可用于adept的特定酶包括但不限于用于将含有磷酸盐的前药转化为游离药物的碱性磷酸酶；用于将含有硫酸盐的前药转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于将含有肽的前药转化为游离药物的蛋白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶b和l)；用于转化含有d-氨基酸取代基的前药的d-丙氨酰基羧肽酶；用于将糖基化前药转化为游离药物的碳水化合物裂解酶，例如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将以β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶；用于将分别在其胺氮上用苯氧基乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转化为游离药物的青霉素酰胺酶，例如青霉素v酰胺酶或青霉素g酰胺酶。可替代地，可以使用具有酶活性的抗体(“抗体酶(abzyme)”)将前药转化为游离的活性药物(参见例如，massey,1987,nature 328:457-458)。抗体-抗体酶缀合物可以通过已知方法来制备，用于将所述抗体酶递送至肿瘤细胞群，例如通过将酶共价结合至上文所讨论的人源化抗cd40抗体/异双功能交联剂来制备。可替代地，可以使用重组dna技术来构建融合蛋白，其至少包含至少与如上文所述的酶的功能活性部分连接的本文公开的抗体的抗原结合区(参见例如，neuberger等人,1984,nature 312:604-608)。
[0195]
在某些实施方案中，例如，可能期望使用人源化抗cd40抗体片段而不是完整抗体来增加肿瘤渗透。可能期望修饰抗体片段以便增加其血清半衰期。这可以例如通过将补救受体结合表位并入抗体片段中来实现。在一种方法中，可以使抗体片段的适当区域发生改变(例如，突变)，或者可以将表位并入肽标签中，然后例如通过dna或肽合成将所述肽标签融合至抗体片段的任一端或中间。参见例如，wo 96/32478。
[0196]
在其他实施方案中，还包括人源化抗cd40抗体的共价修饰。共价修饰包括对以下残基的修饰：半胱氨酰基残基、组氨酸残基、赖氨酰基和氨基端残基、精氨酰基残基、酪氨酰基残基、羧基侧基团(天冬氨酰基或谷氨酰基)、谷氨酰胺基和天冬酰胺基残基或丝氨酰基或苏氨酰基残基。另一种类型的共价修饰涉及将糖苷化学或酶促偶合至抗体。如果适用，此类修饰可以通过化学合成或者抗体的酶促或化学切割来进行。抗体的其他类型的共价修饰可以通过使抗体的靶向氨基酸残基与有机衍生剂反应来引入分子中，所述有机衍生剂能够与所选择的侧链或氨基端或羧基端残基反应。
[0197]
去除抗体上存在的任何碳水化合物部分可以化学或酶促完成。化学去糖基化描述于hakimuddin等人,1987,arch.biochem.biophys.259:52以及edge等人,1981,anal.biochem.,118:131。可以通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现抗体上碳水化合物部分的酶促切割，如thotakura等人,1987,meth.enzymol 138:350所述。
[0198]
另一种类型的有用共价修饰包括以以下文献中的一个或多个中所述的方式将抗体连接到多种非蛋白质聚合物中的一种，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯：美国专利号4,640,835、美国专利号4,496,689、美国专利号4,301,144、美国专利号4,670,417、美国专利号4,791,192和美国专利号4,179,337。
[0199]
人源化和氨基酸序列变体
[0200]
抗cd40抗体的氨基酸序列变体可通过将适当的核苷酸变化引入抗cd40抗体dna中或通过肽合成来制备。此类变体包括例如本文实施例的抗cd40抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有期望的特征。氨基酸变化还可以改变人源化或变体抗cd40抗体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数量或位置。
[0201]
用于鉴定抗cd40抗体的作为优选诱变位置的某些残基或区域的可用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如由cunningham和wells(science,244:1081-1085(1989))中所描述的。在此，鉴定残基或靶残基组(例如，带电荷的残基，诸如arg、asp、his、lys、和glu)并用中性或带负电的氨基酸(通常为丙氨酸)替代以影响氨基酸与cd40抗原的相互作用。然后通过在或对取代位点引入更多或其他变体，完善对取代展示功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，尽管预先确定了引入氨基酸序列变异的位点，但不需要预先确定突变本身的性质。例如，为了分析给定位点处的突变的性能，在靶标密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并且针对所需活性筛选所表达的抗cd40抗体变体。
[0202]
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合，长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括与表位标签融合的抗cd40抗体。抗cd40抗体分子的其他插入变体包括酶或增加抗体的血清半衰期的多肽与抗cd40抗体的n末端或c末端的融合。
[0203]
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗cd40抗体分子中去除至少一个氨基酸残基并且在其位置插入不同的残基。取代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但是也考虑fr改变。保守取代示出于表5中“优选取代”标题下。如果此类取代导致生物活性改变，则可以引入命名为“示例性取代”或如下文参考氨基酸类别进一步描述的更多实质性变化，并且筛选产物。表5：
[0204]
在蛋白质化学中，普遍认为抗体的生物学特性可通过选择对维持以下方面的效果差异显著的取代来实现：(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如片或螺旋构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性，将天然存在的残基分为以下组：
[0205]
(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
[0206]
(2)中性亲水性：cys、ser、thr；
[0207]
(3)酸性：asp、glu；
[0208]
(4)碱性：asn、gin、his、lys、arg；
[0209]
(5)影响链取向的残基：gly、pro；以及
[0210]
(6)芳香族：trp、tyr、phe。
[0211]
非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。
[0212]
任何不参与维持人源化或变体抗cd40抗体的适当构象的半胱氨酸残基也可以被
取代，通常被丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性，防止异常交联，或提供确立的与细胞毒性或细胞抑制性化合物的缀合点。相反地，可以向抗体添加一个或多个半胱氨酸键以改善其稳定性(尤其是在抗体是诸如fv片段的抗体片段的情况下)。
[0213]
一个类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的一种或多种所得变体将具有相对于生成所述变体的亲本抗体改善的生物特性。用于生成此类取代变体的一种便利方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，使若干高变区位点(例如，6-7个位点)突变以在每个位点处生成所有可能的氨基取代。由此生成的抗体变体从丝状噬菌体颗粒以单价方式展示，作为与包装在每个颗粒内的m13的基因iii产物的融合体。然后针对其生物学活性(例如结合亲和力)筛选噬菌体展示的变体。为了针对修饰鉴定候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。可替代地或另外地，可能有利的是，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体与人类cd40之间的接触点。此类接触残基和邻近残基是根据本文详述的技术进行取代的候选残基。一旦生成此类变体，使这组变体经受如本文所描述的筛选，并且可以选择在一个或多个相关测定中具有优异特性的抗体以用于进一步开发。
[0214]
抗体的另一种类型的氨基酸变体改变抗体的原始糖基化模式。“改变”意指使抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分缺失、和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。
[0215]
在一些实施方案中，可能期望修饰本发明的抗体以添加糖基化位点。抗体的糖基化通常是n连接或o连接的。n连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链附接。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-x-苏氨酸(其中x是除脯氨酸外的任何氨基酸)是用于将碳水化合物部分酶促附接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一者在多肽中的存在产生了潜在的糖基化位点。o连接的糖基化指将糖n-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附接至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。因此，为了使给定蛋白质例如抗体糖基化，将蛋白质的氨基酸序列工程化为含有一个或多个上文所述的三肽序列(用于n-连接的糖基化位点)。也可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加或取代至原始抗体的序列中来进行改变(对于o-连接的糖基化位点)。
[0216]
编码抗cd40抗体的氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域已知的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)，或者通过对抗cd40抗体的较早制备的变体或非变体形式进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、pcr诱变和盒式诱变来制备。
[0217]
多核苷酸、载体、宿主细胞和重组方法
[0218]
其他实施方案包括包含编码人源化抗cd40抗体的序列的分离的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞，以及用于产生所述人源化抗体的重组技术。分离的多核苷酸可以编码抗cd40抗体的任何期望形式，包括例如全长单克隆抗体、fab、fab'、f(ab')2和fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0219]
一些实施方案包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码抗体或抗体片段的序列，所述抗体或抗体片段具有以下任一者的重链可变区氨基酸序列：seq id no:1至4、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:
33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39或seq id no:40。一些实施方案包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码抗体或抗体片段的序列，所述抗体或抗体片段具有轻链可变结构域氨基酸序列seq id no:26、seq id no:31或seq id no:36。
[0220]
在一方面，一种或多种分离的多核苷酸序列编码抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段具有包含以下的氨基酸序列的重链可变结构域和轻链可变区：分别为seq id no:27和seq id no:26；分别为seq id no:28和seq id no:26；分别为seq id no:29和seq id no:26；分别为seq id no:30和seq id no:26；分别为seq id no:32和seq id no:31；分别为seq id no:33和seq id no:31；分别为seq id no:34和seq id no:31；分别为seq id no:35和seq id no:31；分别为seq id no:37和seq id no:36；分别为seq id no:38和seq id no:36；分别为seq id no:39和seq id no:36；分别为seq id no:40和seq id no:36。
[0221]
包含编码人源化抗cd40抗体或其片段或链的序列的一种或多种多核苷酸可以与一个或多个如本领域中已知的调节或控制序列融合，并且可以包含在如本领域已知的合适表达载体或宿主细胞中。编码重链或轻链可变结构域的每个多核苷酸分子可以独立地融合至编码恒定结构域例如人类恒定结构域的多核苷酸序列，从而能够产生完整抗体。可替代地，多核苷酸或其部分可以融合在一起，从而提供用于产生单链抗体的模板。
[0222]
对于重组产生，将编码抗体的多核苷酸插入可复制载体中以用于克隆(扩增dna)或表达。许多用于表达重组抗体的合适载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下中的一者或多者：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
[0223]
人源化抗cd40抗体也可以作为融合多肽产生，其中抗体与异源多肽融合，所述异源多肽例如信号序列或在成熟蛋白或多肽的氨基端具有特定切割位点的其他多肽。所选择的异源信号序列通常是由宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别并加工人源化抗cd40抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列可以被原核信号序列取代。信号序列可以是例如碱性磷酸酶、青霉素酶、脂蛋白、热稳定性肠毒素ii前导序列等。对于酵母分泌，天然信号序列可以被例如从以下获得的前导序列取代：酵母转化酶α因子(包括酵母菌属(saccharomyces)和克鲁维酵母属(kluyveromyces)α因子前导序列)、酸性磷酸酶、白色念珠菌(c.albicans)葡糖淀粉酶或wo 90/13646中所述的信号。在哺乳动物细胞中，可以使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gd信号。这个前体区域的dna在阅读框中与编码人源化抗cd40抗体的dna连接。
[0224]
表达和克隆载体含有使载体能够在一个或多个所选宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，此序列是使载体能够独立于宿主染色体dna复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。多种细菌、酵母和病毒的此类序列是熟知的。质粒pbr322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2-υ.质粒起点适用于酵母，并且各种病毒起点(sv40、多瘤病毒、腺病毒、vsv和bpv)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(通常仅可使用sv40起点，因为它含有早期启动子)。
[0225]
表达和克隆载体可含有编码选择标记以便于表达鉴定的基因。典型的选择标记基因编码赋予对抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性的蛋白质，或者可替代地是补体营养缺陷，或者在其他替代方案中供应复杂培养基中不存在
的特定营养素，例如编码芽孢杆菌(bacilli)d-丙氨酸消旋酶的基因。
[0226]
选择方案的一个例子利用药物来阻止宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。这种显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。哺乳动物细胞的常见选择标记是使得能够鉴定有能力吸收编码人源化抗cd40抗体的核酸的细胞的那些标记，例如dhfr(二氢叶酸还原酶)、胸苷激酶、金属硫蛋白-i和-ii(例如灵长类动物金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。首先通过在含有甲氨蝶呤(mtx，dhfr的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化体来鉴定经dhfr选择基因转化的细胞。在采用野生型dhfr时，适当的宿主细胞是dhfr活性缺陷的中国仓鼠卵巢(cho)细胞系(例如dg44)。
[0227]
可替代地，可通过在含有针对选择标记的选择剂(诸如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素、新霉素或g418)的培养基中进行细胞生长来选择经编码抗cd40抗体、野生型dhfr蛋白和另一种选择标记(诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(aph))的dna序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源dhfr的野生型宿主)。参见，例如，美国专利号4,965,199。
[0228]
当在作为宿主细胞的酵母细胞中进行重组产生的情况下，可以使用存在于酵母质粒yrp7中的trp1基因(stinchcomb等人,1979,nature 282:39)作为选择标记。trp1基因提供缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株(例如atcc号44076或pep4-1)的选择标记(jones,1977,genetics85:12)。然后，酵母宿主细胞基因组中trp1损伤的存在提供通过在没有色氨酸的情况下生长来检测转化的有效环境。类似地，缺乏leu2p的酵母菌株(诸如atcc 20,622和38,626)由携带leu2基因的已知质粒所补充。
