外周血流紊乱的治疗剂

本发明涉及再生医学中的细胞制剂。更具体地，本发明涉及含有对外周动脉疾病等的外周血流紊乱的血管再生疗法有效的多能干细胞的细胞制剂。

背景技术：

65岁及以上的老年人口比例的增长速度大大快于预期。

另一方面，随着饮食习惯的西化以及以机动社会为中心的生活方式的改变，产生了代谢综合症等的新的生活习惯病的概念，社会的疾病结构发生了巨大的变化。特别地，动脉硬化性疾病在增加，缺血性心脏病在增加，同时，外周动脉疾病(pad:peripheralarterialdisease)也在增加。

pad主要指四肢的慢性动脉闭塞症，包括闭塞性动脉硬化症(aso:arteriosclerosisobliterans)、血栓闭塞性脉管炎(tao:thromboangiitisobliterans、常说的柏格氏症)、腘窝动脉捕捉综合症等。

pad表现为称为缺血肢体的足部症状。然而，它不单单是足部的疾病，而是以年龄增长和糖尿病为背景的动脉硬化引起的外周血管闭塞，表现为缺血肢体。因此，pad多伴有同为动脉硬化性疾病的缺血性心脏病以及脑部疾病。据说预后非常不好，死亡率比恶性肿瘤还高。通过早期发现进行适当的治疗很重要。

目前pad的治疗方针是针对下肢的循环紊乱，针对全身的主要器官(脑、心脏、肾脏)以及针对动脉硬化的危险因素(吸烟、糖尿病、高脂血症、高血压、肥胖症、缺乏运动、压力大等)等，作为治疗方法大致分为内科治疗和外科治疗。

作为pad的内科治疗，有运动疗法、热疗等理学疗法，也有如西洛他唑、贝前列素钠、盐酸沙格雷酯、盐酸噻氯匹定、二十碳五烯酸乙酯、前列地尔、前列地尔α-环糊精包合物、阿加曲班、巴曲酶、己酮可可碱等的抗血小板药、抗血栓药以及血管扩张药等为首的药物疗法。

另外，作为pad的外科治疗，进行球囊扩张、支架放置和旋切术等的血管内治疗，以及血栓动脉内膜切除术、旁路手术、交感神经切除术等的外科手术。

然而，当下肢坏死严重时，进行上述内科的治疗和外科的治疗也得不到效果的情况也很多，在这种情况下，有很多患者为了救命而截肢。

因此，在包括闭塞性动脉硬化症(aso:arteriosclerosisobliterans)、血栓闭塞性脉管炎(tao:thromboangiitisobliterans、常说的柏格氏症)、腘窝动脉捕获综合症等的pad中，期望一种新的治疗方法，能够实现血管再生、基于此的下肢缺血改善效果等。

近年来，在该pad的治疗中已经进行了再生医学的研究。

作为其中之一，报道了在成人骨髓和外周血单核细胞中存在可以分化为血管内皮细胞的血管内皮前体细胞，并且证实，在下肢缺血动物模型中，骨髓源性单核细胞移植通过血管生成和侧支血液循环路的发展而发挥下肢血流量增加的作用。(非专利文献1)

然而，通过骨髓单核细胞移植进行的治疗需要大量的骨髓液采集，且是高度侵入性的，另外，由于是新鲜分离的细胞，骨髓细胞中干细胞和前体细胞数量存在个体差异，导致临床效果差异很大，以上都已经很明确。

此外，报道了作为使用间充质干细胞的该再生医学的研究，使用了大鼠下肢缺血模型、小鼠下肢缺血模型和兔下肢缺血模型，通过移植间充质干细胞可促进血管再生、改善下肢缺血。(非专利文献2、非专利文献3、非专利文献4)

然而，不能说再生医学的效果是充分的，例如不能看到移植细胞对血管的长期附着和分化为血管构成细胞。

一方面，根据本发明的发明人之一的出泽的研究：已知存在于间充质细胞级分中的、无需基因导入或细胞因子等诱导操作就能获得的、将ssea-3(阶段特异性胚胎抗原-3，stage-specificembryonicantigen-3)作为表面抗原表达的多能干细胞(多系分化持续应激细胞，multilineagedifferentiatingstressenduringcells；muse细胞)承担着间充质细胞级分所具有的多能性，有可能应用于以组织再生为目标的疾病治疗中(例如，专利文献1；非专利文献5至7)。然而，并没有明确在外周动脉疾病的治疗中使用muse细胞，并得到期待的治疗效果的例子。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：专利第5185443号说明书

