专利名称：铁调素调节蛋白对机体免疫的调节作用及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及铁调素调节蛋白对机体免疫的调节作用及其应用。
背景技术：
铁元素是生命生长的必需元素。一直以来，人们认识到，铁代谢与免疫调控和感染以有千丝万缕的联系。近年来的研究显示，与铁代谢相关的重要基因也在感染以及免疫调控中起着极为重要的作用。在这些基因中，铁调素(hepcidin)作为铁代谢的关键调控因子，其缺失导致IL-6和TNF-α的表达上调，在h印cidin敲除小鼠中，外源细菌模式分子的刺激下，小鼠机体发生免疫过激反应,产生脓毒血症,导致h印cidin敲除小鼠的死亡。铁调素调节蛋白(Hemojuvelin，HJV)作为BMPs (骨形态发生蛋白，)的共受体，协助增强BMPR(人骨成型蛋白受体，)对BMP的信号传递，促进smadl/5/8的磷酸化水平，从而上调hepcidin的表达。目前铁代谢研究中对HJV调控h印cidin的研究已经有 很多重要发现。HJV是一种跨膜蛋白，HJV的突变导致Hepcidin的表达下降，其缺失的症状为:铁在体内大量蓄积，引发严重的遗传疾病-青少年血色病，在青少年血色病病人尿液里，几乎无法检测出Hepcidin的含量；低水平的Hepcidin引起小肠对铁的吸收增加以及巨曬细胞内铁释放增力口，导致铁离子在各个脏器中蓄积。由于脾脏中富含巨噬细胞，所以铁含量比正常值低。另夕卜，HJV敲除小鼠模型的建立，确证了该基因的缺失会导致血色病。虽然铁代谢和免疫系统一直以来都有着密不可分的联系，但是HJV和免疫系统之间的联系还很不清晰，未见报道。因此本领域迫切需要研究铁调素调节蛋白对机体免疫的调节作用及其应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种铁调素调节蛋白或其激动剂的用途。本发明的另一目的是一种铁调素调节蛋白拮抗剂的用途。本发明的另一目的是提供一种筛选调节免疫细胞杀菌功能的化合物的和调节炎性反应相关蛋白水平或活性的化合物的方法。在本发明的第一方面，提供了一种铁调素调节蛋白或其激动剂的用途，用于制备免疫调节剂，或用于制备抗感染药物组合物。在另一优选例中，所述铁调素调节蛋白或其激动剂(或所述的免疫调节剂，或所述的组合物)还用于:(B1)制备白介素IL-12的激动剂组合物；和/或(Id1)促进干扰素IFN Y的产生和分泌；和/或(C1)上调一氧化氮合酶活性；和/或
(Cl1)促进一氧化氮NO的产生；和/或(θι)促进免疫细胞的杀菌功能。在另一优选例中，所述的铁调素调节蛋白选自下组:(A)氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3、5、7任一所示的多肽；(B)将SEQ ID NO:1、3、5、7任一所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的铁调素调节蛋白衍生物，或其活性片段。在另一优选例中，所述的铁调素调节蛋白编码序列选自下组:(Al)编码如SEQ ID NO:1、3、5、7任一所示多肽的多核苷酸序列；(BI)如SEQ ID NO :2、4、6、8任一所示的多核苷酸序列；(Cl)与(Al)或(BI)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述铁调素调节蛋白来源于人或非人哺乳动物。在另一优选例中，所述铁调素调节蛋白来源于小鼠，大鼠，或家鼠。在另一优选例中，所述铁调素调节蛋白为s亚型(S-HJV)。在另一优选例中，所述铁调素调节蛋白为人S-HJV或小鼠s-HJV。在本发明的第二方面，提供了一种铁调素调节蛋白拮抗剂的用途，用于制备下调白介素IL-12的活性的组合物，或用于制备白介素IL-12的拮抗剂组合物。在另一优选例中，所述组合物还用于:(a2)降低干扰素IFN Y的产生和分泌；和/或
(b2)下调一氧化氮合酶活性；和/或(c2)抑制一氧化氮NO的产生；和/或(d2)抑制免疫细胞的杀菌功能。本发明还提供了一种铁调素调节蛋白拮抗剂的用途，用于制备降低干扰素IFNY的产生和分泌的组合物。在另一优选例中，所述组合物还用于:(a3)下调白介素IL-12的活性；和/或(b3)下调一氧化氮合酶活性；和/或(C3)抑制一氧化氮NO的产生；和/或(d3)抑制免疫细胞的杀菌功能。在本发明的第三方面，提供了一种铁调素调节蛋白、或其激动剂、或其拮抗剂的用途，用于:(I)调节白介素IL-12的活性；和/或(2)调节干扰素IFN Y的产生和分泌；和/或(3)调节一氧化氮合酶活性；和/或(4)调节NO的产生；和/或(5)调节免疫细胞的杀菌功能。在本发明的第四方面，提供了一种方法，所述方法用于调节白介素IL-12活性、调节干扰素IFNy的产生和分泌、调节一氧化氮合酶活性、调节NO的产生、调节免疫细胞的杀菌功能，所述方法包括步骤:改变铁调素调节蛋白的表达或活性；或添加铁调素调节蛋白的激动剂；或添加铁调素调节蛋白的拮抗剂。