[0229]
此外，源自1.6μm环状质粒pkd1的载体可用于转化克鲁维酵母。可替代地，报告了乳酸克鲁维酵母(k.lactis)的用于大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统(van den berg,1990,bio/technology 8:135)。还已经公开了用于由克鲁维酵母工业菌株分泌成熟重组人类血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体(fleer等人,1991,bio/technology 9:968-975)。
[0230]
表达和克隆载体通常含有被宿主生物识别并与编码抗cd40抗体或其多肽链的核酸分子可操作连接的启动子。适用于与原核宿主一起使用的启动子包括phoa启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(例如tac启动子)。其他已知细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子也将含有与编码人源化抗cd40抗体的dna可操作连接的shine-dalgamo(s.d.)序列。
[0231]
许多真核启动子序列是已知的。事实上，所有真核基因都具有富含at区，它位于转录起始位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是cncaat区，其中n可以是任何核苷酸。大多数真核基因的3'端是aataaa序列，它可能是向编码序列的3'端添加多聚a尾的信号。将所有这些序列适当地插入真核表达载体中。
[0232]
与酵母宿主一起使用的合适启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶的启动子，所述其他糖酵解酶例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。
[0233]
诱导型启动子具有受生长条件控制的转录的另外的优势。这些启动子包括以下酶
的酵母启动子区域：乙醇脱氢酶2、异细胞色素c、酸性磷酸酶、与氮代谢相关联的衍生酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。ep 73,657中进一步描述了用于酵母表达中的合适载体和启动子。酵母增强子还有利地与酵母启动子一起使用。
[0234]
载体中的人源化抗cd40抗体在哺乳动物宿主细胞中的转录受到例如从以下获得的启动子的控制：病毒基因组，所述病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(sv40)；异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；或热休克启动子，条件是此类启动子与宿主细胞系统相容。
[0235]
方便地以sv40限制性片段的形式获得sv40病毒的早期和晚期启动子，所述片段还含有sv40病毒复制起点。方便地以hindiii e限制性片段的形式获得人类巨细胞病毒的立即早期启动子。使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达dna的系统披露于美国专利号4,419,446。此系统的修改描述于美国专利号4,601,978。还参见reyes等人,1982,nature 297:598-601，其披露了在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下人类p-干扰素cdna在小鼠细胞中的表达。可替代地，劳斯肉瘤病毒长末端重复序列可以用作启动子。
[0236]
可以在重组表达载体中使用的另一个有用的元件是增强子序列，其用于增加高级真核生物对编码人源化抗cd40抗体的dna的转录。现在已知来自哺乳动物基因(例如，球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常，使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括复制起点后侧上的sv40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。关于用于活化真核启动子的增强元件的描述，还参见yaniv,1982,nature 297:17-18。可以将增强子剪接到载体中人源化抗cd40抗体编码序列的5'或3'位置处，但是优选地位于启动子5'的位点。
[0237]
真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体也可以含有转录终止和稳定mrna所需的序列。此类序列通常可从真核或病毒dna或cdna的5'非翻译区和偶尔3'非翻译区获得。这些区域包含在编码抗cd40抗体的mrna的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见wo 94/11026及其中披露的表达载体。在一些实施方案中，可以使用chef系统来表达人源化抗cd40抗体。(参见例如，美国专利号5,888,809；其公开内容以引用方式并入本文。)
[0238]
用于在本文的载体中克隆或表达dna的合适宿主细胞是上文所述的原核生物、酵母或高等真核生物细胞。适合于此目的的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(enterobacteriaceae)，诸如埃希氏杆菌属(escherichia)，例如大肠杆菌、肠杆菌(enterobacter)、欧文氏菌(erwinia)、克雷伯菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙门氏菌(salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium))、沙雷氏菌(serratia)(例如粘质沙雷氏菌(serratia marcescans))和志贺氏菌(shigella)，以及芽孢杆菌诸如枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)(例如1989年4月12日公开的dd 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41p)、假单胞菌(pseudomonas)(诸如铜绿假单胞菌)和链霉菌(streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(atcc 31,446)，但其他菌株例如大肠杆菌b、大肠杆菌x1776
(atcc31,537)和大肠杆菌w3110(atcc 27,325)是合适的。这些例子只是说明而非限制。
[0239]
除原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母菌也是人源化抗cd40抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。在低等真核宿主微生物中，酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是最常用的。然而，许多其他属、种和菌株一般是可获得的并且可用于本文中，例如粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属宿主，例如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(k.fragilis)(atcc 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(k.bulgaricus)(atcc 16,045)、柳条克鲁维酵母(k.wickeramii)(atcc 24,178)、沃氏克鲁氏酵母(k.waltii)(atcc 56,500)、果蝇克鲁维酵母(k.drosophilarum)(atcc 36,906)、耐热克鲁维酵母(k.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(k.marxianus)；耶氏酵母(yarrowia)(ep 402,226)；巴斯德毕赤酵母(pichia pastors)(ep 183,070)；假丝酵母(candida)；里氏木霉(trichoderma reesia)(ep 244,234)；粗糙链孢霉(neurospora crassa)；许旺酵母属(schwanniomyces)，例如西方许旺酵母(schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌诸如链孢霉属(neurospora)、青霉属(penicillium)、弯颈霉属(tolypocladium)和曲霉菌属(aspergillus)宿主，诸如构巢曲霉(a.nidulans)和黑曲霉(a.niger)。
[0240]
用于表达糖基化人源化抗cd40抗体的合适宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞，包括例如许多杆状病毒株和变体，以及来自诸如以下的宿主的相应许可昆虫宿主细胞：草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda，毛虫)、埃及伊蚊(aedes aegypti，蚊子)、白纹伊蚊(aedes albopictus，蚊子)，黑腹果蝇(drosophila melanogaster，果蝇)和家蚕(bombyx mori，蚕)。用于转染的多种病毒株是可公开获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(autographa californica)npv的l-1变体和家蚕npv的bm-5株，并且此类病毒可特别用于转染草地贪夜蛾细胞。
[0241]
棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
[0242]
在另一方面，人源化抗cd40的表达在脊椎动物细胞中进行。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已成为常规程序并且技术已广泛可用。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是经sv40转化的猴肾cv1系(cos-7，atcc crl 1651)、人胚肾系(293细胞或亚克隆用于悬浮培养的293细胞(graham等人,1977,j.gen virol.36:59)、幼仓鼠肾细胞(bhk，atcc ccl 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-dhfr1(cho，urlaub等人,1980,proc.natl.acad.sci.usa 77:4216；例如dg44)、小鼠睾丸支持细胞(tm4，mather,1980,biol.reprod.23:243-251)、猴肾细胞(cv1，atcc ccl 70)、非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcc crl-1587)、人宫颈癌细胞(hela，atcc ccl 2)、犬肾细胞(mdck，atcc ccl 34)、水牛鼠肝细胞(brl 3a，atcc crl1442)、人肺细胞(w138，atcc ccl 75)、人肝细胞(hep g2，hb 8065)、小鼠乳房瘤(mmt 060562，atcc ccl51)、tr1细胞(mather等,1982,annals n.y.acad.sci.383:44-68)、mrc 5细胞、fs4细胞和人类肝细胞瘤系(hep g2)。
[0243]
用上文所述的用于人源化抗cd40抗体产生的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在视需要修饰的常规营养培养基中培养用于诱导启动子，选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
[0244]
可以在多种培养基中培养用于产生本文所述的人源化抗cd40抗体的宿主细胞。可
商购的培养基诸如ham's f10(sigma-aldrich co.，圣路易，密苏里州)、最低要素培养基((mem),(sigma-aldrich co.)、rpmi-1640(sigma-aldrich co.)和杜尔贝科氏改良伊格培养基((dmem),sigma-aldrich co.)适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中一者或多者所述的任何培养基作为宿主细胞的培养基：ham等人,1979,meth.enz.58:44；barnes等人,1980,anal.biochem.102:255；美国专利号4,767,704、美国专利号4,657,866、美国专利号4,927,762、美国专利号4,560,655、美国专利号5,122,469、wo 90/103430和wo 87/00195。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(诸如hepes)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如庆大霉素)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。还可以适当浓度包括本领域技术人员将知的其他补充物。培养条件(诸如温度、ph等)是先前选择用于表达的宿主细胞所使用的那些条件，且对于普通技术人员是清楚的。
[0245]
当使用重组技术时，抗体可在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，则第一步可以破坏细胞以释放蛋白质。可以例如通过离心或超滤来去除颗粒碎片，即宿主细胞或裂解片段。carter等人,1992,bio/technology 10:163-167描述了一种用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的程序。简而言之，将细胞糊状物在乙酸钠(ph 3.5)、edta和苯甲基磺酰氟(pmsf)存在下经约30分钟解冻。可以通过离心去除细胞碎片。在抗体分泌到培养基中的情况下，则通常首先使用市售蛋白质浓缩滤器(例如amicon或millipore pellicon超滤单元)浓缩来自此类表达系统的上清液。可以在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂(如pmsf)以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。可以使用多种方法从宿主细胞分离抗体。
[0246]
可使用例如以下方法来纯化从细胞制备的抗体组合物：羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱，其中亲和色谱是典型的纯化技术。蛋白质a作为亲和配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白fc结构域的种类和同种型。蛋白质a可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(参见例如，lindmark等人,1983 j.immunol.meth.62:1-13)。推荐蛋白质g用于所有小鼠同种型和用于人γ3(参见例如，guss等人,1986 embo j.5:1567-1575)。亲和配体所附接的基质最经常是琼脂糖，但是可使用其他基质。机械稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯允许比用琼脂糖可实现的更快的流速和更短的加工时间。在抗体包含c
h3
结构域的情况下，bakerbond abx
tm
树脂(j.t.baker，菲利普斯堡，新泽西州)可用于纯化。取决于待回收的抗体，也可使用其他蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相hplc、二氧化硅上的色谱、肝素sepharose
tm
上的色谱、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的色谱、色谱聚焦、sds-page和硫酸铵沉淀。
[0247]
在任何一个或多个初步纯化步骤之后，可将包含目标抗体和污染物的混合物进行低ph疏水相互作用色谱，使用ph约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，通常在低盐浓度(例如约0-0.25m盐)下进行。
[0248]
还包括在如本文定义的低、中和高严格条件下与由一个或多个分离的多核苷酸序列表示的核苷酸序列的全部或部分(例如，编码可变区的部分)杂交的核酸，所述分离的多核苷酸序列编码抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段具有包含以下的氨基酸序列的重链可变结构域和轻链可变区：分别为seq id no:27和seq id no:26；分别为seq id no:28和
seq id no:26；分别为seq id no:29和seq id no:26；分别为seq id no:30和seq id no:26；分别为seq id no:32和seq id no:31；分别为seq id no:33和seq id no:31；分别为seq id no:34和seq id no:31；分别为seq id no:35和seq id no:31；分别为seq id no:37和seq id no:36；分别为seq id no:38和seq id no:36；分别为seq id no:39和seq id no:36；分别为seq id no:40和seq id no:36。杂交核酸的杂交部分的长度通常为至少15(例如20、25、30或50)个核苷酸。杂交核酸的杂交部分与编码抗cd40多肽(例如重链或轻链可变区)或其补体的核酸的部分或全部的序列至少80％(例如至少90％、至少95％或至少98％)相同。本文所述类型的杂交核酸可以例如用作克隆探针、引物(例如pcr引物)或诊断探针。
[0249]