专利文献2：国际公开第wo2011/007900号小册子

非专利文献

非专利文献1：houx等人，molbiolrep37:1467-1475(2010)

非专利文献2：liuj.,haoh.,xial.等人，hypoxiapretreatmentofbonemarrowmesenchymalstemcellsfacilitatesangiogenesisbyimprovingthefunctionofendothelialcellsindiabeticratswithlowerischemia.plosone.2015；10(5)。

非专利文献3：xien.,liz.,adesanyat.m.等人，transplantationofplacenta-derivedmesenchymalstemcellsenhancesangiogenesisafterischemiclimbinjuryinmice.journalofcellularandmolecularmedicine.2016；20(1):29-37。

非专利文献4：cunpingyin,yuanliang,jianzhang,guangpingruan,zianli,rongqingpang,以及xinghuapan,umbilicalcord-derivedmesenchymalstemcellsrelievehindlimbischemiathroughenhancingangiogenesisintreeshrews.stemcellsinternational,2016(2016)卷,articleid9742034,9页。

非专利文献5：kuroday等人，procnatlacadsciusa，2010:107:8639-8643。

非专利文献6：wakaos等人，procnatlacadsciusa，2011:108:9875-9880。

非专利文献7：kuroday等人，natprotc,2013:8:1391-1415。

非专利文献8：kondok等人，arterioscler.thromb.vasc.biol.2009；29:61-66。

技术实现要素：

发明要解决的课题

本发明的目的是提供一种用于治疗包含外周动脉疾病的外周血流紊乱的细胞制剂。

用于解决课题的手段

本发明人发现，在小鼠下肢缺血模型中，通过从血管等或直接向受试者的外周动脉部位及其周边施用人muse细胞，muse细胞在受伤的外周动脉部位聚集、附着，以再生发生紊乱的外周动脉部位的血管，使得外周动脉部位的血管紊乱改善或恢复，于是发现muse细胞适用于治疗包含外周动脉疾病的外周血流紊乱，从而完成本发明。

即，本发明如下：

[1]一种用于治疗外周血流紊乱的细胞制剂，所述细胞制剂包含源自生物体间充质组织或培养的间充质细胞的ssea-3阳性的多能干细胞。

[2]根据[1]所述的细胞制剂，其中，所述外周血流紊乱是外周动脉疾病。

[3]根据[2]所述的细胞制剂，其中，所述外周动脉疾病是四肢的慢性动脉闭塞症。

[4]根据[2]或[3]所述的细胞制剂，其中，所述外周动脉疾病是闭塞性动脉硬化症。

[5]根据[2]或[3]所述的细胞制剂，其中，所述外周动脉疾病是血栓闭塞性脉管炎(柏格氏症)。

[6]根据[2]或[3]所述的细胞制剂，其中，所述外周动脉疾病是腘窝动脉捕捉综合症。

[7]根据上述[1]至[6]中任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞是具有以下所有性质的多能干细胞：

(i)端粒酶活性低或无；

(ii)具有分化为三胚层中任一胚层的细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；以及

(iv)具有自我更新能力。

[8]根据上述[1]至[6]中任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞是具有以下所有性质的多能干细胞：