在本发明的第五方面，提供了一种筛选调节免疫细胞杀菌功能的化合物的方法，包括步骤:(i)在测试组中，在测试化合物存在情况下培养免疫细胞，并测定铁调素调节蛋白的水平或活性；并且在对照组中，在不存在测试化合物情况下培养免疫细胞，并测定铁调素调节蛋白的水平或活性；(ii)比较测试组和对照组的铁调素调节蛋白水平或活性，如果测试组的铁调素调节蛋白水平或活性显著高于对照组，则提示该物质是上调免疫细胞杀菌功能的化合物；如果测试组的铁调素调节蛋白水平或活性显著低于对照组，则提示该物质是下调免疫细胞杀菌功能的化合物。在另一优选例中，所述的方法还包括步骤:(iii)测定在测试化合物存在情况下免疫细胞对细菌的杀伤能力，从而对测试化合物的调节功能进行确认。在本发明的第六方面，提供了一种筛选调节炎性反应相关蛋白水平或活性的化合物的方法，其中杀伤相关相关蛋白是干扰素IFNy或一氧化氮合酶，包括步骤:(a)在测试组中，在测试化合物存在情况下培养免疫细胞，并测定铁调素调节蛋白的水平或活性；并且在对照组中，在不存在测试化合物情况下培养免疫细胞，并测定铁调素调节蛋白的水平或活性；(b)比较测试组和对照组的铁调素调节蛋白水平或活性，如果测试组的铁调素调节蛋白水平或活性显著高 于对照组，则提示该物质是上调炎性反应相关蛋白的化合物；如果测试组的铁调素调节蛋白水平或活性显著低于对照组，则提示该物质是下调炎性反应相关蛋白的化合物。在另一优选例中，所述的方法还包括步骤:(c)测定在测试化合物存在情况下免疫细胞中所述炎性反应相关蛋白的水平或活性，从而对测试化合物的调节功能进行确认。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1为HJV敲除小鼠和正常小鼠对细菌的易感性测试结果，a)为正常小鼠和HJV敲除的小鼠对鼠伤寒沙门氏菌的易感性结果山)为正常小鼠和HJV敲除的小鼠对大肠杆菌的易感性结果；c)为正常小鼠和HJV敲除的小鼠对金黄色葡萄球菌的易感性结果；d)为正常小鼠和HJV敲除的小鼠的腹腔大肠杆菌数目统计结果；e)为正常小鼠和HJV敲除的小鼠各主要脏器中大肠杆菌数目统计结果；f)为了排除铁代谢的影响，在低铁处理的小鼠体内进行了细菌致死实验，当低铁喂养的小鼠机体铁水平和野生型一致时，在某些脏器中甚至更低时，HJV敲除小鼠依然呈现细菌易感性。图2显示细菌刺激后小鼠体内细胞因子的变化，IO8E.Co I i腹腔注射后，不同时间点眼眶采血，ELISA 检测细胞因子水平 a) TNFa (1.5h)、b) IL_6(2.5h)、c) IFNy (6h)、d)IL-18(6h)、e)IL-12p40(2.5h)细菌感染6h后，流式检测细胞内IFN γ表达水平，以及f)体外热灭活菌刺激后，western检测巨噬细胞内信号通路的改变结果。图3为与对照组小鼠相比，HJV敲除小鼠感染后体内细胞功能变化结果；a) IO8E.coli腹腔注射后，外周血内白细胞变化；b)体外细胞吞噬功能检测；c)体外细胞杀菌功能检测；d)热灭活细菌体外刺激巨噬细胞24h，细胞因子IFN Y分泌；e)热灭活细菌体外刺激巨噬细胞24h，细胞因子IL-6分泌；f) western检测巨噬细胞内IFN Y _stat4信号通路的改变；g)体外巨噬细胞NO分泌检测；h) western检测巨噬细胞内iNOS和p38信号通路的改变。图4显示HJV在免疫细胞中的表达及调控模式；a)正常小鼠各种免疫细胞通过表面标记通过流式分离，分别检测细胞内HJV的表达水平；在热灭活细菌刺激下，野生型小鼠肝脏中HJV表达b)，巨噬细胞内HJV表达c)，肝脏中FPN表达d)，巨噬细胞内FPN表达e)，f)&g)热灭活细菌的刺激下，过表达HJV的Raw264.7细胞中iNOS的表达更多h)，也分泌更