一些实施方案包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码抗体或抗体片段的序列，所述抗体或抗体片段具有与以下中的任一者的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％相同的重链可变区氨基酸序列：seq id no:1至4、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39或seq id no:40。一些实施方案包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码抗体或抗体片段的序列，所述抗体或抗体片段具有与以下中的任一者的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％相同的轻链可变结构域氨基酸序列：seq id no:5至8、seq id no:26、seq id no:31或seq id no:36。
[0250]
在一方面，一个或多个分离的多核苷酸序列编码抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段具有重链可变结构域和轻链可变区，所述重链可变结构域和轻链可变区各自包括与如下抗体或抗体片段的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％相同的氨基酸序列：具有包含以下的氨基酸序列的重链可变结构域和轻链可变区：分别为seq id no:27和seq id no:26；分别为seq id no:28和seq id no:26；分别为seq id no:29和seq id no:26；分别为seq id no:30和seq id no:26；分别为seq id no:32和seq id no:31；分别为seq id no:33和seq id no:31；分别为seq id no:34和seq id no:31；分别为seq id no:35和seq id no:31；分别为seq id no:37和seq id no:36；分别为seq id no:38和seq id no:36；分别为seq id no:39和seq id no:36；分别为seq id no:40和seq id no:36。
[0251]
在另一方面，本发明涉及上文刚刚描述的实施方案中的多核苷酸，其中编码的抗体或抗体片段的重链可变结构域和轻链可变区包含与如下抗体或抗体片段的氨基酸序列至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列：具有包含以下的氨基酸序列的重链可变结构域和轻链可变区：在一个实施方案中，分别为seq id no:27和seq id no:26；在另一个实施方案中，分别为seq id no:28和seq id no:26；在另一个实施方案中，分别为seq id no:29和seq id no:26；在另一个实施方案中，分别为seq id no:30和seq id no:26；在另一个实施方案中，分别为seq id no:32和seq id no:31；在另一个实施方案中，分别为seq id no:33和seq id no:31；在另一个实施方案中，分别为seq id no:34和seq id no:31；在另一个实施方案中，分别为seq id no:35和seq id no:31；在另一个实施方案中，分别为seq id no:37和seq id no:36；在另一个实施方案中，分别为seq id no:38和seq id no:36；在另一个实施方案中，分别为seq id no:39和seq id no:36；并且在另一个实施方案
中，分别为seq id no:40和seq id no:36。
[0252]
如本文所用，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性百分比”是指当比较并针对最大对应性进行比对时，相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列。为了确定同一性百分比，出于最佳对比目的比对所述序列(例如，可在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位，以实现与第二氨基酸或核酸序列的最佳比对)。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。在第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是所述序列共有的相同位置数的函数(即，同一性％＝相同位置数/位置(例如，重叠位置)总数x100)。在一些实施方案中，在视需要(例如，排除延伸超出所比较序列的另外的序列)在序列内引入空位后，比较的两个序列具有相同的长度。例如，当比较可变区序列时，不考虑前导序列和/或恒定结构域序列。对于两个序列之间的序列比较，“对应的”cdr是指两个序列的相同位置中的cdr(例如，每个序列的cdr-h1)。
[0253]
可以使用数学算法完成两个序列之间的同一性百分比或相似性百分比的确定。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性例子是karlin和altschul,1990,proc.natl.acad.sci.usa 87:2264-2268的算法，在karlin和altschul,1993,proc.natl.acad.sci.usa 90:5873-5877中修改。此种算法并入了altschul等人,1990,j.mol.biol.215:403-410的nblast和xblast程序中。blast核苷酸搜索可用nblast程序来进行，得分＝100，字长＝12，以获得与编码目标蛋白的核酸同源的核苷酸序列。blast蛋白质搜索可用xblast程序来进行，得分＝50，字长＝3，以获得与目标蛋白质同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位化比对，可以使用空位化blast，如altschul等人,1997,nucleic acids res.25:3389-3402中所描述。可替代地，可使用psi-blast来进行迭代搜索，其检测分子之间的远缘关系(同上)。当使用blast、空位化blast和psi-blast程序时，可以使用各个程序(例如xblast和nblast)的默认参数。用于序列比较的数学算法的另一个优选的非限制性例子是myers和miller,cabios(1989)的算法。这种算法已被并入到align程序(2.0版)中，所述程序是gcg序列比对软件包的一部分。当使用align程序比较氨基酸序列时，可以使用pam120权重残基表、等于12的空位长度罚分和等于4的空位罚分。用于序列分析的其他算法为本领域已知的，并且包括torellis和robotti,1994,comput.appl.biosci.10:3-5中描述的advance和adam；以及pearson和lipman,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:2444-8中描述的fasta。在fasta内，ktup是用于设置搜索的灵敏度和速度的控制选项。如果ktup＝2，则通过观察比对的残基对来发现正在比较的两个序列中的相似区域；如果ktup＝1，则检查单个比对的氨基酸。对于蛋白质序列，可以将ktup设置为2或1，或者对于dna序列，可以将ktup设置为1至6。如果未指定ktup，则蛋白质的默认值为2，并且dna的默认值为6。可替代地，可以使用clustal w算法进行蛋白质序列比对，如higgins等人,1996,methods enzymol.266:383-402所述。
[0254]
非治疗用途
[0255]
本文所述的抗体可用作亲和纯化剂。在此过程中，使用本领域熟知的方法将抗体固定在固相例如蛋白质a树脂上。使固定化抗体与含有待纯化的cd40蛋白(或其片段)的样品接触，并且然后用合适的溶剂洗涤支持物，所述溶剂将除去样品中除了与固定化抗体结
合的cd40蛋白以外的基本上所有材料。最后，用另一种合适的溶剂洗涤支持物，所述溶剂将从抗体中释放cd40蛋白。
[0256]
人源化抗cd40抗体也可用于诊断测定，以对cd40蛋白进行检测和/或定量，例如检测特定细胞、组织或血清中的cd40表达。
[0257]
在一些实施方案中，例如出于诊断目的用可检测的可检测部分标记抗体将是有利的。可获得许多可检测的标记物，包括放射性同位素、荧光标记物、酶底物标记等。可以使用各种已知技术将标记物与抗体间接缀合。例如，抗体可以与生物素缀合，并且上文提到的三大类标记物中的任一种可以与抗生物素蛋白缀合，或者反之亦然。生物素选择性结合抗生物素蛋白，并且因此标记物可以这种间接方式与抗体缀合。可替代地，为了实现标记物与抗体的间接缀合，可以将抗体与小半抗原(例如地高辛)缀合，并且将上文提到的不同类型的标记物之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)缀合。由此，可以实现标记物与抗体的间接缀合。
[0258]
示例性放射性同位素标记物包括
35
s、
14
c、
125
i、3h和
131
i。可以使用例如current protocols in immunology,第1卷和第2卷,1991,coligen等人编辑wiley-interscience,纽约,纽约州,pubs中描述的技术，用放射性同位素标记抗体。放射性可以例如通过闪烁计数来测量。
[0259]
示例性荧光标记物包括来源于稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红蛋白和德克萨斯红的标记物。可以通过已知技术将荧光标记物缀合至抗体，所述技术例如在current protocols in immunology(同上)中披露的那些技术。荧光可以使用荧光计来定量。
[0260]
在本领域中已知有多种充分表征的酶-底物标记物(关于综述，参见例如，美国专利号4,275,149)。酶通常催化生色底物的化学改变，所述改变可以使用各种技术进行测量。例如，改变可以是可以分光光度法测量的底物的颜色变化。可替代地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。上文描述了用于对荧光变化定量的技术。化学发光底物通过化学反应以电子方式激发，并且然后可以发射可以使用例如化学发光计测量的光，或向荧光受体供能。
[0261]
酶标记物的例子包括萤光素酶(例如荧火虫萤光素酶和细菌萤光素酶)(美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(诸如辣根过氧化物酶(hrpo))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶与抗体缀合的技术描述于例如以下文献中：o'sullivan等人,1981,methods for the preparation of enzyme-antibody conjugates for use in enzyme immunoassay,in methods in enzym.(j.langone&h.van vunakis,编辑),academic press,纽约,73:147-166。
[0262]
酶-底物组合的例子包括例如：以过氧化氢酶为底物的辣根过氧化物酶(hrpo)，其中过氧化氢酶氧化染料前体，例如邻苯二胺(opd)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(tmb)；以磷酸对硝基苯酯为生色底物的碱性磷酸酶(ap)；以及具有生色底物例如对硝基苯基-β-d-半乳糖苷酶或荧光底物4-甲基伞形基-β-d-半乳糖苷酶的β-d-半乳糖苷酶(β-d-gal)。
[0263]
本领域技术人员可以使用许多其他酶-底物组合。有关这些组合的一般综述，请参
见美国专利号4,275,149和美国专利号4,318,980。
[0264]
在另一个实施方案中，使用未标记人源化抗cd40抗体，并用结合人源化抗cd40抗体的标记抗体进行检测。
[0265]
本文所述的抗体可用于任何已知的测定方法中，例如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定。参见例如，zola,monoclonal antibodies:a manual of techniques,第147-158页(crc press,inc.1987)。
[0266]
诊断试剂盒
[0267]
人源化抗cd40抗体可以用于诊断试剂盒中，即预定量的试剂与用于进行诊断测定的说明书的包装组合。在抗体被酶标记的情况下，试剂盒可包括酶所需的底物和辅因子，例如提供可检测生色团或荧光团的底物前体。另外，可以包含其他添加剂，例如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。可以广泛地改变各种试剂的相对量以提供显著优化测定灵敏度的溶液中的试剂浓度。试剂可以干燥粉末形式(通常是冻干的)提供，其包括在溶解后将提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。
[0268]
治疗用途
[0269]
在另一个实施方案中，本文公开的人源化抗cd40抗体可用于治疗与如本文所述的cd40表达相关联的各种障碍。
[0270]
人源化抗cd40抗体或药剂是通过任何合适的方式施用的，所述方式包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻腔内施用以及(如果局部免疫抑制治疗需要)病灶内施用(包括在移植前灌注抗体或使移植物以其他方式与抗体接触)。人源化抗cd40抗体或药剂可以例如以输注或团注形式施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。另外，人源化抗cd40抗体通过脉冲输注以合适的方式来施用，特别是以抗体的递减剂量施用。在一方面，给药通过注射、最优选静脉内或皮下注射来给予，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。
[0271]
对于疾病的预防或治疗，抗体的合适剂量将取决于多种因素，例如如上文所定义的待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程、施用抗体是用于预防还是用于治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对抗体的反应，以及主治医师的判断。将抗体以合适的方式一次或在一系列治疗中施用至患者。
[0272]
根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至20mg/kg(例如0.1-15mg/kg)的抗体是用于向患者施用的初始候选剂量，例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注来施用。根据上文提到的因素，典型的每日剂量范围可为约1μg/kg到100mg/kg或更高。对于数天或更长时间内的重复施用，取决于病症，持续治疗直至出现对疾病症状的所需抑制为止。然而，其他剂量方案可以是有用的。容易通过常规技术和测定来监测此疗法的进展。示例性给药方案是wo 94/04188中披露的给药方案。
[0273]
术语“抑制”在本文与“改善”和“减轻”用于相同语境中，意指减轻疾病的一种或多种特征。
[0274]
抗体组合物将以符合良好医学实践的方式来配制、给药和施用。在此情况下考虑的因素包括所治疗的特定障碍、所治疗的特定哺乳动物、单独患者的临床状况、病因、药剂的递送部位、施用方法、施用时间表以及执业医师已知的其他因素。待施用的抗体的“治疗有效量”将由此类考虑因素决定，并且是预防、改善或治疗与cd40表达相关联的障碍所必需
的最小量。
[0275]
抗体不必，但任选地用一种或多种目前用于预防或治疗讨论中的障碍的药剂来配制。此类其他药剂的有效量取决于配制品中存在的人源化抗cd40抗体的量、障碍或治疗的类型以及上文讨论的其他因素。这些药剂通常以与上文所用相同的剂量和施用途径来使用，或者以此前所用剂量的约1％至99％来使用。
[0276]
cd40相关障碍
[0277]
抗cd40抗体或药剂可用于治疗或预防表达cd40的癌症或特征在于cd40表达、例如特征在于免疫细胞(例如淋巴细胞或树突细胞)的不适当活化的免疫障碍。这种cd40表达可以归因于例如细胞表面上增加的cd40蛋白水平和/或表达的cd40的改变的抗原性。根据本文所述的方法，免疫障碍的治疗或预防是通过向需要这种治疗或预防的受试者施用有效量的抗cd40抗体或药剂来实现，由此所述抗体(i)与表达cd40并与疾病状态相关联的活化的免疫细胞结合，并且(ii)对活化的免疫细胞产生细胞毒性、细胞抑制或免疫抑制作用。
[0278]
特征在于免疫细胞的不适当活化并可以通过本文描述的方法治疗或预防的免疫疾病可以例如根据所述障碍的潜在的一种或多种超敏反应的一种或多种类型来分类。这些反应通常分为四种类型：过敏反应、细胞毒性(细胞溶解)反应、免疫复合物反应或细胞介导的免疫(cmi)反应(也称为延迟型超敏(dth)反应)。(参见例如，fundamental immunology(william e.paul编辑,raven press,纽约,第3版1993)。)
[0279]
此类免疫疾病的具体例子包括以下：类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、自身免疫性脱髓鞘疾病(例如多发性硬化症、变应性脑脊髓炎)、内分泌性眼病、葡萄膜视网膜炎、全身性红斑狼疮、重症肌无力、格雷夫斯病、肾小球性肾炎、自身免疫性肝病、炎性肠病(例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)、过敏症、过敏反应、舍格伦综合征、i型糖尿病、原发性胆汁性肝硬化、韦格纳氏肉芽肿病、纤维肌痛、多肌炎、皮肌炎、炎性肌炎、多发性内分泌衰竭、施密特氏综合症(schmidt's syndrome)、自身免疫性葡萄膜炎、阿迪森氏病、肾上腺炎、甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、恶性贫血、胃萎缩、慢性肝炎、狼疮性肝炎、动脉粥样硬化、亚急性皮肤性红斑狼疮、甲状旁腺机能减退、德雷斯勒综合征(dressler's syndrome)、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、寻常性天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、斑秃(alopecia arcata)、类天疱疮、硬皮病、进行性全身性硬化症、crest综合征(钙质沉着、雷诺氏现象(raynaud's phenomenon)、食管活动不良、指端硬化和毛细管扩张)、男性和女性自身免疫性不育症、强直性脊柱炎(ankylosing spondolytis)、溃疡性结肠炎、混合性结缔组织病、结节性多动脉炎、系统性坏死性血管炎、特应性皮炎、特应性鼻炎、古德帕斯彻氏综合症(goodpasture's syndrome)、恰加斯氏病(chagas'disease)、结节病、风湿热、哮喘、复发性流产、抗磷脂综合征、农民尘肺、多形性红斑、心脏切开术后综合征、库欣综合征(cushing's syndrome)、自身免疫性慢性活动性肝炎、养鸟迷的肺、中毒性表皮坏死松解症、阿尔波特综合征(alport's syndrome)、肺泡炎、过敏性肺泡炎、纤维性肺泡炎、间质性肺病、结节性红斑、坏疽性脓皮病、输血反应、高安氏动脉炎(takayasu's arteritis)、风湿性多肌痛、颞动脉炎、血吸虫病、巨细胞动脉炎、蛔虫病、曲霉病、桑普特氏综合症(sampter's syndrome)、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿、贝塞特氏病(behcet's disease)、卡普兰氏综合症(caplan's syndrome)、川崎氏病(kawasaki's disease)、登革热、脑脊髓炎、心内膜炎、心肌内膜纤维变性、眼内炎、持久隆起性红斑、牛皮