(i)ssea-3阳性；

(ii)cd105阳性；

(iii)端粒酶活性低或无；

(iv)具有分化为三胚层中任一胚层的能力；

(v)不显示肿瘤性增殖；以及

(vi)具有自我更新能力。

[8]一种源自生物体间充质组织或培养的间充质细胞的ssea-3阳性的多能干细胞在制造用于治疗外周血流紊乱的细胞制剂中的用途。

[9]一种治疗外周血流紊乱的方法，其包括将上述[1]至[7]中任一项所述的细胞制剂的有效量向对需要治疗的患者施用的步骤。

[10]根据[9]所述的治疗外周血流紊乱的方法，其中，所述细胞制剂是在静脉内施用的。

[11]根据[9]或[10]所述的治疗外周血流紊乱的方法，其中，所述细胞制剂多次施用。

发明的效果

本发明中，对于患有外周动脉疾病等的外周血流紊乱的受试者，通过从血管等或直接向受试者的外周血管部位及其周边施用muse细胞，muse细胞在受损的外周血管部位聚集、附着，以再生发生紊乱的外周血管部位的血管，能够改善或恢复外周血管部位的血流紊乱。

muse细胞能够有效地游走于受损的外周血管部位并附着，在附着的部位形成血管，在移植之前不需要分化诱导治疗受试者的细胞。此外，它是非致瘤性的，具有出色的安全性。另外，由于muse细胞不会被免疫排斥，因此也可以通过从供体制造的异体制剂进行治疗。因此，通过具有上述出色性能的muse细胞，可以为患有外周动脉疾病等的外周血流紊乱的患者提供容易实施的治疗手段。

对于间充质干细胞和自体骨髓细胞，细胞难以通过静脉施用到达紊乱部位，或者即使到达了紊乱部位，由于其效率非常低，通常会通过肌肉注射来施用，但肌肉注射存在连续治疗困难的问题。相比之下，muse细胞等仅通过静脉施用就可以选择性地到达、聚集到紊乱部位，并且由于是静脉施用而能够多次施用。这些事实表明，通过多次治疗可以得到比间充质干细胞和自体骨髓细胞更好的治疗效果。

附图说明

[图1]图1是示出了将各细胞施用于下肢缺血模型小鼠(裸鼠)时的血流激光多普勒测定的结果的图表。纵轴表示缺血肢体/非缺血肢体的血流比。在图中，ve：vehicle(载剂)、bm：bonemarrow、nmuse：nonmuse细胞(非muse细胞)、muse：muse细胞。

[图2]图2是示出了在施用各细胞后，第6天测定作为血管生成因子的血管生成关联基因的表达量的结果的图表。

[图3]图3是示出了在施用各细胞后，第28天测定缺血骨骼肌的血管密度的结果的照片。左边表示muse细胞施用，右边表示vehicle。

[图4]图4是示出了将muse细胞、非muse细胞、bmmnc(骨髓单核细胞)或pbs注射到肌肉或静脉中的balbc小鼠缺血后肢中的血流激光多普勒分析的结果的图。a示出了缺血肢体/非缺血肢体的血流比的经时变化(**p<0.01pbsvs.musei.v.,##p<0.01nonmusei.v.vs.musei.v.)；b表示术后7日，c表示术后14日的血流比(**组间的显著差异(p0.01))。另外，结果用平均值±sem(n＝5)表示，b和c中的点对应于每只小鼠。

[图5]图5是示出了pbs或muse细胞施用14天后的缺血性内收肌的组织切片用抗cd31抗体和dapi染色的结果的图(显微镜照片)。比例尺为50μm。

具体实施方式

本发明涉及一种用于治疗外周血流紊乱的、包含ssea-3阳性的多能干细胞(muse细胞)的细胞制剂。下面将详细说明本发明。

1.适用疾病

本发明的包含ssea-3阳性多能干细胞(muse细胞)的细胞制剂在治疗外周动脉疾病中使用。

在本发明中，“外周血流紊乱”是指由于外周血管的紊乱、交感神经的紊乱等导致外周血流减少而引起的紊乱。

作为外周血管的紊乱，可例举外周动脉疾病(pad:peripheralarterialdisease)和外周静脉疾病。

“外周动脉疾病”包括器质性外周动脉疾病和功能性外周动脉疾病，作为器质性外周性动脉疾病，可例举闭塞性动脉硬化症(aso:arteriosclerosisobliterans)、血栓闭塞性脉管炎(tao:thromboangiitisobliterans、常说的柏格氏症)、急性动脉闭塞症(包括急性动脉栓塞症、急性动脉血栓症)、大动脉炎综合症、白塞氏病、腘窝动脉捕捉综合症、腘窝动脉外膜囊肿、遗存坐骨动脉等，作为功能性外周动脉疾病可例举雷诺氏病等。