多NO。图5显示s-HJV表达纯化及下调Hepcidin表达的功能检测结果,其中，图5a显示分子筛纯化及蛋白胶检测；图5b显示s-HJV作用于原代培养肝细胞，下调H印cidin表达，具有剂量效应；图5c显示s-HJV可以增强HJV-/-小鼠抗感染能力。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在感染状态下，HJV在免疫细胞中表达增加，协助IL-12促进IFNy的生成，从而激活免疫细胞，表达iNOS，分泌NO，充分行使杀菌功能，因此HJV可以作为一个免疫调控中的重要分子。具体地，本发明涉及一种铁调素调节蛋白或其激动剂、或其拮抗剂的用途，铁调素调节蛋白或其激动剂用于制备上调白介素IL-12的活性的组合物，或用于制备白介素IL-12的激动剂组合物；铁调素调节蛋白拮抗剂用于制备下调白介素IL-12的活性的组合物，或用于制备白介素IL-12的拮抗剂组合物，本发明还提供了一种筛选调节免疫细胞杀菌功能的化合物的和调节炎性反应相关蛋白水平或活性的化合物的方法。铁调素铁调素是一个近年新发现的小分子多肽，主要由肝脏合成。它是肝脏、小肠和网状内皮系统之间铁代谢调节信号的传递者，也是机体铁平衡的中心调节者。当任何原因引起循环铁增加时，肝细胞增加合成和分泌铁调素进入血液，铁调素经血流运输到铁的吸收部位十二指肠及铁储存的主要部位巨噬细胞，与细胞膜上的膜铁转运蛋白I (Feiroportin I)结合，并降解膜铁转运蛋白1，从而抑制铁从肠腔进入血液，同时减少巨噬细胞分泌铁进入血液，使血液铁水平降低。当循环铁较低时，肝脏合成与分泌的铁调素减少，肠吸收上皮相关蛋白降解减少，肠铁吸收量增加，使铁水平回复到正常。HJV基因及铁调素调节蛋白HJV基因即L0C138738基因，人类HJV基因位于染色体lq21区，长约2.6kb，包含4个外显子，其转录后可 形成5个mRNA异构体。HJV基因的产物是铁调素调节蛋白(hemojuvelin^HJV基因突变容易引起年轻型血素沉着症，这是由于铁调素表达严重下降，进而增加铁吸收，终致组织严重铁过负荷及相关症状。因此HJV基因突变引起的铁调素表达障碍是这类疾病的根本原因。铁代谢的重要调控因子HJV作为BMPs的共同受体，可通过SMADs作用于铁稳态的关键激素Hepcidin的启动子，调控其表达。人体HJV突变或小鼠HJV基因敲除均可引发Hepcidin下调，并导致过量铁离子在器官蓄积。尽管HJV和hepcidin的表达是正相关作用，但是它们受调控作用却是截然不同的，铁水平可以调控hepcidin的表达，但是对HJV的表达却没有作用，而炎症状态下肝脏中hepcidin的表达水平被上调，而肝脏中的HJV则被下调，提示了 HJV在炎症免疫中存在特有的作用。 在本发明中，术语“铁调素调节蛋白”、“铁调素调节多肽”等可互换使用，指具SEQID NO:1或3所示序列的蛋白或多肽或其衍生物和活性片段。在未特别指出时，术语“铁调素调节蛋白”包括野生型和突变型蛋白。铁调素调节蛋白具有两种亚型，定位于细胞膜的HJV (m-HJV)和可溶形式的HJV (s-HJV)。s-HJV和m_HJV在H印cidin的调控作用上相拮抗。s-HJV的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或7所示，也包括其衍生物、活性片段，突变片段。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的铁调素调节蛋白或多肽”是指CYP97A4蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化铁调素调节蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括所述蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物 ”和“类似物”是指基本上保持天然铁调素调节蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是:(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；(ii)在一个或几个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。铁调素调节蛋白编码序列选自下组:(Al)编码如SEQ ID NO:1、3、5、7任一所示多肽的多核苷酸序列;(BI)如SEQ ID NO:2、4、6或8任一所不的多核苷酸序列；(Cl)与(Al)或(BI)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