癣、胎儿成红细胞增多病、嗜酸性筋膜炎、舒尔曼综合症(shulman's syndrome)、费耳蒂氏综合征(felty's syndrome)、丝虫病、睫状体炎、慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、福氏睫状体炎(fuch's cyclitis)、iga肾病、亨-舍二氏紫癜(henoch-schonlein purpura)、移植物抗宿主病、移植排斥反应、心肌症、伊顿-兰伯特综合征(eaton-lambert syndrome)、复发性多发性软骨炎、冷球蛋白血症、瓦尔登斯特罗姆巨球蛋白血症、埃文氏综合征(evan's syndrome)、急性呼吸窘迫综合征、肺部炎症、骨质疏松症、迟发型超敏反应和自身免疫性腺衰竭。
[0280]
因此，本文描述的方法包括治疗b淋巴细胞(例如全身性红斑狼疮、古德帕斯彻氏综合症、类风湿性关节炎和i型糖尿病)、th1淋巴细胞(例如类风湿性关节炎、多发性硬化症、牛皮癣、舍格伦综合征、桥本氏病、格雷夫氏病、原发性胆汁性肝硬化、韦格纳肉芽肿病、结核病或移植物抗宿主病)或th2淋巴细胞(例如特应性皮炎、全身性红斑狼疮、特应性哮喘、鼻结膜炎、过敏性鼻炎、欧门氏综合征(omenn's syndrome)、系统性硬化症或慢性移植物抗宿主病)的障碍。通常，涉及树突细胞的障碍包括th1淋巴细胞或th2淋巴细胞的障碍。
[0281]
类风湿关节炎(ra)是最常见的炎性自身免疫性疾病之一，影响人口的约1％。尽管可获得有效治疗(例如mtx和抗tnf剂)，但仍存在巨大的未满足的医疗需求，尤其是对于那些对抗tnf疗法反应不足的患者(约30％的患者)。此外，多达50％的患者在5年内中断tnf拮抗剂治疗，这主要是由于不良事件，而且还因为越来越多经验证数量的患者失去治疗益处。因此，重要的是，建立靶向ra中的炎症和关节破坏但不仅仅依赖于对tnf的直接抑制的有效疗法。非常有吸引力的方法是靶向共刺激细胞途径。共刺激中关键性受体-配体对之一是cd40/cd40l。此系统允许免疫细胞之间以及免疫细胞与非免疫细胞之间的相互作用，所有这些相互作用在ra的发病机理中都很重要。用本发明的拮抗性抗体阻断cd40可能在ra中具有以下一种或多种作用：
[0282]
1)抑制b细胞分化和抗体同种型转换；
[0283]
2)抑制t细胞和巨噬细胞中细胞因子和趋化因子产生以及粘附分子上调；
[0284]
3)抑制树突细胞的活化，以及
[0285]
4)抑制促炎性细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶、前列腺素的产生，并下调非免疫细胞(例如上皮细胞、内皮细胞和间充质细胞)中的黏附分子。
[0286]
本文明确考虑了实现一种或多种以上作用的方法。除ra外，本发明的组合物在全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、多发性硬化、牛皮癣(包括牛皮癣性关节炎)、青少年类风湿性关节炎、炎性肠病、全身性红斑狼疮和实体器官移植的治疗方法中将特别有用。
[0287]
类风湿关节炎(ra)是一种慢性全身性自身免疫性疾病，其成人患病率为约1％。所述疾病仍然导致高发病率和过早死亡(死亡主要是由于心血管疾病加速引起的)。现已确定，关节损伤发生在病程的极早期，多达30％的患者在诊断时显示出骨侵蚀的影像学证据，在一年后增加到60％。当前指南建议，在建立明确诊断后的3个月内，使用传统的改善病情的抗风湿药(dmard)开始治疗。dmard具有减少或预防关节损伤并保护关节功能的潜力。目前，风湿病学家选择甲氨蝶呤(mtx)作为大多数患者的初始dmard疗法。
[0288]
tnf拮抗剂依那西普英夫利昔单抗阿达木单抗ctla4拮抗剂阿巴西普抗il-6受体mab托珠单抗和抗cd20 mab利妥昔单抗在ra的治疗中有效。当前指南通常建议，在对传统dmard的反应不
足后，使用生物dmard治疗活动性ra。
[0289]
近期对未曾接受mtx治疗的患有早期侵袭性ra的患者进行的研究表明，mtx与tnf拮抗剂的组合优于作为单一疗法使用时的每种药剂。最惊人的结果是组合疗法的显著放射学益处。因此，mtx和tnf抑制剂的组合应用于处于侵袭性疾病和侵袭性表型的最大风险(例如高活动性评分、功能损害、类风湿因子(rf)或抗环瓜氨酸肽抗体(ccp)的血清阳性、crp升高、放射影像学侵蚀)下的患者。但是，预期在临床实践中很少将tnf拮抗剂用作一线疗法。美国风湿病学家在2005年4月进行的一项调查显示，对使用tnf拮抗剂的决定影响最大的因素是：mtx或多种dmard的失效、医生的整体评估、功能损伤以及放射影像学恶化或侵蚀。目前，在美国，估计有20％患有ra的患者接受tnf抑制剂治疗。
[0290]
由于药物不耐受和毒性或缺少反应，包括生物疗法在内的当前治疗对大部分ra患者的帮助不足。多达50％的患者在5年内中断tnf拮抗剂治疗，这主要是由于不良事件，而且还因为越来越多已知数量的患者失去其反应。
[0291]
在一些实施方案中，免疫障碍是t细胞介导的免疫障碍，例如如下t细胞障碍：其中与所述障碍相关联的活化的t细胞表达cd40。可以施用抗cd40抗体或药剂来消耗此类表达cd40的活化的t细胞。在特定实施方案中，施用抗cd40抗体或药剂可以消耗表达cd40的活化的t细胞，而静息t细胞基本上没有被抗cd40或药剂消耗。在本文中，“基本上没有消耗”是指少于约60％、或少于约70％、或少于约80％的静息t细胞没有被消耗。
[0292]
如本文所述的抗cd40抗体和药剂也可用于治疗或预防表达cd40的癌症。根据本文所述的方法，表达cd40的癌症的治疗或预防是通过向需要这种治疗或预防的受试者施用有效量的抗cd40抗体或药剂来实现，其中所述抗体或药剂(i)与表达cd40的癌细胞结合，并且(ii)发挥细胞毒性或细胞抑制作用，以消耗或抑制表达cd40的癌细胞的增殖。
[0293]
可以通过本文描述的方法治疗或预防的表达cd40的癌症包括例如白血病，例如急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(例如成髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞性或红血球性白血病)、慢性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病或慢性淋巴细胞性白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤(例如霍奇金氏病或非霍奇金氏病)；多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特罗姆巨球蛋白血症；重链疾病；实体瘤，例如肉瘤和癌瘤(例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内膜肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、鼻咽癌或食管癌)。
[0294]
药物组合物及其施用
[0295]
可以将包含cd40结合剂(例如抗cd40抗体)的组合物施用于患有免疫障碍或表达cd40的癌症或处于患有所述疾病的风险下的受试者。本发明进一步提供了cd40结合剂(例如抗cd40抗体)在制备用于预防或治疗表达cd40的癌症或免疫障碍的药物中的用途。如本文所用的术语“受试者”是指可以对其施用cd40结合剂的任何哺乳动物患者，包括例如人类
和非人类哺乳动物，例如灵长类动物、啮齿类动物和狗。明确意图用于使用本文所述的方法进行治疗的受试者包括人类。在免疫障碍或表达cd40的癌症的预防或治疗中，抗体或药剂可以单独或与其他组合物组合施用。
[0296]
用于此类药物组合物中的优选抗体是包含人源化抗体或抗体片段的那些，所述人源化抗体或抗体片段具有以下任一者的重链可变区氨基酸序列：seq id no:1至4、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39或seq id no:40。
[0297]
一些实施方案包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码抗体或抗体片段的序列，所述抗体或抗体片段具有轻链可变结构域氨基酸序列seq id no:26、seq id no:31或seq id no:36。特别优选的人源化抗体组合物包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段具有含有以下的氨基酸序列的重链可变结构域和轻链可变区：分别为seq id no:27和seq id no:26；分别为seq id no:28和seq id no:26；分别为seq id no:29和seq id no:26；分别为seq id no:30和seq id no:26；分别为seq id no:32和seq id no:31；分别为seq id no:33和seq id no:31；分别为seq id no:34和seq id no:31；分别为seq id no:35和seq id no:31；分别为seq id no:37和seq id no:36；分别为seq id no:38和seq id no:36；分别为seq id no:39和seq id no:36；分别为seq id no:40和seq id no:36。在本发明中考虑了编码以下重链序列中的任一者的分离的多核苷酸：seq id no:1至4、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id no:53、seq id no:57、seq id no:58、seq id no:59、seq id no:60、seq id no:61、seq id no:62、seq id no:63、seq id no:64、seq id no:65、seq id no:66、seq id no:67、seq id no:68、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72或seq id no:73。其他实施方案涉及编码以下序列中任一者的轻链序列的分离的核酸：seq id no:5至seq id no:8、seq id no:26、seq id no:31、seq id no:36、seq id no:41、seq id no:43、seq id no:45、seq id no:47、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:51、seq id no:52、seq id no:54、seq id no:55、seq id no:56、seq id no:74、seq id no:75或seq id no:76。
[0298]
在某些实施方案中，在考虑ra的治疗的情况下，本发明的组合物可以用于在患有中度至重度活动性ra且对单独mtx没有足够反应的患者中减轻体征和症状、诱导主要临床反应并减少结构损伤进展的方法中。当前的示例性的这种疗法是：enbrel/humira(在两个不同的患者群体中获得使用humira和enbrel的数据)。本发明的组合物可以代替enbrel/humira疗法或与enbrel/humira疗法组合用于对单独mtx没有反应的受试者。优选地，在此类实施方案中，在对甲氨蝶呤没有足够反应的患者中，本发明的组合物将具有优于enbrel+mtx的功效，如例如通过以下方式确定：化合物+mtx在6个月的acr20>85％(gs：enbrel+mtx 71％对比安慰剂+mtx 27％，humira+mtx在12个月时59％对比安慰剂+mtx 24％)*。本发明的组合物的优异功效的其他标准可以包括：在一年时间段内对结构损伤的进展的抑制与enbrel类似(52周后，平均改良夏普评分(sharp score)humira+mtx 0.1对比安慰剂+mtx 2.7)*。在仍其他实施方案中，在对甲氨蝶呤的反应不足的患者中，所述组合物产生的“主要临床反应”优于enbrel，如通过acr70测量的(humira+mtx为20％，安慰剂+mtx为4％)*。
[0299]
在其他实施方案中，本发明的组合物可以被指示用于在患有中度至重度活动性ra且对抗tnf剂的反应不足的患者中减轻体征和症状、诱导主要临床反应并减少结构损伤进展。当前的黄金标准：非抗tnf生物疗法。优选地，在此类受试者中，通过在对抗tnf剂的反应不足的患者中的历史比较，本发明的组合物具有不弱于非抗tnf生物剂(例如orencia、rituxan)的功效：化合物加dmard在6个月时的acr20>50％(gs：orencia+dmard50％对比安慰剂+dmard 20％)。在仍其他实施方案中，通过对关节侵蚀和关节间隙变窄进行公认x射线评分方法评估，本发明的组合物在一年时间段内抑制结构损伤的进展，与rituxan类似(52周后，平均改良夏普评分rituxan+mtx 1.0对比安慰剂+mtx 2.31)。
[0300]
各种递送系统是已知的并且可以用于施用cd40结合剂。引入方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。cd40结合剂可以例如通过输注、团注或注射施用，并且可以与其他生物活性剂例如化学治疗剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。在优选的实施方案中，施用是通过皮下注射进行的。可以在例如预填充注射器中制备用于此类注射的配制品，其可以每隔一周施用一次。
[0301]
将确定本发明的抗体的安全性特征，并且所述安全性特征优选地包括一种或多种特征，例如：与通常用于治疗类风湿性关节炎的其他药物(例如dmard、类固醇、nsaid)没有临床上显著的不良相互作用；与enbrel相比，没有更大的由于安全性或耐受性问题引起的中断率；严重感染率不大于抗tnf剂或其他常用生物药剂；注射部位反应或输注反应的频率和/或严重性与enbrel类似；在疗法的重复循环后没有或极少出现耐药性(小于5％)；没有或极少中和抗体；没有可能导致体内血栓栓塞事件的增强的血小板聚集/活化或可能导致出血的血小板/内皮功能障碍的证据。
[0302]
在特定实施方案中，通过注射、借助导管、借助栓剂或借助植入物来施用cd40结合剂组合物，所述植入物为多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜(例如硅橡胶膜)或纤维。通常，当施用组合物时，使用不吸收抗cd40抗体或药剂的材料。
[0303]
在其他实施方案中，抗cd40抗体或药剂在控释系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见例如，langer,1990,science 249:1527-1533；sefton,1989,crc crit.ref.biomed.eng.14:201；buchwald等人,1980,surgery 88:507；saudek等人,1989,n.engl.j.med.321:574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料。(参见例如，medical applications of controlled release(langer和wise编辑,crc press,波卡拉顿,佛罗里达州,1974)；controlled drug bioavailability,drug product design and performance(smolen和ball编辑,wiley,纽约,1984)；ranger和peppas,1983,macromol.sci.rev.macromol.chem.23:61。还参见levy等人,1985,science 228:190；during等人,1989,ann.neurol.25:351；howard等人,1989,j.neurosurg.71:105。)其他控释系统例如在langer(同上)中讨论。
[0304]
cd40结合剂(例如抗cd40抗体)可以作为药物组合物施用，所述药物组合物包含治疗有效量的所述结合剂和一种或多种药学上相容的成分。
[0305]
在典型的实施方案中，根据常规程序将药物组合物配制成适于静脉内或皮下施用于人类的药物组合物。通常，用于注射施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，药物组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂(例如利多卡因)以减轻注射部位的疼痛。通常，将成分单独或混合在一起以单位剂型来供应，例如作为干燥冻干粉末或无水浓缩
物在指示活性剂的量的密闭容器例如安瓿或小药囊中。在将通过输注施用药物时，可以用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶分配所述药物。在通过注射施用药物时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，以便可以在施用之前将成分混合。
[0306]
此外，可以将药物组合物作为药物试剂盒提供，所述试剂盒包括(a)含有冻干形式的cd40结合剂(例如抗cd40抗体)的容器和(b)含有药学上可接受的注射用稀释剂(例如无菌水)的第二容器。药学上可接受的稀释剂可以用于重构或稀释冻干抗cd40抗体或药剂。按照管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通告可以任选地与这样一个或多个容器相关联，所述通告反映所述机构批准制造、使用或销售用于人类施用。
[0307]