作为“外周动脉疾病”，优选与四肢的慢性动脉闭塞症相对应的疾病，并且在上述疾病中，优选为闭塞性动脉硬化症、血栓闭塞性脉管炎以及腘窝动脉捕捉综合症。

作为雷诺氏病，包括一次性雷诺氏综合症和二次性雷诺氏综合症，其原因没有特别限定：由胶原病引起的、由外伤引起的、由振动引起的、由胸廓出口综合症引起的、由慢性闭塞性动脉疾病引起的、由血液疾病引起的、由神经疾病引起的等等。

作为“外周静脉疾病”，可例举静脉血栓症(深静脉血栓症等)、慢性静脉功能不全、下肢静脉瘤、静脉瘤性湿疹和静脉瘤性溃疡。

作为交感神经紊乱，可例举交感神经的反射异常，包括反射性交感神经性萎缩症、灼热性神经痛、幻肢痛、中枢性疼痛等的引起外周血流紊乱的交感神经的紊乱。

2.细胞制剂

(1)多能干细胞(muse细胞)

在本发明的细胞制剂中使用的多能干细胞是本发明的发明人之一的出泽发现其存在于生物体内、并命名为“muse(多系分化持续应激)细胞”的细胞。已知muse细胞除了可以从骨髓液、脂肪组织(ogura，f.，等人，stemcellsdev.，nov20，2013(epub)(发表于2014年1月17日))和皮肤的真皮结缔组织等获得之外，还广泛存在于组织和器官的结缔组织中。此外，该细胞是兼具多能干细胞和间充质干细胞性质的细胞，例如，作为细胞表面标记物的“ssea-3(阶段特异性胚胎抗原-3(stage－specificembryonicantigen－3))”阳性细胞、优选地作为ssea-3阳性和cd-105阳性的双重阳性细胞被识别。因此，muse细胞或包含muse细胞的细胞集团例如，可以以ssea-3单独或ssea-3和cd-105的表达作为指标从生物体组织中分离出来。专利文献2(国际公开第wo2011/007900号)中公开了muse细胞的分离方法、识别方法、以及特征等的详细内容。此外，利用muse细胞对各种外部应激的高抗性，在蛋白水解酶处理、低氧条件、低磷酸条件、低血清浓度、低营养条件、暴露于热休克，有害物质存在下、活性氧存在下、机械刺激下和压力处理下等各种外部应激条件下对其进行培养，可以选择性地浓缩muse细胞。另外，在本说明书中记载了在作为用于治疗外周动脉疾病的细胞制剂中，使用ssea-3作为指标从生物体间充质组织或培养的间充质组织制备的多能干细胞(muse细胞)或包含muse细胞的细胞集团可简称为“ssea-3阳性细胞”。此外，在本说明书中，“非muse细胞”是生物体间充质组织或培养的间充质细胞中所含的细胞，是指“ssea-3阳性细胞”以外的细胞。

可以以细胞表面标记物ssea-3或ssea-3和cd-105作为指标，从生物体组织(例如，间充质组织)中制备muse细胞或包含muse细胞的细胞集团。此处，“生物体”是指哺乳动物的生物体。在本发明中，生物体不包括受精卵以及发育阶段在囊胚期之前的胚胎，但包括胎儿以及包含囊胚的发育阶段在囊胚期之后的胚胎。对于哺乳动物没有特别限制，但可例举人、猴子等的灵长类；小鼠、大鼠和豚鼠等的啮齿；兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、驴、山羊、雪貂等。在本发明的细胞制剂中使用的muse细胞因其直接通过具有的标记物与生物体的组织分离而与胚胎干细胞(es细胞)和ips细胞有明显区别。此外，“间充质组织”是指骨、滑膜、脂肪、血液、骨髓、骨骼肌、真皮、韧带、肌腱、牙髓、脐带、脐带血、羊膜等组织和存在于各种器官中的组织。例如，muse细胞可获自骨髓、皮肤、脂肪组织、血液、牙髓、脐带、脐带血、羊膜等。例如，优选地采集生物体间充质组织，从该组织制备muse细胞并进行利用。此外，也可以使用上述制备手段从成纤维细胞和骨髓间充质干细胞等培养的间充质细胞制备muse细胞。