NO内源性NO是一种极不稳定的化合物，其半衰期只有数秒(一般在5秒以下)，体内多种组织和细胞均能合成内源性NO (如巨噬细胞)。在合成NO的细胞中，以L-精氨酸(L-Arg)和分子氧为底物，在一氧化氮合酶(NOS)和还原型辅酶II (NADPH)存在的条件下，生产中间体对羟基L-Arg，后者与02发生反应，生成等克分子量的NO和L-瓜氨酸，其中NOS是NO生成的最主要限速因子，NADPH、黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是重要的辅助因子。NO是一种自由基气体，其化学性质非常活泼，能迅速与分子氧、超氧阴离子以及铁、铜、镁等发生反应，氧化生成终末代谢物硝酸盐(NO)和亚硝酸盐(NO)而失活。免疫细胞(immunocyte)免疫细胞是参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，主要包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。在腹腔中，各类血细胞组成成分分别为，巨噬细胞90%，淋巴细胞5-10%，多形核粒细胞5 %。巨噬细胞是天然免疫系统的重要组成部分，对于识别和清除外源微生物是至关重要的。在腹腔感染发生时，巨噬细胞通过吞噬和杀伤功能来清除微生物。当巨噬细胞被激活，它们生成一氧化氮、氧自由基和抗菌肽等各种物质行使杀伤功能。早在20世纪90年代，人们就已经认识到一氧化氮的抗菌作用。很多种细胞都可以产生一氧化氮，具有放松血管，神经传递和抑制血小板聚集等作用。在天然免疫中，巨噬细胞合成和分泌的一氧化氮起到了重要的杀菌作用。作为一个非特异性的保护机制，一氧化氮可以通过结合巯基和金属活性中心来阻断微生物的呼吸和DNA复制过程，从而杀灭各种微生物，包括革兰氏阴性菌和阳性菌。在巨噬细胞中，主要是诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)负责合成一氧化氮。和正常 小鼠相比，缺乏iNOS的小鼠对于感染更加敏感，不能有效控制细菌在体内的繁殖。当感染发生时，作为天然免疫的重要组成部分的细胞因子分泌增加，包括TNF-a、IL-6和IFNy等。作为重要的原炎症因子IFN Y可以通过全面激活巨噬细胞功能来抗菌，其中一个重要部分就是上调iNOS的表达，从而促进一氧化氮的合成和分泌。诱导IFNy分泌的因子主要有两个分别为IL-18和IL-12。它们分别通过p38和stat4的磷酸化通路来调控IFN Y的分泌。IFN Y ( Y 干扰素)IFN-Y具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和细胞抑制活性，IFN-Y诱导巨噬细胞一氧化氮合酶(iNOS)的产生，促进NO的合成，IFN-Y还可诱导小胶质细胞星形细胞的iNOS产生，与中枢神经系统的某些疾病的发生或保护作用有关。IFN在完全没有内毒素时不能刺激IL-1转录，反而在转录水平抑制IL-1自身诱导的IL-1产生，但IFN-Y可增加LPS诱导的IL-1转录翻译和分泌。应用本发明提供了一种铁调素调节蛋白或其激动剂的用途，所述铁调素调节蛋白或其激动剂用于制备白介素IL-12的激动剂组合物，所述组合物还用于:促进干扰素IFNy的产生和分泌；上调一氧化氮合酶活性；促进一氧化氮NO的产生；促进巨噬细胞的杀菌功能。本发明还提供了一种铁调素调节蛋白拮抗剂的用途，所述拮抗剂用于制备白介素IL-12的拮抗剂组合物；降低干扰素IFNy的产生和分泌；下调一氧化氮合酶活性；抑制一氧化氮NO的产生；抑制巨噬细胞的杀菌功能。
本发明还提供了一种筛选调节巨噬细胞杀菌功能的化合物的方法，在本发明的一个优选例中，包括步骤:(i)在测试组中，在测试化合物存在情况下培养巨噬细胞，并测定铁调素调节蛋白的水平或活性；并且在对照组中，在不存在测试化合物情况下培养巨噬细胞，并测定铁调素调节蛋白的水平或活性；(ii)比较测试组和对照组的铁调素调节蛋白水平或活性，如果测试组的铁调素调节蛋白水平或活性显著高于对照组，则提示该物质是上调巨噬细胞杀菌功能的化合物；如果测试组的铁调素调节蛋白水平或活性显著低于对照组，则提示该物质是下调巨噬细胞杀菌功能的化合物；(iii)测定在测试化合物存在情况下巨噬细胞对细菌的杀伤能力，从而对测试化合物的调节功能进行确认。本发明还提供了一种筛选调节炎性反应相关蛋白水平或活性的化合物的方法，其中杀伤相关蛋白是干扰素IFNy或一氧化氮合酶，在本发明的一个优选例中，包括步骤:(a)在测试组中，在测试化合物存在情况下培养巨噬细胞，并测定铁调素调节蛋白的水平或活性；并且在对照组中，在不存在测试化合物情况下培养巨噬细胞，并测定铁调素调节蛋白的水平或活性；(b)比较测试组和对照组的铁调素调节蛋白水平或活性，如果测试组的铁调素调节蛋白水平或活性显著高于对照组，则提示该物质是上调炎性反应相关蛋白的化合物；如果测试组的铁调素调节蛋白水平或活性显著低于对照组，则提示该物质是下调炎性反应相关蛋白的化合物；(C)测定在测试化 合物存在情况下巨噬细胞中所述炎性反应相关蛋白的水平或活性，从而对测试化合物的调节功能进行确认。本发明的主要优点:(I)提供铁调素调节蛋白或其激动剂、或其拮抗剂的用途；(2)提供体外筛选调节巨噬细胞杀菌功能的化合物的和调节炎性反应相关蛋白水平或活性的化合物的方法。