可以通过标准临床技术确定在免疫障碍或表达cd40的癌症的治疗或预防中有效的cd40结合剂(例如，抗cd40抗体)的量。另外，可任选地采用体外测定以帮助鉴定最佳剂量范围。待用于配制品中的确切剂量还将取决于施用途径以及免疫障碍或表达cd40的癌症的阶段，并且应当根据从业医师的判断和每名患者的情况来决定。可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推有效剂量。
[0308]
例如，抗cd40抗体或药剂的毒性和治疗功效可以在细胞培养或实验动物中通过用于确定ed
50
(在50％群体中治疗有效的剂量)的标准药物程序确定。表现出大治疗指数的cd40结合剂(例如抗cd40抗体)是优选的。在cd40结合剂表现出毒性副作用的情况下，可以使用将cd40结合剂靶向受影响组织部位的递送系统来使不表达cd40的细胞的潜在损害最小化，从而减少副作用。
[0309]
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。cd40结合剂的剂量通常处于包括ed
50
的循环浓度范围内，毒性很小或没有毒性。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的施用途径而在这个范围内变化。对于所述方法中使用的任何cd40结合剂，治疗有效剂量可首先根据细胞培养测定来估算。可以在动物模型中配制剂量，以达到包括如在细胞培养中确定的ic
50
(即，测试化合物达到对症状的半最大抑制的浓度)在内的循环血浆浓度范围。这种信息可以用于更准确地确定人中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱法、elisa等来测量血浆中的水平。
[0310]
通常，向患有免疫障碍或表达cd40的癌症的患者施用的抗cd40抗体或cd40结合剂的剂量通常为约0.1mg/kg至约100mg/kg受试者体重。向受试者施用的剂量为约0.1mg/kg至约50mg/kg、约1mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约15mg/kg或约1mg/kg至约10mg/kg受试者体重。
[0311]
示例性剂量包括但不限于1ng/kg至100mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、约14mg/kg、约15mg/kg或约16mg/kg。剂量可以例如每天一次、每周一次(每周)、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、每两周一次或每月一次、每两个月一次或每三个月一次施用。在特定实施方案中，剂量为约0.5mg/kg/周、约1mg/kg/周、约2mg/kg/周、约3mg/kg/周、约4mg/kg/周、约5mg/kg/周、约6mg/kg/周、约7mg/kg/周、约8mg/kg/周、约9mg/kg/周、约10mg/kg/周、约11mg/kg/周、约12mg/kg/周、约13mg/kg/周、约14mg/kg/周、约15mg/kg/周或约16mg/kg/周。在一些实施方案中，剂量范围为约1mg/kg/周至约15mg/kg/周。
[0312]
在一些实施方案中，包含cd40结合剂的药物组合物可进一步包含与结合剂缀合或
未缀合的治疗剂。可以将抗cd40抗体或cd40结合剂与用于治疗或预防免疫障碍或表达cd40的癌症的一种或多种治疗剂组合共施用。例如，组合疗法可包括细胞抑制剂、细胞毒性剂或免疫抑制剂。组合疗法还可包括例如施用靶向活化的淋巴细胞、树突细胞或表达cd40的癌细胞表面上除cd40以外的受体或受体复合物的药剂。这种药剂的例子包括第二非cd40抗体，所述抗体与活化的淋巴细胞、树突细胞或表达cd40的癌细胞表面的分子结合。另一个例子包括靶向这种受体或受体复合物的配体。通常，这种抗体或配体与活化的淋巴细胞、树突细胞或表达cd40的癌细胞上的细胞表面受体结合，并通过向活化的淋巴细胞、树突细胞或表达cd40的癌细胞递送细胞抑制或细胞毒性信号来增强抗cd40抗体的细胞毒性或细胞抑制作用。
[0313]
这种组合疗法的施用可以对疾病参数(例如症状的严重程度、症状的数量或复发的频率)产生累加或协同作用。
[0314]
关于组合施用的治疗方案，在一个特定实施方案中，将抗cd40抗体或cd40结合剂与治疗剂同时施用。在另一个特定实施方案中，在施用抗cd40抗体或cd40结合剂之前或之后，在施用抗cd40抗体或cd40结合剂之前或之后至少一小时至长达数月，例如至少一小时、五小时、12小时、一天、一周、一个月或三个月，施用所述治疗剂。
[0315]
有用的细胞毒性或免疫抑制剂类别包括例如抗微管蛋白剂、瑞奥斯他汀(例如mmae或mmaf)、dna小沟结合剂、dna复制抑制剂、烷基化剂(例如铂络合物，例如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物和卡铂)、蒽环类药物、抗生素、抗叶酸药、抗代谢物、化学疗法增敏剂、倍癌霉素、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、莱西托辛(lexitropsin)、亚硝基脲、顺氯氨铂、预成型化合物、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、辐射增敏剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。
[0316]
单独的细胞毒性或免疫抑制剂包括例如雄激素、安曲霉素(amc)、天冬酰胺酶、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、白消安、丁硫氨酸亚砜、喜树碱、卡铂、卡莫司汀(bsnu)、cc-1065、苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞苷阿拉伯糖苷、细胞松弛素b、达卡巴嗪、放线菌素d(以前的放线菌素)、柔红霉素、脱卡巴嗪、多西他赛、多柔比星、雌激素、5-氟脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、短杆菌肽d、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀(ccnu)、氮芥、美法仑、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素c、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、普卡霉素、甲基苄肼、链脲佐菌素、替诺泊苷、6-硫代鸟嘌呤、硫代tepa、拓扑替康、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、vp-16和vm-26。
[0317]
在一些典型的实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂。合适的细胞毒性剂包括例如尾海兔素(例如瑞奥斯他汀e、afp、mmaf、mmae、aeb或aevb)、dna小沟结合剂(例如烯二炔和莱西托辛)、倍癌霉素、紫杉烷(例如紫杉醇和多西他赛)、嘌呤霉素、长春花生物碱、cc-1065、sn-38、托泊替康、吗啉代多柔比星、根瘤菌素、氰基吗啉代多柔比星、棘轮霉素、康普瑞汀、纺锤菌素、埃博霉素a和b、雌莫司汀、隐藻菌素(cryptophysin)、西美多汀(cemadotin)、类美登素、圆皮海绵内酯、五加素或米托蒽醌。
[0318]
在一些实施方案中，细胞毒性剂是常规化疗剂，诸如例如多柔比星、紫杉醇、美法仑、长春花生物碱、甲氨蝶呤、丝裂霉素c或依托泊苷。另外，有效药剂诸如cc-1065类似物、加利车霉素、美登素、尾海兔素10类似物、根霉菌素和水螅毒素可以连接至抗cd40抗体或其药剂。
[0319]
在特定实施方案中，细胞毒性剂或细胞抑制剂是瑞奥斯他汀e(本领域中也称为尾海兔素-10)或其衍生物。通常，瑞奥斯他汀e衍生物是例如瑞奥斯他汀e与酮酸之间形成的酯。例如，瑞奥斯他汀e可以与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应以分别产生aeb和aevb。其他典型瑞奥斯他汀衍生物包括afp、mmaf和mmae。瑞奥斯他汀e及其衍生物的合成和结构描述于例如美国专利申请公开号2004-0157782 a1和2005-0238649；以及国际专利申请号pct/us03/24209、国际专利申请号pct/us02/13435和美国专利号6,884,869；6,323,315；6,239,104；6,034,065；5,780,588；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444；以及4,486,414；所述申请的公开内容以引用方式并入本文。
[0320]
在特定实施方案中，细胞毒性剂是dna小沟结合剂。(参见例如，美国专利号6,130,237。)例如，在一些实施方案中，小沟结合剂是cbi化合物。在其他实施方案中，小沟结合剂是烯二炔(例如加利车霉素)。
[0321]
抗微管蛋白剂的例子包括但不限于紫杉烷(例如，(紫杉醇)、(多西他赛))、t67(tularik)、长春花生物碱(例如长春新碱、长春花碱、长春地辛和长春瑞滨)和尾海兔素(例如，瑞奥斯他汀e、afp、mmaf、mmae、aeb、aevb)。其他抗微管蛋白剂包括例如浆果赤霉素衍生物、紫杉烷类似物(例如埃博霉素a和b)、诺考达唑、秋水仙碱和秋水仙胺、雌莫司汀、隐藻菌素、西美多汀、类美登素、康普瑞汀、圆皮海绵内酯和五加素。
[0322]
在一些实施方案中，细胞毒性剂是另一类抗微管蛋白剂类美登素。例如，在特定的实施方案中，类美登素是美登素或dm-1(immunogen,inc.；还参见chari等人,1992,cancer res.52:127-131)。
[0323]
在一些实施方案中，治疗剂不是放射性同位素。
[0324]
在一些实施方案中，细胞毒性剂或免疫抑制剂是抗代谢物。抗代谢物可以是例如嘌呤拮抗剂(例如，咪唑硫嘌呤或霉酚酸酯)、二氢叶酸还原酶抑制剂(例如，甲氨蝶呤)、阿昔洛韦、冈昔洛韦、齐多夫定、阿糖腺苷(vidarabine)、三唑核苷(ribavarin)、叠氮胸苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、金刚烷胺、二脱氧尿苷、碘脱氧尿苷、膦甲酸钠(poscamet)或三氟尿苷。
[0325]
在其他实施方案中，细胞毒性剂或免疫抑制剂是他克莫司、环孢霉素或雷帕霉素。在其他实施方案中，细胞毒性剂是阿地白介素、阿仑单抗、阿利维a酸、别嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、三氧化二砷、贝沙罗汀、贝沙罗汀、卡普睾酮、卡培他滨、塞来昔布、克拉屈滨、阿法达贝汀、地尼白介素-白喉连接物、右丙亚胺、丙酸屈他雄酮、表柔比星、阿法依泊汀、雌莫司汀、依西美坦、非格司亭、氟尿苷、氟达拉滨、氟维司群、吉西他滨、吉妥珠单抗奥沙米星(gemtuzumab ozogamicin)、戈舍瑞林、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、干扰素α2a、伊立替康、来曲唑、亚叶酸、左旋咪唑、氮芥(meclorethamine)或氮芥(nitrogen mustard)、甲地孕酮、美司那、甲氨蝶呤、甲氧沙林、丝裂霉素c、米托坦、苯丙酸诺龙、奥普瑞白介素、奥沙利铂、帕米膦酸、培加酶、培门冬酶、乙二醇化非格司亭、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、卟吩姆钠、甲基苄肼、喹吖因、拉布立酶、雷利度胺、沙格司亭、链脲佐菌素、它莫西芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维甲酸、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨和唑来膦酸钠。
[0326]
在另外的实施方案中，药物是人源化抗her2单克隆抗体；rituxan(利妥昔单抗；
genentech,inc.，南旧金山，加利福尼亚州)；嵌合抗cd20单克隆抗体)；ovarex(altarex corporation，马萨诸塞州)；panorex(glaxo wellcome，北卡罗来纳州；鼠类igg2a抗体)；西妥昔单抗爱必妥(imclone systems inc.，纽约州；抗egfr igg嵌合抗体)；vitaxin(medimmune,inc.，马里兰州)；campath i/h(leukosite，马萨诸塞州；人源化igg1抗体)；smart mi95(protein design labs,inc.，加利福尼亚州；人源化抗cd33 igg抗体)；lymphocide(immunomedics,inc.，新泽西州；人源化抗cd22 igg抗体)；smart id10(protein design labs,inc.，加利福尼亚州；人源化抗hla-dr抗体)；oncolym(techniclone,inc.，加利福尼亚州；放射性标记的鼠类抗hla-dr10抗体)；allomune(biotransplant，加利福尼亚州；人源化抗cd2 mab)；avastin(genentech,inc.，加利福尼亚州；抗vegf人源化抗体)；依帕珠单抗(epratuzamab)(immunomedics,inc.，新泽西州和amgen，加利福尼亚州；抗cd22抗体)；以及ceacide(immunomedics，新泽西州；人源化抗cea抗体)。
[0327]
其他合适的抗体包括但不限于针对以下抗原的抗体：ca125、ca15-3、ca19-9、l6、lewis y、lewis x、甲胎蛋白、ca 242、胎盘碱性磷酸酶、前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶、表皮生长因子、mage-1、mage-2、mage-3、mage-4、抗运铁蛋白受体、p97、muc1-klh、cea、gp100、mart1、前列腺特异性抗原、il-2受体、cd20、cd52、cd33、cd22、人绒毛膜促性腺激素、cd38、粘蛋白、p21、mpg和neu癌基因产物。
[0328]
在一些实施方案中，治疗剂是免疫抑制剂。免疫抑制剂可以是例如更昔洛韦、依那西普、他克莫司、环孢霉素、雷帕霉素、环磷酰胺、咪唑硫嘌呤、霉酚酸酯或甲氨蝶呤。可替代地，所述免疫抑制剂可以是例如糖皮质激素(例如皮质醇或醛固酮)或糖皮质激素类似物(例如泼尼松或地塞米松)。
[0329]
合适的环氧合酶抑制剂包括甲氯芬那酸、甲芬那酸、卡洛芬、双氯芬酸、二氟尼柳、苯布芬、非诺洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、萘丁美酮、萘普生、舒林酸、替诺昔康、托美汀和乙酰水杨酸。
[0330]
合适的脂氧合酶抑制剂包括氧化还原抑制剂(例如邻苯二酚丁烷衍生物、去甲二氢愈创木酸(ndga)、马索罗酚、菲尼酮、伊纳帕兰(ianpalen)、吲唑啉酮、萘甲酮(naphazatrom)、苯并呋喃醇、烷基羟胺)和非氧化还原抑制剂(例如羟基噻唑、甲氧基烷基噻唑、苯并吡喃及其衍生物、甲氧基四氢吡喃、乳香脂酸和乳香脂酸的乙酰化衍生物、以及被环烷基取代的喹啉甲氧基苯基乙酸)和氧化还原抑制剂的前体。
[0331]
其他合适的脂氧合酶抑制剂包括抗氧化剂(例如酚、没食子酸丙酯、类黄酮和/或含有类黄酮的天然底物、黄酮的羟基化衍生物、黄酮醇、二氢槲皮素、木犀草素、高良姜精、奥洛波尔(orobol)、查尔酮的衍生物、4,2',4'-三羟基查耳酮、邻氨基酚、n-羟基脲、苯并呋喃醇、依布硒啉和增加还原性含硒酶活性的物质)、铁螯合剂(例如异羟肟酸及其衍生物、n-羟基脲、2-苄基-1-萘酚、邻苯二酚、羟胺、鼠尾草酚奎诺二甲基丙烯酸酯c(carnosol trolox c)、邻苯二酚、萘酚、柳氮磺吡啶、齐留通(zyleuton)、5-羟基邻氨基苯甲酸和4-(ω-芳基烷基)苯基链烷酸)、含有咪唑的化合物(例如酮康唑和伊曲康唑)、吩噻嗪和苯并吡喃衍生物。
[0332]
其他合适的脂氧合酶抑制剂包括以下各项的抑制剂：类二十烷酸(例如十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳六烯酸和二十二碳六烯酸及其酯、pge1(前列
腺素e1)、pga2(前列腺素a2)、维前列醇、15-单羟基二十碳四烯酸、15-单羟基二十碳三烯酸、15-单羟基二十碳五烯酸和白三烯b5、c5和d5)、干扰钙流动的化合物、吩噻嗪、二苯丁胺、维拉帕米、岩藻糖苷、姜黄素、绿原酸、咖啡酸、5,8,11,14-二十碳四烯酸(etya)、羟苯基视黄酰胺、lonapalen、七叶树素、二乙基乙胺嗪、邻二氮菲、黄芩黄素、普昔罗米、硫醚、二烯丙基硫化物和二-(1-丙烯基)硫化物。
[0333]
白三烯受体拮抗剂包括骨化三醇、昂唑司特、bayer bay-x-1005、ciba-geigy cgs-25019c、依布硒啉、leo denmark eth-615、lilly ly-293111、ono ono-4057、terumo tmk-688、boehringer ingleheim bi-rm-270、lilly ly 213024、lilly ly 264086、lilly ly 292728、ono ono lb457、pfizer 105696、perdue frederick pf 10042、rhone-poulenc rorer rp66153、smithkline beecham sb-201146、smithkline beecham sb-201993、smithkline beecham sb-209247、searle sc-53228、sumitamo sm 15178、american home products way 121006、bayer bay-o-8276、warner-lambert ci-987、warner-lambert ci-987bpc-15ly 223982、lilly ly 233569、lilly ly-255283、macronex mnx-160、merck and co.mk-591、merck and co.mk-886、ono ono-lb-448、purdue frederick pf-5901、rhone-poulenc rorer rg 14893、rhone-poulenc rorer rp 66364、rhone-poulenc rorer rp 69698、shionoogi s-2474、searle sc-41930、searle sc-50505、searle sc-51146、searle sc-52798、smithkline beecham sk和f-104493、leo denmark sr-2566、tanabe t-757和teijin tei-1338。
[0334]
制品
[0335]