此外，包含本发明的细胞制剂中使用的muse细胞的细胞集团可以通过以下方法来制备：所述方法包括对生物体间充质组织或培养的间充质细胞施加外部应激刺激以选择性地增殖对该外部应激具有抗性的细胞并回收提高了其存在比率的细胞。

所述外部应激可以为蛋白酶处理、低氧浓度培养、低磷酸条件下培养、低血清浓度培养、低营养条件下培养、热休克暴露下培养、低温培养、冷冻处理、有害物质存在下培养、活性氧存在下培养、机械刺激下培养、振动处理中培养、压力处理下培养或物理冲击中的任何一个或多个组合。

为了对细胞施加外部应激，进行所述蛋白酶处理时间优选地合计为0.5至36小时。此外，蛋白酶浓度为将粘附于培养容器上的细胞剥离时使用的、将细胞团分散为单个细胞时使用的或从组织中回收单个细胞时使用的浓度即可。

所述蛋白酶优选地为丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或n-末端苏氨酸蛋白酶。此外，所述蛋白酶优选地为胰蛋白酶、胶原酶或中性蛋白酶。

另外，在本发明的细胞制剂中，所使用的muse细胞对于接受细胞移植的受体可以是自体的或异体的。

如上所述，已知muse细胞或包含muse细胞的细胞集团例如可以以ssea-3阳性或ssea-3和cd-105双重阳性作为指标从生物体组织制备，而人的成人皮肤中包含各种类型的干细胞和前体细胞。但是，muse细胞与这些细胞不同。这样的干细胞和前体细胞例如，皮肤源性前体细胞(skp)、神经嵴干细胞(ncsc)、成黑素细胞(mb)、血管周细胞(pc)、内皮前体细胞(ep)和脂肪源性干细胞(adsc)。可以以这些细胞特有的标记物的“非表达”作为指标来制备muse细胞。更具体地，muse细胞可以将从cd34(ep和adsc的标记物)、cd117(c-kit)(mb的标记物)、cd146(pc和adsc的标记物)、cd271(ngfr)(ncsc的标记物)、ng2(pc的标记物)、vwf因子(血管性血友病因子)(ep的标记物)、sox10(ncsc的标记物)、snai1(skp的标记物)、slug(skp的标记物)、tyrp1(mb的标记物)和dct(mb的标记物)组成的组中选择的11种标记物中的至少一种，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种标记物的非表达作为指标进行分离。例如但没有特别限制，可以以cd117和cd146的非表达作为指标进行制备，进一步地，可以以cd117、cd146、ng2、cd34、vwf和cd271的非表达作为指标进行制备，更进一步地，可以以上述11个标记物的非表达作为指标进行制备。

此外，在本发明的细胞制剂中使用的具有上述特征的muse细胞可以从如下：

(i)端粒酶活性低或无；

(ii)具有分化为三胚层中任一胚层的细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；以及

(iv)具有自我更新能力

组成的组中选择具有至少一种性质。优选地，本发明的细胞制剂使用的muse细胞具有所有上述性质。

此处，关于上述(i)，“端粒酶活性低或无”是指，例如，当使用trapezexltelomerasedetectionkit(millipore公司)检测端粒酶活性时，其检测值低或不能被检测到。端粒酶活性“低”是指，例如，具有与作为体细胞的人成纤维细胞相同水平的端粒酶活性，或具有的端粒酶活性为hela细胞的1/5以下，优选地为1/10以下。

关于上述(ii)，muse细胞具有在体外和体内分化为三胚层(内胚层系、中胚层系和外胚层系)的能力，例如，在体外进行诱导培养，可分化为肝细胞(包含肝芽细胞或表达肝细胞标记物的细胞)、神经细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、骨细胞、脂肪细胞等。此外，当体内移植到精巢中时，其也有显示出分化为三胚层的能力的情况。进一步地，其具有通过静脉注射移植到生物体中在受伤器官(心脏、皮肤、脊髓、肝、肌肉等)中游走和生存、并根据组织分化成细胞的能力。