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。材料与方法1.小鼠腹腔巨噬细胞的分离、培养与处理取7-8 周的小鼠,腹腔注射 4% FTG (Fluid Thioglycollate medium),诱导 72h后，断颈处死，75%酒精浸泡5min，剪开腹部皮肤至胸部，注射IOml预热的PBS缓冲液，轻揉20次，用注射器将腹腔液吸出，吹散，300g条件下，室温离心lOmin，用全培养基重悬细胞。培养基成分:RPMI1640 (Gibco)、10% FBS(Gibco)、2mM 谷氨酸、100 μ g/mL 链霉素、10Ouni ts/mT,青霉素(Gibco)。细胞铺板，培养于37°C、5% CO2的细胞培养箱(Thermo)。I小时后，换液，将未贴壁的其余细胞洗去，剩余的细胞即可用于实验。
2.热致死细菌制备将E.coli置于37°C摇床，过夜培养，次日于3500rpm条件下，室温离心5min，弃去上清，用PBS重悬，并于3500rpm条件下室温离心5min，重复洗涤两次，最终用PBS重悬。在95°C条件下，热处理30min，置于_20°C冰箱保存备用。3.体外细胞因子和一氧化氮检测体外分离的腹腔巨噬细胞，用热灭活细菌处理24h后，取上清，用ELISA试剂盒(R&D)检测细胞因子的浓度,Griess Reagent (碧云天公司)显色反应检测细胞上清液中的NO浓度。4.体内细胞因子检测108E.coli腹腔注射小鼠，在不同时间点眼眶采血，采集的血液于室温放置2h;7000rpm条件下，4°C离心20分钟，取上清，ELISA试剂盒R&D)检测血清中细胞因子浓度。5.组织及细胞mRNA的抽提、反转录和Real-time PCR检测基因表达用TRIZOL Reagent (Invitrogen)抽提细胞的总 RNA。DNase37°C处理提取的 RNA,30min,以除去残余的DNA,加反应停止液(stop solution) Invitrogen65°C处理IOmin,灭7舌 DNclSG ο
用oligo(dT)18 引物(Takara)和 M-MLV 逆转录酶(promega)反转成 cDNA。用Real-time System(Bio-Rad)定量检测基因表达。用相对定量的方法，用iQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad)检测基因的表达，并以beta-actin作为内参。6.Western Blot检测蛋白的表达用强RIPA裂解液来裂解细胞(碧云天公司)，裂解前加入蛋白酶抑制剂PMSF(Sigma)和Cocktail (Sigma)，所有的操作均在冰上进行，蛋白保存于_80°C，并分装蛋白，防止反复冻融。跑胶前加入上样缓冲液，混匀，直接上样，样品不能加热变性。10% SDSPAGE胶分
离蛋白。7.巨噬细胞吞噬功能检测分离的腹腔巨噬细胞，在不含抗生素的培养基中按照MOI = 10: I加入细菌(E.col1-GFP)，孵育45分钟后，去上清，PBS洗涤3遍，将细胞从板上刮下，流式检测绿色荧光。8.巨噬细胞杀菌功能检测在重复的两块板上同时进行，分离的腹腔巨噬细胞，在不含抗生素的培养基中按照MOI = 10: I加入细菌(E.col1-GFP)，孵育20分钟后，去上清，PBS洗涤3遍。其中一块板中的细胞被裂解，梯度稀释，涂板37°C过夜，另一块再孵育90分钟，取上清后，裂解细胞，梯度稀释，涂板37°C过夜。9.HJV敲除小鼠的构建本领域技术人员可以使用通用和成熟的方法构建HJV敲除小鼠，如文献A mousemodel of juvenile hemochromatosis Franklin W.Huang, Jack L Pinkus，GeraldineS.PinkusiMark D.Fleming，Nancy C.Andrews J Clin Invest.2005 ；115(8):2187-2191所述。
实施例1HJV敲除小鼠对细菌易感性检测为了探究HJV在免疫系统中的作用，本发明人用各种细菌(鼠伤寒沙门氏菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌)感染HJV敲除的小鼠。结果(图1)发现，HJV敲除的小鼠对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有易感性。与正常小鼠相比，从腹腔注射鼠伤寒沙门氏菌(108)、大肠杆菌(108)和金黄色葡萄球菌(I X IO8)都会导致HJV敲除小鼠的过早死亡。图1a为正常小鼠和HJV敲除的小鼠对鼠伤寒沙门氏菌的易感性结果；图1b为正常小鼠和HJV敲除的小鼠对大肠杆菌的易感性结果；图1c为正常小鼠和HJV敲除的小鼠对金黄色葡萄球菌的易感性结果。