在另一方面，包括含有可用于治疗上文所述的障碍的材料的制品。制品包含容器和标签。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)形成。容器容纳有效于治疗病症的组合物，并且可以具有无菌进入口。例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。组合物中的活性剂是人源化抗cd40抗体。容器上或与容器相连的标签表明所述组合物用于治疗所选病症。所述制品可以进一步包括第二容器，所述第二容器包含药学上可接受的缓冲剂，例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其还可以包括从商业和用户角度来看所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书的包装插页。
[0336]
在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例并不意图限制本发明的范围。
[0337]
实施例
[0338]
实施例1：人源化抗cd40抗体的产生
[0339]
鼠类抗体20e2和2h11示出在以上表1和表2中。20e2和2h11克隆的人源化已完成。建立文库，其中人类和鼠类残基的变化方式使得在任何给定位置都可能存在人类或鼠类残基。针对人类种系与鼠类抗体之间不同的那些氨基酸建立这个文库。仅选择保留亲本鼠类抗体功能的克隆。
[0340]
以这种方式，抗体a、抗体b和抗体c是源自克隆到人类igg1-ko(ko＝敲除)/κ骨架中的小鼠抗体20e2(抗体a和抗体b)或2h11(抗体c)的人源化抗体。igg1-ko在fc区有两个突变leu234ala和leu235ala，以减少fcγr和补体结合。
[0341]
这种人源化的结果产生各种如下所示的人源化重链和轻链可变序列：
[0342]
seq id no:41(可变轻链序列)：divmtqspdslavslgervtmsckssqsllnsgnqknyltw
hqqkpgqppklliywtstresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqndytypltfgggtkveik
[0343]
seq id no:42(可变重链序列)：evqlvksggglvkpggslrlscaasgftfsdygmhwvrqapgkglewvayissgnriiyyadtvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtalyycarqdgyryamdywgqgtlvtvss
[0344]
seq id no:43(可变轻链序列)divmtqspdslavslgeratmsckssqsllnsgnqknyltwhqqkpgqppklliywtstresgvpdrfsgsgsgtgttltisslqaedvavyycqndytypltfgggtkveik
[0345]
seq id no:44(可变重链序列)evqlvesggglvkpggslrlscaasgftfsdygmhwvrqapgkglewvayissgnriiyyadtvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtalyycarqdgyryamdywaqgtlvtvss
[0346]
seq id no:45(可变轻链序列)divmtqspdslavslgekvtmnckssqsllnsgnqknyltwhqqkpgqppklliywtstresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqndytypltfgagtkveik
[0347]
seq id no:46(可变重链序列)evqlvesggglvkpggsrrlscaasgftfsdygmhwvrqapgkglewvayissgnriiyyadtvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtalyycarqdgyryamdywgywgqgtlvtvss。
[0348]
seq id no:47(可变轻链序列)divmtqspdslavslgervtmnckssqsllnsgnqknyltwhqqkpgqppklliywtstresgvpdrfsgsgsgtgttltisslqaedvavyycqndytypltfgggtkveik
[0349]
seq id no:48(可变重链序列)evqlvesggglvkpggslrlscaasgftfsdygmhwvrqapgkglewvayissgnriiyyadtvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtalyycarqdgyryamdywgqgtlvtvss
[0350]
seq id no:49(可变轻链序列)divmtqspdslavslgervtmnckssqsllnsgnqknyltwhqqkpgqppklliywtstresgvpdrfsgsgsgtgttltisslqaedvavyycqndytypltfgagtkveik
[0351]
seq id no:50(可变轻链序列)evqlvesggglvkpggsrrlscaasgftfsdygmhwvrqapgkglewvayissgnriiyyadtvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarqdgyryamdywgqgtlvtvss
[0352]
seq id no:51(可变轻链序列)divmtqspdslavslgekvtmnckssqsllnsgnqknyltwhqqkpgqppklliywtstresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedlavyycqndytypltfgagtkveik。
[0353]
seq id no:52(可变轻链序列)divmtqspdslavslgekvtinckssqsllnsgnqknyltwhqqkpgqppklliywtstresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqndytypltfgggtkveik
[0354]
seq id no:53(可变重链序列)evqlvesggglvkpggslrlscaasgftfsdygmhwvrqapgkglewvayissgnriiyyadtvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarqdgyryamdywgqgtlvtvss
[0355]
seq id no:54(可变轻链序列)qiqmtqspsslsasvgdrvtitcsasssvsymlwfqqkpgkapklwiystsnlasgvparfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqrtfypytfgggtkveik
[0356]
seq id no:55(可变轻链序列)diqmtqspsslsasvgdrvtitcsasssvsymlwfqqkpgkapklliystsnlasgvparfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqrtfypytfgggtkveik
[0357]
seq id no:56(可变轻链序列)diqmtqspsslsasvgdrvtitcsasssvsymlwfqqkpgkapklliystsnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqrtfypytfgggtkveik
[0358]
seq id no:57(可变重链序列)qvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgfnitdyyvhwvkqrpgqglewmgridpedgdskyapkfqgkatmtadtststvymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgtlvtvss。
[0359]
seq id no:58(可变重链序列)qvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgfnikdyyvhwvkqapgqglewmgridpedgdskyapkfqgkatmtadtststvymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgtlvtvss
[0360]
seq id no:59(可变重链序列)qvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgfnitdyyvhwvkqrpgqglewmgridpedgdskyapkfqgkvtmtadtststvymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgtlvtvss。
[0361]
seq id no:60(可变重链发现序列)qvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgfnikdyyvhwvkqapgqglewigridpedgdskyapkfqgkatmtadtststvymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgtlvtvss
[0362]
seq id no:61(可变重链序列)qvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgfnitdyyvhwvkqapgqglewmgridpedgdskyapkfqgkatmtadtststvymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgtlvtvss
[0363]
seq id no:62(可变重链序列)：qvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgfnitdyyvhwvkqrpgqglewmgridpedgdtkfapkfqgkatmtadtststvymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgtlvtvss
[0364]
seq id no:63(可变重链序列)qvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgfnitdyyvhwvkqrpgqglewmgridpedgdtkfapkfqgkvtmtadtststvymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgtlvtvss
[0365]
seq id no:64(可变重链序列)qvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgfnikdyyvhwvkqapgqglewigridpedgdtkfapkgqgkatmtadtststvymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgtlvtvss
[0366]
seq id no:65(可变重链序列)qvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgfnikdyyvhwvkqapgqglewmgridpedgdtkfapkfqgkatmtadtststvymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgtlvtvss
[0367]
seq id no:66(可变重链序列)qvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgfnitdyyvhwvkqapgqglewmgridpedgdtkfapkfqgkatmtadtststvymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgtlvtvss
[0368]
seq id no:67(可变重链序列)evqlvqsgaevkkpgatvkisckvsgfnikdyyihwvkqrpgkglewmgridpedgdtkydpkfqgrvtmtadtstdtaymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgttvtvss
[0369]
seq id no:68(可变重链序列)evqlvqsgaevkkpgatvkisctvsgfnikdyyihwvkqrpgkglewmgridpedgdtkydpkfqgrvtmtadtstdtaymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgttvtvss
[0370]
seq id no:69(可变重链序列)evqlvqsgaevkkpgatvkisctvsgfnikdyyihwvkqrpgkglewmgridpedgdtkydpkfqgkvtmtadtstdtaymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgttvtvss
[0371]
seq id no:70(可变重链序列)evqlvqsgaevkkpgatvkisctvsgfnikdyyihwvkqapgkglewmgridpedgdtkydpkfqgkatmtadtstdtaymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgttvtvss
[0372]
seq id no:71(可变重链序列)evqlvqsgaevkkpgatvkisctvsgfnikdyyihwvkqrpgkglewmgridpedgdtkydpkfqgkatmtadtstdtaymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgttvtvss
[0373]
seq id no:72(可变重链序列)evqlvqsgaevkkpgatvkisctvsgfnikdyyihwvkqapgkglewigridpedgdtkydpkfqgkatmtadtstdtaymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgttvtvss
[0374]
seq id no:73(可变重链序列)evqlvqsgaevkkpgatvkisckvsgfnikdyyihwvqqapgkglewmgridpedgdtkydpkfqgrvtmtadtstdtaymelsslrsedtavyycttsyyvgtygywgqgttvtvss
[0375]
来自抗体10f2hum的seq id no:74(可变轻链序列)1：diqmtqspsslsasvgdrvtitcsatssvsyilwfqqkpgkapklliystsnlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqrtfypytfgggtkveik
[0376]
来自抗体10f2hum的seq id no:75(可变轻链序列)2：diqmtqspsslsasvgdrvtitcsatssvsyilwfqqkpgkapklliystsnlasgvparfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqrtfypytfgggtkveik
[0377]
seq id no:76(可变轻链序列)qiqmtqspsslsasvgdrvtitcsatssvsyilwfqqkpgkapklwiystsnlasgvparfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqrtfypytfgggtkveik
[0378]
本发明的示例性人源化抗体是具有下表所列出的重链和轻链序列的那些抗体。下表中的加粗加下划线序列是可变结构域，而正常的未加下划线序列是恒定结构域：
[0379]
将可变区亚克隆到一种或两种不同的合适igg表达载体中：
[0380]
a)人类igg1-ko(敲除)/κ形式，其在fc区具有leu234ala、leu235ala双突变，以减少效应子功能，例如fcγr和补体结合
[0381]
b)人类igg4-dm(双重突变体)/κ形式，其在铰链区具有减少igg4半分子出现的ser228pro突变以及进一步减少fcγr结合的leu235glu突变
[0382]
纯化两种候选抗体a和抗体b并通过以下标准进行评估：-ccf外观(浊度)-ccf的过滤特性-关于rproteina的产量-洗脱和中和后的浊度-可溶性聚集物(sec)-纯度/污染模式(sds)-电荷模式(ief)
[0383]
实施例2：体外数据
[0384]
对抗体a、抗体b和抗体c以及基于公布的序列产生的抗体4d11(kirin/astellas)和pg-102(pangenetics)进行了表征。抗体a、抗体b、抗体c和4d11的数据如下所示。pg-102表现出激动活性以及对b细胞增殖的仅不完全抑制作用(未示出)。表2.2.汇总了获得的数据。在表2.2.之后对数据进行了更详细的描述。表2.2.抗体a、抗体b和抗体c以及kirin的4d11抗cd40抗体的体外数据汇总。
*si，刺激指数；**比率>1表示与人类相比与cyno的结合增加
[0385]
a.人源化抗体与细胞cd40和重组cd40蛋白的结合
[0386]
使用人类cd40转染的hek293细胞，通过流式细胞术分析人源化抗体与细胞cd40的特异性结合。观察到抗体a、抗体b和抗体c的浓度依赖性结合。所述抗体展示出相似的结合谱。本发明的抗体和kirin的抗体4d11的ec50值都在约1nm的相同范围内，由于转染细胞中cd40的高水平，所述值最有可能是所述测定的灵敏度极限。人源化抗体与人类ramos细胞上的细胞cd40的特异性结合也显示出浓度依赖性结合。抗体展示出略有不同的结合谱和在0.21-1.22nm之间的ec50值。在cd40阴性细胞诸如未转染的hek293细胞或t细胞系hsb-2上未检测到结合，因此证实了与cd40的选择性结合(数据未示出)。
[0387]
通过fortebio octet测量抗体a、抗体b和抗体c与人类cd40-fc蛋白结合的亲和力并且显示解离常数(k
d
)<100pm。由于抗体和cd40-fc的双价亲合力效应，使得无法准确确定100pm以下的kd。另外，在不存在和存在50％人类血清的情况下分析与cd40-fc的结合，并且未观察到血清对结合的显著影响(数据未示出)
[0388]
b.人源化抗体在b细胞活化/增殖测定中的活性
[0389]
在b细胞增殖测定中测试了人源化抗体的活性，其中在il-2和il-4存在下用重组cd40l刺激来自外周血的人类b细胞。抗体a、抗体b和抗体c显示出对b细胞增殖的有效抑制作用。与bi的抗体和kirin的抗体4d11的抑制曲线和ic50值的比较表明，在多个供体中进行测试时，所述4d11抗体具有更高的效力。当在不存在cd40l的情况下测试激动活性时，类似于4d11抗体，抗体(即抗体b、抗体a和抗体c)在最高10μg/ml(67nm)浓度下均不会诱导任何高于背景水平的b细胞增殖。
[0390]
竞争抗体4d11似乎略微更有效，其平均ic50为约0.02nm，并且不存在激动作用。三种bi抗体和4d11的数据汇总在上文表2.2中。也在此测定中测试的另一种竞争抗体pg-102(源自克隆5d12)，在不存在cd40l的情况下，表现出刺激b细胞增殖的显著激动剂作用。因此，我们的主要候选物的缺乏激动作用将它们与pg-102清楚地区别开。
[0391]
在第二测定中，评估抗体对人类b细胞中的cd86上调的抑制作用。在这种情况下，可以用人类全血或在纯化的b细胞中进行测定，都是在外源cd40l的存在下进行。与b细胞增殖数据一致，在人类全血中测试的抗体b、抗体a和抗体c显示出对cd40介导的cd86上调的有效抑制，如通过流式细胞术测量的。在此测定中，抗体c展示与4d11相似的效力，而抗体b和抗体a的效力稍弱。抗体b和4d11在纯化的b细胞上或在全血中的比较表明，与在存在其他携
带cd40的细胞或血清的情况下的b细胞相比，抗体b对纯化的b细胞的效力(ic50和ic90值)相对不变，而4d11的效力在全血条件下经历巨大变化。
[0392]
当评估抗体b、抗体a和抗体c对食蟹猴b细胞上的cd86上调的抑制作用时，当使用全血样品进行评估时，已经开发出类似的数据。在食蟹猴全血中测试的抗体b、抗体a和抗体c对cd40介导的cd86上调显示出有效抑制作用，如通过流式细胞术测定的。因此，这些抗体全部都显示出与食蟹猴cd40的功能性交叉反应，与对人类cd40的效力相似。
[0393]
针对介导抗体依赖性细胞毒性的能力来评估抗体b igg1kob和抗体b igg1wt的活性。在此测定中，将ramos细胞与人类pbmc以50:1的效应子与靶细胞比率孵育。抗体b igg1kob和抗体b igg1wt从20ug/ml滴定，并通过ldh的释放来监测细胞死亡程度。所示数据来自一项代表性实验。数据显示，抗体a igg1wt 20e2-12-rigg1wt是adcc的有效介体，并且含有消除效应子功能的突变的抗体b igg1kob不具有adcc活性。
[0394]
实施例3：药代动力学/药效学研究
[0395]
a.在食蟹猴中以1或10mg/kg单剂量静脉内施用抗体a和抗体b
[0396]
将抗体a和抗体b各自以1和10mg/kg向雄性食蟹猴((n＝3)/剂量)iv给药。从0-504h(3周)收集血液样品，回收血清，并将样品保存在-20℃直至分析。如上文所述，通过夹心elisa分析样品。在两次iv剂量后两种抗体在猴子体内的血清浓度-时间曲线和药代动力学参数汇总于下文显示的表2.7.1(抗体a)和2.7.2(抗体b)中。两种抗体均显示出剂量依赖性药代动力学，这表明在低剂量下，清除主要归因于与靶标介导的处置一致，而在较高剂量下，抗体主要通过分解代谢被清除。对于靶向膜相关靶标(例如cd19、cd20、egfr、cd146和her2)的其他mab，观察到类似的剂量依赖性药代动力学曲线。对于1和10mg/kg剂量，抗体a的清除率分别为0.8和0.1ml/h/kg。对于1和10mg/kg剂量，抗体b的清除率分别为0.7和0.1ml/h/kg。类似地，对于1和10mg/kg剂量，抗体a的半衰期分别为1天和13天，并且对于相同的相应剂量，抗体b的半衰期分别为2天和13天。尽管在较低剂量下，抗体b的半衰期相对于相同剂量的抗体a略长，但预期在长期施用时，这种差异不会转化为更持久的暴露。两种化合物的auc都是超比例的，并且两种化合物的分布体积(vss)接近血浆体积(约40ml/kg)，显示出通常在大的极性蛋白质治疗剂中可见的有限组织分布。总体而言，两种抗体之间的药代动力学参数没有明显差异。表2.7.1：在单次1和10mg/kg iv剂量之后，在雄性食蟹猴((n＝3)/剂量)中，抗体a的药代动力学参数。表2.7.2：在单次1和10mg/kg iv剂量之后，在雄性食蟹猴((n＝3)/剂量)中，抗体b的药代动力学参数。
[0397]
b.离体药效学研究
[0398]
作为上文所述的pk研究的一部分，分析了抗cd40抗体的药效学作用。为此，将全血样品与重组cd40l孵育过夜，并且通过流式细胞术确定b细胞上cd86表达的增加。在第0天(处理前)、给药后第2天、第7天和第14天分析样品。尽管cd86表达的增加相对较小(约5％-20％)，但观察到剂量依赖性作用。在用10mg/kg抗体a和抗体b给药的动物组中，cd86诱导在第2天、第7天和第14天被完全抑制，这与此剂量下的持续暴露一致。用1mg/kg给药的动物在第2天显示完全抑制，在第7天显示部分抑制，并且在第14天显示没有抑制。药效学作用随着时间而丧失与低剂量组中抗体的更快清除有关。
[0399]
实施例4：毒理学相关研究：血小板上的cd40
[0400]
cd40在人类血小板上组成型表达(henn等人,2001和inwald等人,2003)，而cd40l在活化血小板的细胞表面上迅速且短暂地表达(henn等人,2001)。虽然预期没有fcγr结合的抗cd40抗体对血小板没有影响，但重要的是直接证明情况确实如此。进行流式细胞术研究以证明抗cd40主要候选物与人类和食蟹猴血小板的结合。
[0401]
以前已经通过流式细胞术证明，g28.5和mab 89抗cd40 mab与静息人类血小板结合(henn等人,2001)。这已使用fitc标记的g28.5抗体来证实。制备g28.5的5倍系列稀释液，并在室温下将0.5μg/ml至0.32ng/ml范围在100μl从人类(2个供体)或食蟹猴(3个供体)获得的血小板中孵育30分钟。另外，使用apc标记的抗cd45 mab鉴定与其他cd40
+
细胞类型结合的血小板，以便从分析中排除这些细胞。在抗体染色后，将血小板洗涤并用optilyse c固定并进行流式细胞术。确定平均荧光强度(mfi)来作为抗体与cd45-血小板的结合的量度。
[0402]
对可商购获得的5c3和本发明的所选抗体抗cd40小鼠mab进行fitc标记。证实与ramos细胞的结合。每个抗体分子的fitc分子数量的范围为每个抗体分子2到4个fitc。制备商用和候选抗cd40 mab的范围为0.5μg/ml至0.32ng/ml的五倍系列稀释液，并在室温下将其与人类(3个供体)和食蟹猴(2个供体)血小板一起孵育30分钟。
[0403]
先前在美国专利号8,591,900中展示了显示小鼠候选抗cd40mab与人类血小板的结合的代表性图。与fitc标记的同种型对照抗体相比，四种候选单克隆抗体表现出与人类血小板的特异性结合。10f2、2h11、19b10和20e2表现出相当的与血小板的结合。对于食蟹猴血小板观察到类似的趋势(数据未示出)。
[0404]
除了这些研究之外，还对直接标记的抗体b和4d11结合人类和食蟹猴全血样品中的血小板和b细胞的能力进行比较。4d11对人类和食蟹猴血液样品中的b细胞和血小板显示出相似的结合(如ec50所例示)。抗体b表现出相似的模式，但结合效力显著更弱。
[0405]
实施例5：nsg小鼠模型中的体内药理学研究
[0406]
在抗体产生模型中评价人源化抗体(抗体a)的功效，在所述模型中将人类pbmc注射到免疫缺陷型nsg小鼠中，以便产生移植物抗宿主反应。在植入后2周开始，可以检测到人
类igm(higm)和igg(higg)的大量产生。在植入后第2周和第3周，使用5和1mg/kg剂量的抗体a进行治疗可显著抑制higg和higm反应。在单次5mg/kg剂量下评价比较抗体(4d11)，并且也显示所述反应的消除。在第二项研究中，所有抗体(即抗体a、抗体b和抗体c)均以1mg/kg单次剂量进行测试，并在第2周显示出对igm和igg反应的完全抑制。
[0407]
实施例6：生物标记分析
[0408]
受体上调：cd40l诱导的受体上调可以通过流式细胞术进行测量。可以通过优化浓度的可溶性cd40l刺激人类全血，并且可以通过流式细胞术测量cd20+受体+细胞的完整百分比。与评估抗体a和b的食蟹猴pk研究平行地测量cd20阳性细胞上的cd86表达的百分比的变化。数据显示抑制cd86上调的时间点与抗体暴露一致。
[0409]
靶向蛋白质组学：可以使用全血中在cd40刺激后增加的蛋白质分泌作为一种或多种潜在的生物标记。使用检测mdc/ccl22和其他几种分泌蛋白质的luminex多重珠平台来确立可溶性cd40l的优化浓度和刺激时间。将以抗cd40 mab的全剂量范围从人类全血评估临床样品。
[0410]
受体占有率：cd40受体占有率可以在体外或离体测定中基于人类全血中b细胞的流式细胞术分析来确定。将使用本发明的当前候选抗体和非竞争性抗cd40抗体5c3来对受体占有率测定进行定量。
[0411]
实施例7：人源化抗cd40抗体的抗肿瘤活性
[0412]
在某些情况下，可能希望确定本发明的抗体的抗肿瘤特性。可以通过在scid小鼠淋巴瘤异种移植模型中测定人源化抗cd40抗体的抗肿瘤活性来进行这种确定。可以向这种scid模型注射癌细胞以呈现肿瘤，例如可以在开始药物治疗前十三天将5x 106百万个肿瘤细胞皮下注射到scid小鼠(10只/组)中。每周3次(4mg/kg/剂量)腹膜内给予本发明的鼠类抗cd40抗体或比较(例如对照或其他人源化抗体)，并施用8或5个剂量。在小鼠中监测肿瘤的发展和生长，并且可以在所选定的研究时段(例如14天研究时段)期间每周测量一次肿瘤体积。优选地，结果将显示与用本发明的抗体治疗的小鼠相比，在对照小鼠中肿瘤生长的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多倍增加。优选地，在治疗期间，用本发明的抗体治疗的小鼠中的肿瘤生长可以忽略不计。此类数据可以证实，在此b淋巴瘤异种移植模型中，所测试的人源化抗体在抑制肿瘤生长中有效。
[0413]
实施例8：人源化抗cd40抗体延长存活
[0414]
可以在scid小鼠淋巴瘤异种移植模型中测定人源化抗cd40抗体对荷瘤小鼠(诸如上文所述的那些荷瘤小鼠)的存活的功效。在抗体治疗前三天，向scid小鼠(10只/组)静脉内接种1x 106百万个肿瘤细胞。然后用本发明的鼠类或人源化抗cd40抗体或ig对照治疗小鼠，每周腹膜内施用两次(4mg/kg/剂量)，总共五个剂量。然后可以每天检查小鼠笼的死亡率，以确定所述抗体在延长患有癌症的受试者的存活方面的功效水平。
[0415]
本文引用了各种参考文献，包括专利申请、专利和科学出版物，其公开内容以引用方式以其整体并入本文。本文中任何参考文献的引用或标识均不应解释为承认这个参考文献可用作本发明的现有技术。
[0416]
实施例9：在健康受试者中多个上升剂量的本发明的抗体即拮抗性抗cd40抗体的安全性、药代动力学和药效学：用于自身免疫性疾病的潜在新型治疗
[0417]
此项随机化、安慰剂对照、双盲研究的目的是确定在健康受试者中，80、120、180或
240mg本发明的抗体的重复4周的每周一次sc给药的安全性、耐受性、药代动力学(pk)和药效学(pd)。
[0418]
方法
[0419]
研究设计
[0420]
参与中心的独立伦理委员会和新西兰卫生局(new zealand health authority)批准了此1期研究，并且所有参与受试者均提供了知情同意。所述研究由boehringer ingelheim赞助，并在在新西兰的奥克兰由auckland clinical studies ltd.在单一试验中心进行。
[0421]
所述研究是一项随机化、安慰剂对照且双盲的剂量内(within-dose)分组研究。在4周治疗期内，在健康受试者中每周一次测试80-240mg本发明的抗体的多个上升sc剂量。
[0422]
基于单次上升剂量研究的安全性、pk和pd数据选择剂量。在该研究中，最大测试iv剂量(120mg)耐受良好，并且与测试的120mg sc剂量相比，最大观察浓度(cmax)高7倍且浓度-时间曲线下面积(auc)高3倍。基于这些pk数据，计算出单次上升剂量研究中120mg iv剂量的暴露将覆盖使用240mg sc剂量所预期的暴露。
[0423]
通过交互式响应技术(interactive response technology)工具，将合格的受试者以4:1比率随机化以在四个连续sc剂量组(80、120、180和240mg)中接受本发明的抗体或安慰剂，剂量组间隔至少7天。每个剂量组包括10名受试者(8名活性剂、2名安慰剂)(图1)。独立的数据监测委员会基于对安全性、耐受性、pk和pd数据的评价，决定将剂量增加到下一个剂量水平。
[0424]
所有受试者均在第22天接受治疗的最后一个剂量。在最后一个剂量后，跟踪80、120和180mg sc剂量组中的受试者42天，并且总研究持续时间为64天。跟踪240mg sc剂量组中的受试者56天，并且总研究持续时间为78天。
[0425]
受试者、研究人员和赞助商工作人员仍对研究治疗不知情。在80-180mg sc剂量组的患者完成研究后，进行初始数据库锁定，并且在240mg sc剂量组完成后，将所有数据解盲。
[0426]
使用留置导管将用于pk分析的血液样品(2.7ml)从前臂静脉中收集到乙二胺四乙酸三钾抗凝管中。在给药前，以及在给药后1、8、12小时，以及在第一剂量后第1天、第2天、第3天(am和pm，相隔12小时)、第4天(am和pm，相隔12小时)、第5天、第6天、第7天(第二剂量前)、第14天(第三剂量前)、第21天(第四剂量前以及在第四剂量后1和12小时)、第22天、第23天、第24天、第25天、第26天、第27天、第28天、第29天、第31天、第34天、第38天、第42天、第49天、第56天、第63天(仅80-180mg剂量组)和第77天(仅240mg剂量组)，收集样品。
[0427]
在给药前以及在第一剂量后第21天(第四剂量前)、第38天、第63天(仅80-180mg剂量组)和第77天(仅240mg剂量组)，采集用于评估针对本发明的抗体的抗体(ada)的血液样品。
[0428]
将血液样品在收集后立即置于冰上，并在样品收集的30分钟内在4℃下离心10分钟。将血浆转移到两个聚丙烯样品小瓶(每个0.5ml)中并储存在-20℃下，之后运输至分析实验室。
[0429]
在给药前以及在第一剂量后第3天、第7天(第二剂量前)、第21天(第四剂量前)、第24天、第28天、第38天、第63天(仅80-180mg剂量组)和第77天(仅240mg剂量组)，使用留置导
管将用于pd分析的血液样品(4.9ml)从前臂静脉中收集到肝素抗凝血液管中，并将其立即送到实验室中进行分析。用于cd40 ro和cd54上调测定的测定验证表明，在分析之前，全血分别可以在室温下放置长达24小时和6小时。
[0430]
研究参与者
[0431]
登记年龄在18至60岁之间、体重指数在18.5与29.9kg/m2之间的合格受试者。女性参与者必须是绝经后的、手术绝育的、禁欲的、性伴侣的输精管切除的、或在研究药物施用前≥30天中以及在研究完成后长达30天中实施公认避孕方法的，并且在研究之前和期间妊娠测试呈阴性。
[0432]
如果受试者具有任何以下证据，则排除在外：通过医学检查或实验室测试鉴定的临床上明显异常；伴发疾病；任何胃肠、肝、肾、呼吸、心血管、代谢、免疫或激素障碍；中枢神经系统疾病；直立性低血压、晕厥或黑矇；或者过敏或药物超敏反应。如果受试者有以下情况也排除在外：在随机化前30天或少于10个半衰期内服用了具有长半衰期(t1/2；>24小时)的任何其他药物；在研究的第一个给药日前10天内服用了可能影响研究结果的药物；在研究的第一个给药日前60天内接受过任何研究药物；在研究的第一个给药日前30天内献血；有药物滥用或过量饮酒或吸烟的证据；对人免疫缺陷病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、结核病或者慢性或相关急性感染的测试呈阳性；有意在研究的第一个给药日前1周内开始新的运动方案。也排除哺乳期或计划在研究完成后30天内怀孕的女性。
[0433]
分析方法
[0434]
使用验证的夹心酶联免疫吸附测定(elisa)分析本发明的抗体的血浆浓度，其定量下限为30ng/ml。首先用针对本发明抗体的抗体涂覆96孔微量滴定板，封闭并洗涤。然后将所述板与研究样品、校准物或质量控制样品一起孵育，并再次洗涤。使用针对本发明的抗体的生物素化抗体检测本发明的抗体的结合，然后使用与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素检测，最后使用过氧化物酶底物四甲基联苯胺来检测。用比色法读取板，并使用5参数逻辑拟合分析数据。定量范围是30-800ng/ml。在使用质量控制样品以以下3种浓度进行常规分析期间评估足够的准确性和精确度：低浓度(50或100ng/ml)、中等浓度(126或200ng/ml)和高浓度(500或590ng/ml)。通过进行样品重新分析来测试elisa的重现性，其中93％样品符合验收标准(与均值的差≤30％)。
[0435]
使用验证的桥接电化学发光方法分析血浆样品中的本发明的抗体。所有报告的样品数据均符合测定的专用验收标准。ada测定的验证表明，在血浆浓度为50μg/ml的本发明抗体存在下，可以检测到250ng/ml的阳性对照抗体ada。通过另外的滴度测定进一步表征了受试者的真阳性反应。通过分析样品的连续2倍稀释液来确定滴度。报告的滴度是产生的平均电化学发光值大于或等于板特有分割点的最高倍稀释度。
[0436]
本发明抗体浓度的确定和ada评估二者都是由covance laboratories,inc.(尚蒂利，弗吉尼亚州，美国)进行的。
[0437]
对于cd40 ro的测量，将全血样品与过量的荧光素-异硫氰酸酯(fitc)标记的本发明抗体和抗cd19-别藻蓝蛋白(apc；用于在b细胞上门控)在黑暗中在室温下孵育20分钟。添加荧光活化的细胞分选(facs)裂解溶液，并将管在室温下在黑暗中孵育15分钟，然后在4℃下离心(1300rpm)6分钟，并去除上清液。添加cellfix，将管涡旋并在黑暗中在4℃下储存，直到facs分析为止，这是在添加cellfix之后24小时内进行的。在测量期间，所有样品都保
持在冰上。
[0438]
对于对cd54上调的抑制的测量，将全血与单独的白介素4(il-4)(“非刺激性facs管”)或与megacd40l+il-4(“刺激性facs管”)一起孵育。将管涡旋并在37℃下在黑暗中于加湿孵育器中孵育23-26小时。将抗cd19-apc和抗cd54-藻红蛋白(pe)添加到每个管中，并将管涡旋并在黑暗中在室温下孵育20分钟。添加facs溶液，并将管在室温下在黑暗中孵育15分钟，然后在4℃下离心(1300rpm)6分钟，并去除上清液。添加cellfix，将管涡旋并在黑暗中在4℃下储存，直到facs分析为止，这是在添加cellfix之后2小时内进行。在测量期间，所有样品都保持在冰上。
[0439]
cd40 ro和cd54上调测定二者都是准定量的。测定结果是基于变化百分比(即，治疗中的样品与给药前样品相关)。
[0440]