图1a-图1c的横坐标为注射时间，纵坐标为小鼠的存活率(％ )。脏器蓄积结果表明。腹腔注射大肠杆菌，12h后，细菌在HJV敲除小鼠的腹腔及各主要脏器中蓄积增多(图1d和图1e)，图1d为正常小鼠和HJV敲除的小鼠的腹腔大肠杆菌数目统计结果，图1e为正常小鼠和HJV敲除的小鼠各主要脏器中大肠杆菌数目统计结果。该结果提示，HJV敲除的小鼠，其天然免疫实缺陷的，导致细菌在体内过度增殖，最终使得HJV敲除的小鼠过早死亡。由于HJV敲除的小鼠机体内铁水平较高，有利于细菌生长，为了排除铁代谢的影响，本发明人在低铁处理的小鼠体内进行了细菌致死实验，当低铁喂养的小鼠机体铁水平和野生型一致(未列出)，在某些脏器中甚至更低时，HJV敲除小鼠依然易感(图1f)。实施例2小鼠体内细胞因子的变化体液免疫是天然免疫的重要组成部分之一，在机体发生感染后，细菌的入侵会诱发机体内细胞因子的表达上调，细胞因子分泌增多，从而激活各种免疫细胞，清除入侵的细菌。将I X IO8的E.coli腹腔注射小鼠后，在不同的时间点进行眼眶取血，室温放置l-2h, 7000rpm条件下，4°C离心20min,取上清,用Elisa试剂盒检测细胞因子浓度。结果表明(图2)，与正常的感染细菌的小鼠相比，感染细菌后的HJV敲除小鼠体内原炎症因子TNFa和IL-6的血清浓度(图2a&2b)比野生型小鼠高，IFNy的分泌减少(图2c)，显示IFNy的生成有缺陷，而它的两个诱导因子IL-18和IL-12的分泌却是正常的(图 2d&2e)。为了控制定量的细菌数以及模拟体内的刺激模式，在体外实验中本发明人使用热灭活细菌作为刺激源。结果表明，在热灭活细菌的刺激下，巨噬细胞内免疫调控通路的蛋白磷酸化水平发生了变化，IL-12诱导stat4的磷酸化水平降低，而IL-18诱导IFN Y的关键因子P38的磷酸化水平和正常组相似(图2f)。图2显示细菌刺激后小鼠体内细胞因子的变化，IO8E.coli腹腔注射后，不同时间点眼眶采血，ELISA 检测细胞因子水平 a) TNF α (1.5h)、b) IL-6 (2.5h)、c) IFN y (6h)、d)IL-18(6h)、e)IL-12p40(2.5h)细菌感染6h后，流式检测细胞内IFN γ表达水平，以及f)体外热灭活菌刺激后，western检测巨噬细胞内信号通路的改变结果。实施例3IFNY分泌减少导致巨噬细胞杀伤功能减弱IFNy在免疫调控中的主要作用是激活巨噬细胞行使杀伤功能。将IO8的E.coli注射小鼠腹腔后，HJV敲除小 鼠的外周血内细胞迁移增多，且比正常对照组高一倍(图3a)。体外检测巨噬细胞的吞噬功能，发现HJV敲除小鼠的巨噬细胞的吞噬功能也略有增强(图3b)，而对外源细菌的杀伤功能变弱(图3c)。IFNy在早期主要由自然杀伤(NK)细胞分泌，作为IFNy响应细胞的巨噬细胞也会自分泌，从而发生自激活。为了探究HJV敲除巨噬细胞杀伤功能减弱是不是由于IFNy的分泌减少，体外用热灭活细菌刺激对照组和HJV敲除组的巨噬细胞，检测结果显示HJV敲除组的巨噬细胞自分泌IFNy的能力减弱(图3d)，而其它原炎症因子分泌正常(图3e)。IFNy对于激活巨噬细胞，产生抑菌因子具有非常重要的作用，和IFNy敲除小鼠相似，HJV敲除小鼠不能有效控制外源微生物在体内过度增殖，和对照组小鼠相比，HJV敲除小鼠死亡过早。热灭活细菌刺激下，HJV敲除巨噬细胞内IFN Y _stat4信号通路被削弱(图3f)，其下游的重要的活性酶iNOS的表达减少，虽然通过p38的诱导通路没有太多变化(图3h)，但是也不能挽救抑菌因子NO分泌减少的状况(图3g)。这一结果解释了巨噬细胞杀菌功能减弱的表型。图3为与对照组小鼠相比，HJV敲除小鼠感染后体内细胞功能变化结果；a) IO8E.coli腹腔注射后，外周血内白细胞变化；b)体外细胞吞噬功能检测；c)体外细胞杀菌功能检测；d)热灭活细菌体外刺激巨噬细胞24h，细胞因子IFN Y分泌；e)热灭活细菌体外刺激巨噬细胞24h，细胞因子IL-6分泌；f ) western检测巨噬细胞内IFN Y _stat4信号通路的改变；g)体外巨噬细胞NO分泌检测；h) western检测巨噬细胞内iNOS和p38信号通路的改变。实施例4HJV在免疫调节对抗外源微生物的作用本发明人通过细胞膜表面分子标记，免疫细胞流式分离检测发现，HJV在免疫细胞中存在广谱的较高水平表达(图4a) ;HJV在肝细胞中的表达对于调控机体铁代谢起到决定性作用，在炎症刺激状态下，肝脏中的HJV表达是下调的(图4b);在炎症条件下，HJV在巨曬细胞中的表达是上调的(图4c);而铁代谢中另一相关基因铁转运蛋白(Ferroportin)在炎症条件下，无论是肝脏还是巨噬细胞中均下调(图4d&4e)。由于感染状态下，HJV表达上调，本发明人在体外克隆HJV的质粒，在Raw264.7细胞中过表达。结果显示，在热灭活细菌或细菌模式分子LPS的刺激下，过表达HJV的Raw264.7细胞比转入空载体的细胞表达更多的iNOS，分泌更多的N0(图4f&4g)，由于Raw264.7含有内源性的HJV表达，在热灭活细菌的强刺激下，和转染空载体的对照相比，过表达HJV的Raw264.7分泌NO的增加幅度不是很大，但也具有显著性差异。图4显示HJV在免疫细胞中的表达及调控模式；a)正常小鼠各种免疫细胞通过表面标记通过流式分离，分别检测细胞内HJV的表达水平；在热灭活细菌刺激下，野生型小鼠肝脏中HJV表达b)，巨噬细胞内HJV表达c)，肝脏中FPN表达d)，巨噬细胞内FPN表达e)，f&g)热灭活细菌的刺激下，过表达HJV的Raw264.7细胞中iNOS的表达更多h)，也分泌更多NO。实施例5s-HJV蛋白增强HJV+小鼠抗感染能力HJV具有两种亚型，定位于细胞膜的HJV (m-HJV)和可溶形式的HJV (s_HJV)。s_HJV和m-HJV在H印cidin的调控作用上相拮抗。将s-HJV克隆入pet28a载体中，在BL21(DE3)系统中表达，通过镍柱、离子交换和分子筛分离纯化。
图5a显示s-HJV的分子筛纯化图谱，总共分离得到7个主峰，分别收集检测鉴定，其中5号峰得到分子量为32kD的s-HJV蛋白。体外细胞实验显示重组表达的s-HJV具有下调h印cidin表达的生物学活性(图5b)。将体外重组表达的可溶性HJV(s-HJV)预处理小鼠(腹腔注射生理盐水或者s-HJV 7mg/kg) 2h后，腹腔注射鼠伤寒杆菌(3*106/只)，实验结果显示s-HJV注射组存活时间延长(图5c)。以上结果显示s-HJV具有抗感染活性。讨论铁代谢和机体免疫一直以来息息相关，铁代谢相关基因不仅通过调控机体铁代谢和分布来参与机体免疫，近年来的研究发现，它们本身对机体免疫也有调控作用。本发明人经过广泛而深入的研究，结果表明，HJV(HemojuveIin)敲除小鼠不能像正常小鼠一样抵御外源微生物的感染，铁调素调节蛋白作为一个重要的铁代谢调控基因，其缺失不仅会导致铁在机体内的蓄积，而且导致机体免疫缺陷。为了排除机体铁对于体内细菌增殖的影响，本发明人用低铁喂养HJV敲除小鼠，8周后，小鼠体内铁水平显著低于正常小鼠机体铁水平。进行腹腔感染大肠杆菌的致死试验，结果显示，机体内过多的铁增加了 HJV敲除小鼠对细菌的易感，但却不是决定性因素。热灭活细菌预处理小鼠得到的急性相血清抑菌试验显示，和正常小鼠相比，HJV敲除小鼠的血清含有的抑菌因子的功能没有缺陷，表明HJV敲除小鼠体内较低水平的hepcidin，在感染后会有很高很快的回升，并不是直接导致HJV敲除小鼠易感的主要因素。以上实验结果都推向一个结论，HJV本身在机体免疫中行使重要的作用。腹腔注射活细菌，HJV敲除小鼠比正常小鼠死亡更多更快，而同等剂量热灭活细菌却不会导致这一表型，通过体内增殖试验，本发明人发现细菌在HJV敲除小鼠体内增殖的更快，显示HJV敲除小鼠存在免疫缺陷。通过感染后原炎症因子的血清水平检测发现，HJV敲除小鼠体内的IL-6和TNF α的分泌不仅没有减少，还略有增多，但是IFN Y的分泌是减少的，而它的两个重要调控因子IL-18和IL-12的分泌却是正常的，巨噬细胞中也有表达分泌。体外检测试验显示HJV敲除的巨噬细胞完全不分泌IFN Y。通过westernblot检测发现，在巨噬细胞内，IL-18诱导IFN Y的通路P38的磷酸化是正常的，而IL-12诱导stat4的磷酸化水平减弱。上述结果提示，HJV在IL-12诱导IFN Y分泌的途径中起到重要作用。IFNy对于激活巨噬细胞起到非常重要的作用，而巨噬细胞在腹腔中大量存在，是腹腔感染的第一道防线，本发明人分别从迁移，吞噬和杀菌三个方面来检验HJV敲除巨噬细胞的功能。感染后HJV敲除小鼠血液中的白细胞含量比正常小鼠要高一倍，体外实验显示HJV敲除的巨噬细胞吞噬能力较正常巨噬细胞略高，但在杀菌功能上有缺陷。IFNy的分泌直接导致iNOS的合成及其产物NO的分泌，由于NO是巨噬细胞的重要抑菌因子之一，IFN Y诱导iNOS的信号通路关键因子statl的磷酸化水平也降低了，相应的iNOS表达水平降低，NO分泌减少，巨噬细胞不能有效杀死细菌，从而导致细菌过度增殖。实验发现，热灭活细菌可以在体外诱导巨噬细胞内HJV表达水平的上调。而另一铁代谢相关基因FPN的表达都是下调的，过表达HJV的Raw264.7细胞中会分泌更多的NO，由于热灭活细菌的强刺激，Raw264.7细胞中本底的HJV表达也会上升，NO分泌已经达到一个很高水平，过表达的细胞中只有小幅度的增加，但具有显著性差异。因此本发明人的研究成果显示，在感染状态下，HJV在巨噬细胞中表达增加，协助几_12促进正^^的生成，从而激活巨噬细胞，表达iNOS，分泌NO，充分行使杀菌功能。这样HJV将铁代谢和免疫调控紧密联系在一起，作为一个免疫调控中的重要分子。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