为了检查血栓栓塞事件的可能性，进行了以下评估：凝血酶原时间-国际标准化比率(pt-inr)、活化的部分凝血致活酶时间(aptt)、抗凝血酶iii、纤维蛋白原、蛋白s和蛋白c、血小板计数、出血时间(使用duke方法测量)和d-二聚体。
[0441]
药代动力学评价
[0442]
使用winnonlin
tm
(5.02版，gary，北卡罗来纳州，美国)通过非隔室方法分析本发明的抗体的血浆浓度-时间数据。使用标准winnonlin
tm
程序确定的参数包括：cmax、达到cmax的时间(tmax)、终末消除常数(λz)和终末t1/2。使用winnonlin
tm
的线性上升对数下降算法(linear-up log-down algorithm)计算最后一次(第四)剂量后均匀给药间隔τ的浓度-时间曲线下面积(auc0-τ)。将累积比(基于cmax的ra,cmax；基于auc0-τ的ra,auc)计算为第四剂量后的值与第一剂量后的值的比率。
[0443]
药效学评价
[0444]
药效学评估包括评价本发明抗体的cd40 ro和对b细胞活化的抑制，如使用上述已验证的facs测定通过megacd40l诱导的全血中的cd54上调所测量。先前已经使用标准的s形emax模型探索本发明的抗体的剂量与对cd40 ro和cd54上调的抑制之间的关系，并报道于以下文献中：albach等人eur j clin pharmacol.2018；74(2):161-169。
[0445]
安全性和耐受性
[0446]
通过监测治疗紧急不良事件(ae)、身体检查、生命体征(血压和脉搏)、12导联心电图(ecg)和临床实验室测试(血液学、临床化学和尿液分析)来评估本发明的抗体的安全性和总体耐受性。
[0447]
统计学分析
[0448]
未进行正式的样本量确定：认为每个剂量组8名受试者对于pk和安全性分析是足够的。使用描述性统计学针对安全性、pk和pd分析研究结果。安全性群体包括接受研究药物(本发明的抗体或安慰剂)的所有受试者。pk和pd群体包括接受研究药物并分别提供pk和pd分析的可评价数据的所有受试者。使用权重模型评估第四剂量后auc0
–
τ和cmax的剂量比例性。计算斜率的95％置信区间(ci)。完全剂量比例性定义为斜率参数(β)为1。进行描述性分析(包括浓度数据的图形表示)，以评估是否达到稳态。
[0449]
结果
[0450]
受试者
[0451]
研究中总共40名健康受试者被随机化和治疗。受试者在4周时段内接受重复的每
周一次的使用以下各项的sc治疗：安慰剂(n＝8)、80mg本发明的抗体(n＝8)、120mg本发明的抗体(n＝8)、180mg本发明的抗体(n＝8)或240mg本发明的抗体(n＝8)。所有40名受试者均完成了计划的观察期并且没有过早停药。大多数受试者为男性(83％)和白人(73％)，平均(标准差[sd])年龄为30(10.8)岁，并且平均(sd)体重指数为25(3.1)kg/m2。治疗组之间没有相关人口统计学差异。
[0452]
药代动力学
[0453]
在第一sc剂量(第1天)和最后sc剂量(第四)施用之后本发明的抗体的所选pk参数的几何平均值(gmean)呈现于表9.2中。第一剂量后，中值tmax随着每次每周剂量增加，但在第四剂量后，tmax并未显示任何明显的剂量关系(tmax，4)。针对施用的剂量归一化的最大血浆浓度和auc(分别为cmax,norm,4和aucτ,norm,4)对于80mg本发明抗体剂量组是较低的，并且对于3个较高剂量组是相似的，这表明80mg至120mg的暴露的大于比例的增加，以及>120mg的剂量的近似剂量比例性动力学。确定基于cmax或auc的几何平均累积比(分别为ra,cmax,4以及ra,auc,4)，以评估本发明抗体在4次多剂量后的累积。在4次80mg的每周一次sc剂量后，ra,cmax,4和ra,auc,4值分别比单一剂量后高8.3倍和11.6倍，这表明本发明的抗体的累积。对于3个较高剂量，gmean累积较低(范围：对于ra,cmax,4为3.7
–
4，并且对于ra,auc,4为4.9-5.8)。本发明的抗体的终末t1/2范围为156至199小时(6-8天)。谷浓度的目视检查表明，任何剂量都未达到稳态：所有剂量组的谷血浆浓度均随着每个后续剂量而持续增加(图2)。表9.2.在第一剂量(第1天)和最后剂量后(在4次每周一次的皮下施用之后)，本发明的抗体的所选pk参数。
auc，曲线下面积；cmax，最大观察浓度；pk，药代动力学；ra，累积率；t1/2，半衰期；t
max
，达到c
max
的时间。数据以几何平均值(几何变异系数，％)表示，以中值(范围)表示的t
max
的数据除外。
a
在本发明的抗体的第四剂量后分析的pk参数用上标4(例如tmax,4)指示。
b auc0-τ与auc0-168h同义。
c ra,auc等于第四剂量后的auc0-τ除以第一剂量后的auc0-τ。
[0454]
在sc剂量范围80-240mg内的剂量比例性分析表明，cmax和auc0-τ的斜率与表明本发明抗体的暴露与剂量不成比例的整体(unity)显著不同(cmax：第一剂量后，权重模型斜率β＝2.1[95％ci 1.2-2.9]；最后一个剂量后，斜率β＝1.4[95％ci 1.1-1.8]；n＝32；auc0-τ：最后一个剂量后，斜率β＝1.4[95％ci 1.1-1.8]；n＝32)。然而，对于较高剂量(120-240mg)，观察到朝向剂量比例性的趋势。
[0455]
药效学
[0456]
施用本发明的抗体导致剂量依赖性的cd40 ro和对cd54上调的抑制(图3)。
[0457]
在本发明抗体的单次sc剂量后，在第一次给药后测量时(72小时)，算术平均cd40 ro已达到每个剂量水平的几乎最大值(图3a)。在此时间点，80mg剂量导致约89％的cd40 ro。对于120-240mg剂量组，cd40 ro在94％-95％达到平台期；因为这是所述测定的检测限，所以无法确定是否可以达到更高的占有率水平。在研究的其余部分中，维持这些cd40 ro水
平。
[0458]
在本发明的抗体的最后一次(第四次)每周一次sc施用后，对于所有剂量(80-240mg)，在直到第39天(最后一次施用后17天)的所测量的所有时间点，cd40 ro>90％。对于180mg剂量组，在第64天仍可检测到79％(几何变异系数[gcv]23％)cd40 ro，并且对于240mg剂量组，在第78天可检测到68％(gcv 29％)cd40 ro，这表明与受体的长期持久结合，但是在这些较晚时间点的可变性更高。在安慰剂组中未观察到值得注意的cd40 ro。
[0459]
在本发明抗体的单一剂量施用后，对cd54上调的抑制遵循与针对cd40 ro所观察类似的模式，其中80mg剂量在第一次给药后测量(72小时)时产生87％的抑制，并且在此时间点对于较高剂量观察到>90％的抑制(所有剂量组；图3b)。对于80mg剂量组，抑制在给药后第7天进一步增加到95％，而对于所有其他剂量，从72小时之后观察到95％抑制；在安慰剂组中，对cd54上调的抑制在-20％与30％之间变化。在本发明的抗体的最后一次(第四次)每周一次sc施用后，所有剂量对cd54上调的抑制>90％，直至第39天(最后一次施用后17天)。抑制作用对于180mg组(第64天为89％)和240mg组(第78天为51％)仍是可检测的。
[0460]
安全性
[0461]
在本发明的抗体的治疗组中，ae的总频率和强度相似(所有本发明的抗体的剂量[78％]和安慰剂组[88％])。没有报告严重ae(serious ae)、严重ae(severe ae)或者导致停药或死亡的ae。尽管受试者数量小，但是在本发明的抗体的剂量、治疗相关ae或ae的频率和强度之间似乎没有任何关系。在接受本发明的抗体的8名受试者(25％)中和接受安慰剂的5名受试者(63％)中报告了感染。没有血栓栓塞事件。报告最频繁的治疗相关ae是头痛，在接受本发明的抗体的4名受试者(13％)和接受安慰剂的2名受试者(25％)中发生。所有ae的强度均为轻度或中度，并且均已消退。
[0462]
对于80mg和120mg治疗组中的单独受试者，在基线时以及用本发明的抗体或安慰剂治疗后均观察到肌酸激酶(ck)显著升高(范围是正常值上限[uln]的1.1-88倍)。总体而言，确定ck的这些升高大体上归因于剧烈运动。对较高剂量组(180-240mg)的更严格的运动限制导致ck水平降低(最大3倍uln)。
[0463]
在用本发明的抗体治疗的所有受试者中，分别在12名(37.5％)和14名(43.8％)受试者中观察到轻度和短暂性白细胞减少症和中性粒细胞减少症。仅有1名接受安慰剂的受试者患有轻度和短暂性中性粒细胞减少症。在接受治疗前，在患有轻度短暂性白细胞减少症的12名受试者中的4名受试者(33.3％)中以及在患有轻度短暂性中性粒细胞减少症的14名受试者中的5名受试者(35.7％)中观察到低于正常值下限(lln)的值。截至研究结束时，在所有受试者中，白细胞(wbc)和绝对中性粒细胞计数恢复到正常值内(wbc正常范围：4-11
×
109/l，以及绝对中性粒细胞正常范围：1.9-7.5
×
109/l)或达到治疗前水平，但1名受试者除外，其在研究结束访视时wbc计数为3.77
×
109/l，并且另一名受试者在研究结束访视时具有分别为3.58
×
109/l和1.69
×
109/l的低wbc计数和绝对中性粒细胞计数。此外，随着本发明的抗体的剂量增加，患有白细胞减少症或中性粒细胞减少症的受试者数量没有增加。
[0464]
出血时间、血小板计数或凝血参数(包括d-二聚体、抗凝血酶iii、纤维蛋白原以及蛋白s和蛋白c)没有临床上显著的变化。
[0465]
各组之间在生命体征、ecg或身体检查方面没有临床相关发现或治疗差异。局部耐
受性的评估表明，本发明的抗体的所有剂量均耐受良好，并且与安慰剂组相比没有差异。
[0466]
在4名受试者(10％)中观察到预先存在的ada反应，其中3名随后接受了本发明的抗体并且1名接受了安慰剂。ada滴度仅在这些受试者中的1名用240mg本发明抗体给药的受试者中增加(治疗增强的ada[在生物施用后被增强至更高水平的预先存在的ada])。
[0467]
在用本发明的抗体治疗后在16名受试者(50％)中观察到血清转化；主要在研究结束样品中发作(15名受试者[47％])。在该时间，本发明抗体的水平已经非常低(对于80-240mg剂量组，本发明的抗体的血浆浓度的gmean的范围为0.182-10.5μg/ml)。
[0468]
在80mg剂量组的5名受试者(62.5％)和120mg剂量组的6名受试者(75％)中观察到治疗诱导的ada(生物施用后从头产生的ada)或治疗增强的ada反应。80mg和120mg剂量组的总体中值滴度分别为20和8。在较高剂量组的较少受试者中观察到治疗诱导的或治疗增强的ada反应；分别为180mg和240mg剂量组中的2名(25％)和4名(50％)受试者，其总体中值滴度分别为4和8。在120mg剂量组中观察到的单独受试者的最大滴度为640。
[0469]
讨论
[0470]
此研究的目的是研究本发明的抗体的4周的上升sc剂量(每周80-240mg)在健康受试者中的作用。pk参数的评估表明120-240mg本发明抗体的sc剂量的近似成比例动力学，以及80-120mg的sc剂量由于靶标介导的药物清除所致的超比例动力学，如在先前研究中在本发明的抗体的单次iv剂量后所观察到的。所述作用被cd40受体的广泛分布(尤其是血小板，其t1/2较短)增强，并且先前在使用拮抗性抗cd40抗体的其他研究中已有报道。对于cmax(在第一剂量和最后剂量后)以及对于auc0-τ(在最后一个剂量后)，在120-240mg本发明的抗体的sc剂量范围中，观察到近似成比例的剂量-暴露关系，两个参数的斜率β＝1.2，这可能表明在这些剂量下cd40 ro接近饱和。在此项研究中在80mg和120mg本发明的抗体的第一sc剂量后实现的血浆暴露与先前在健康志愿者中进行的单次上升剂量研究中观察到的那些血浆暴露相似，其中在80mg和120mg本发明的抗体的单次sc剂量后，分别获得120μg
·
h/ml和888μg
·
h/ml的gmean auc值。与单次给药(第一剂量)施用相比，在多次给药之后在所有剂量水平下观察到本发明的抗体的累积。但是，在120-240mg剂量下观察到较低的累积，相对恒定的gmean ra,cmax值在3.7与4之间，并且gmean ra,auc值在4.9与6之间。对于任何施用的剂量，在4周时段内均未达到稳态。建模显示，当每周一次以120mg本发明的抗体给药时，可能需要长达12周才能达到稳态(准备稿)。已通过用120mg本发明抗体的每周一次sc持续12周治疗患有类风湿性关节炎的患者来证实在约12周内达到稳态的预测，这表明在约10-12周内达到pk稳态。26因此，这支持在未来的临床研究中使用负荷剂量来更快地达到稳态。对于暴露参数auc和cmax，个体间差异对于80mg剂量是较高的(gcv：56.4-59.1％)，对于120mg和180mg剂量是中等的(gcv：35.4-37.4％)，并且对于240mg剂量是较低的(gcv：21.9-22.4％)。本发明的抗体从sc注射部位缓慢吸收，中值tmax在第一剂量后随剂量而增加；在第四剂量后，与tmax,4没有剂量关系。在本发明的抗体的多次给药后，估计的终末t1/2范围在6天与8天之间，在各剂量之间没有明显差异。
[0471]
对cd40 ro以及对cd54上调的抑制进行的评估表明，从给药后72小时起，在120与240mg之间的本发明的抗体的单次sc剂量导致>90％的cd40 ro和>90％的对cd54上调的抑制。在本发明的抗体的最后一个(第四)剂量后，在80-240mg的sc剂量范围内给药后，>90％的cd40 ro以及对cd54上调的抑制维持至少408小时(17天)。这些结果表明了用本发明的抗
体的每两周sc使用连续完全抑制激动性cd40连接的可能性。建模显示，120mg本发明的抗体的每周一次sc持续3周的给药和之后每隔一周一次的给药会导致连续的>90％的cd40 ro。预期在患有炎性疾病诸如类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮或狼疮肾炎的患者中，cd40受体将在多种免疫细胞和驻留细胞(例如狼疮肾炎的系膜细胞)中高度表达并上调；因此，可能需要比在健康受试者的b细胞上导致90％受体占有率的那些剂量更高的剂量的本发明抗体，才能在患有自身免疫性疾病的患者中完全阻断cd40受体。将需要在这些患者中进行本发明的抗体的临床研究，以评价更长的给药间隔是否可以实现临床功效，或者是否需要每周给药。
[0472]
本发明的抗体的上升的多个sc剂量被认为是安全的，并且在健康受试者中显示出良好的总体耐受性。所有ae的强度均为轻度或中度，并且未报告导致中断研究的ae。在本发明的抗体组和安慰剂组中，在基线时和治疗后，一些受试者报告血清ck值升高至高于uln，但是这些可归因于过度运动；与先前文献中报道的情况相似。对180mg和240mg剂量组实施的更严格的运动限制导致ck浓度降低。数名受试者在用本发明的抗体治疗后表现出轻度和短暂性白细胞减少症和中性粒细胞减少症。然而，在治疗前已经分别在33.3％患有白细胞减少症的患者和35.7％患有中性粒细胞减少症的患者中观察到低于lln的值。短暂性中性粒细胞减少症在健康受试者中非常普遍，并且在某些情况下与并发性病毒感染相关联。先前已在进行高强度运动的受试者和大部分登记在此研究中且进行剧烈身体活动的受试者中报道中性粒细胞减少症，如观察到的血清ck值的显著升高所支持。另外，最近已显示，运动引起的肌肉损伤引起快速的局部炎性反应，并且白细胞的局部累积与肌无力相关联。在此研究中观察到的ck水平升高表明，这些受试者具有一定肌肉损伤；因此，白细胞从循环向肌肉的重新分布可能促进观察到的短暂性白细胞减少症和中性粒细胞减少症。总之，观察到的中性粒细胞减少症与使用本发明的抗体进行的治疗之间没有明确关系。但是，将在使用本发明的抗体的后续临床研究中谨慎监测wbc和嗜中性粒细胞的变化。
[0473]
未报告临床相关生命体征、ecg评估或身体检查发现。与施用单次iv和sc剂量的本发明的抗体之后的观察结果一致，在多次给药期间未报告血栓栓塞事件，并且在血小板或凝血参数方面没有临床相关变化。先前对血小板集合度测定的研究和与人类血小板的结合研究表明，阻断cd40对血小板功能没有明显影响(未公开数据)；在毒理学研究中，已证明与食蟹猴的血小板结合的本发明的抗体对血小板数量或功能没有影响。总之，这些发现表明，当与血小板结合时，本发明的抗体似乎不会改变血小板的活化、聚集或功能。这些数据以及来自缺乏功能性fc区的其他抗cd40或抗cd40l抗体的数据17、19、20支持以下解释：可以通过消除抗体的fc功能来避免血栓栓塞事件的风险，如使用早期抗cd40l抗体所观察到的，16。
[0474]
在多个剂量后，在50％接受本发明的抗体的受试者中，治疗诱导的或治疗增强的ada反应没有引起任何临床症状(与ae或暴露的变化没有关系)或没有导致可观察到的pk变化。除两名受试者外(这两名受试者是ada阴性的)，白细胞和嗜中性粒细胞计数未受影响且处于正常范围内或已达到治疗前水平。80mg和120mg剂量组中的ada发生率高于较高剂量组(180mg和240mg)中。在ada反应发作时(研究结束访视)，本发明的抗体血浆浓度接近测定定量的下限；本发明的抗体大多已被消除，并且本发明的抗体的循环水平低于ada测定的药物耐受量。此外，此研究的受试者数量少使得无法确定地评价本发明的抗体的剂量或ada发生
率或滴度。基于本发明的抗体抑制cd40受体并因此阻断抗体产生的机制，预期在本发明的抗体的施用和抗体同位素交换之后不会发生ada。在1512小时(63天)时间点(80-180mg剂量组)或1848小时(77天)时间点(240mg剂量组)，cd40 ro已经下降到低于90％。此外，预期在生发中心本发明的抗体的水平甚至更低；因此，本发明的抗体的浓度可能已经太低而不能阻断ada的形成。此假设也被使用本发明的抗体在食蟹猴中进行的临床前评估支持，其中对于外周b细胞所有剂量均显示>90％的cd40 ro，但最低剂量组(1mg/kg)未显示对生发中心和发展的ada的完整药理作用(21，以及未公开的数据)。
[0475]
结论
[0476]
在健康受试者中在4周时段内上升的多个每周一次sc本发明的抗体给药之后，对于80mg与120mg之间的剂量，pk由于靶向介导的清除率持久而超比例增加，但对于>120mg的剂量则接近成比例。本发明的抗体的剂量依赖性累积支持在未来临床研究中使用负荷剂量以更快地达到稳态。本发明的抗体显示出阻断cd40-cd40l途径的高潜力，并抑制cd40l诱导的cd54上调。因此，进一步研究将需要评价在患有自身免疫性疾病(诸如类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮或狼疮肾炎)的患者中，更长的给药间隔是否可能在临床上有效。在80-240mg范围内本发明的抗体的上升的多个sc剂量通常耐受良好，并且没有观察到急性免疫反应的相关迹象。
[0477]
本文所公开的教导的应用不限于本文所描述的特定实施例的范围。实际上，根据本文所包含的教导和所附实施例，各种修改将在本领域普通技术人员的能力范围内。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。