权利要求
1.一种铁调素调节蛋白或其激动剂的用途，其特征在于，用于制备免疫调节剂，或用于制备抗感染药物组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述铁调素调节蛋白或其激动剂还用于: (B1)制备白介素IL-12的激动剂组合物；和/或 (bj促进干扰素IFNy的产生和分泌；和/或 (C1)上调一氧化氮合酶活性；和/或 (Cl1)促进一氧化氮NO的产生；和/或 G1)促进免疫细胞的杀菌功能。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的铁调素调节蛋白选自下组: (A)氨基酸序列如SEQID NO:1、3、5、7任一所示的多肽； (B)将SEQID NO:1、3、5、7任一所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的铁调素调节蛋白衍生物，或其活性片段。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述铁调素调节蛋白为s亚型(S-HJV)。
5.一种铁调素调节蛋白拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备下调白介素IL-12的活性的组合物，或用于制备白介素IL-12的拮抗剂组合物。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述组合物还用于: (a2)降低干扰素IFNy的产生和分泌；和/或 (b2)下调一氧化氮合酶活性；和/或 (C2)抑制一氧化氮NO的产生；和/或 (d2)抑制免疫细胞的杀菌功能。
7.一种铁调素调节蛋白、或其激动剂、或其拮抗剂的用途，其特征在于，用于: (1)调节白介素IL-12的活性；和/或 (2)调节干扰素IFNy的产生和分泌；和/或 (3)调节一氧化氮合酶活性；和/或 (4)调节NO的产生；和/或 (5)调节免疫细胞的杀菌功能。
8.一种方法，所述方法用于调节白介素IL-12活性、调节干扰素IFNy的产生和分泌、调节一氧化氮合酶活性、调节NO的产生、调节免疫细胞的杀菌功能，其特征在于，所述方法包括步骤:改变铁调素调节蛋白的表达或活性；或添加铁调素调节蛋白的激动剂；或添加铁调素调节蛋白的拮抗剂。
9.一种筛选调节免疫细胞杀菌功能的化合物的方法，其特征在于，包括步骤: (i)在测试组中，在测试化合物存在情况下培养免疫细胞，并测定铁调素调节蛋白的水平或活性；并且在对照组中，在不存在测试化合物情况下培养免疫细胞，并测定铁调素调节蛋白的水平或活性； ( )比较测试组和对照组的铁调素调节蛋白水平或活性，如果测试组的铁调素调节蛋白水平或活性显著高于对照组，则提示该物质是上调免疫细胞杀菌功能的化合物；如果测试组的铁调素调节蛋白水平或活性显著低于对照组，则提示该物质是下调免疫细胞杀菌功能的化合物。
10.一种筛选调节炎性反应相关蛋白水平或活性的化合物的方法，其中杀伤相关相关蛋白是干扰素IFNy或一氧化氮合酶，其特征在于，包括步骤: (a)在测试组中，在测试化合物存在情况下培养免疫细胞，并测定铁调素调节蛋白的水平或活性；并且在对照组中，在不存在测试化合物情况下培养免疫细胞，并测定铁调素调节蛋白的水平或活性； (b)比较测试组和对照组的铁调素调节蛋白水平或活性，如果测试组的铁调素调节蛋白水平或活性显著高于对照组，则提示该物质是上调炎性反应相关蛋白的化合物；如果测试组的铁调素调节蛋白水平或活性显著低于对照组，则提示该物质是下调炎性反应相关蛋白的化合 物。
全文摘要
本发明涉及铁调素调节蛋白对机体免疫的调节作用及其应用，具体地，铁调素调节蛋白或其激动剂可以用于制备免疫调节剂，或用于制备抗感染药物或白介素IL-12的激动剂组合物；铁调素调节蛋白拮抗剂用于制备下调白介素IL-12的活性的组合物或白介素IL-12的拮抗剂组合物，本发明还提供了一种筛选调节免疫细胞杀菌功能的化合物的和调节炎性反应相关蛋白水平或活性的化合物的方法。
文档编号A61K45/00GK103169948SQ20111043604
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者王福俤, 沈媛媛, 陶云龙, 吴谦 申请人:中国科学院上海生命科学研究院