关于上述(iii)，muse细胞具有如下性质，即以增殖速度约为1.3天进行增殖，通过悬浮培养从1个细胞开始增殖，并形成胚状体样细胞团，当达到一定大小时，其会在14天左右停止增殖。当将这样的胚胎样细胞团转移到粘附培养时，细胞再次开始增殖，并且从细胞团中增殖的细胞以约1.3天的增殖速率扩增。进一步地，当移植到精巢中时，其具有至少半年不癌变的性质。

此外，关于上述(iv)，muse细胞具有自我更新(自我复制)能力。此处，“自我更新”是指能够确认到由1个muse细胞通过悬浮培养而培养获得的胚状体样细胞团中所包含的细胞向3胚层性细胞进行分化，同时通过对胚状体样细胞团的细胞重新将其1个细胞转移至悬浮培养，使其形成下一代的胚状体样细胞团，并且确认到其重新向3胚层性的分化以及悬浮培养中的胚状体样细胞团。自我更新重复1次或者多次周期即可。

(2)细胞制剂的制备和使用

本发明的细胞制剂没有特别限制，可以将上述(1)中获得的muse细胞或包含muse细胞的细胞集团悬浮于生理盐水或适当的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲生理盐水)中而获得。在这种情况下，如果在从自体或异体组织分离的muse细胞的数量少的情况下，则可以在细胞移植之前对其进行培养，直至增殖至获得预定的细胞数为止。另外，如报道的那样(国际公开第wo2011/007900号小册子)，由于muse细胞不会肿瘤化，因此即使从生物体组织中回收的细胞包含未分化的状态，其癌化的顾虑很低，因此很安全。此外，回收的muse细胞的培养没有特别限制，可以在普通的增殖培养基(例如，包含10％小牛血清的α-最小必需培养基(α-mem)等)中进行。有关更多细节，请参见上述wo2011/007900小册子，并且在培养和增殖muse细胞时，适当地选择培养基、添加剂(例如，抗生素、血清)等，并可以制备包含预定浓度的muse细胞的溶液。当将本发明的细胞制剂施用于人受试者时，从人肠骨中采集骨髓液，例如，在培养作为来自骨髓液的粘结细胞的骨髓间充质干细胞、增加细胞数量直至获得达到有效治疗量的muse细胞后，可以将muse细胞以ssea-3的抗原标记物作为指标分离，将自体或异体的muse细胞作为细胞制剂进行制备。或者例如，将从骨髓液获得的骨髓间充质干细胞在外部应激条件下培养以增殖muse细胞直到达到有效治疗量并进行浓缩后，将自体或异体的muse细胞作为细胞制剂进行制备。

此外，当在细胞制剂中使用muse细胞时，为了保护该细胞，可以使细胞制剂中含有二甲基亚砜(dmso)和血清白蛋白等、含有抗生素等以防止细菌的混入和增殖。进一步地，细胞制剂中可以含有制剂上容许的其他成分(例如，载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、舒缓剂、稳定剂、防腐剂、抗菌剂、生理盐水等)。本领域技术人员可以将这些因子和试剂以适当的浓度添加到细胞制剂中。如上所述，muse细胞也可以作为包含各种添加剂的药物组合物使用。

上述制备的细胞制剂中所含有的muse细胞数考虑了受试者的性别、年龄、体重、患部的状态、所用细胞的状态等，从而可以在治疗外周血流紊乱中获得期望的效果，并且可以对其进行适当地调整。另外，作为受试者的个体包含但不限于人等哺乳动物。此外，本发明的细胞制剂可以多次(例如，2至10次)以适当的间隔(例如，每天两次、每天一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次)施用，直至获得期望的治疗效果。因此，作为治疗上的有效量，根据受试者的状态而定，例如，优选地每一个个体一次1×10³个细胞至1×10¹⁰个细胞1至10次的施用量。对于每一个个体施用总剂量没有特别限制，例如，1×10³个细胞至1×10¹¹个细胞，优选地1×10⁴个细胞至1×10¹⁰个细胞，更优选地1×10⁵个细胞至1×10⁹个细胞。

在本发明的细胞制剂中使用的muse细胞具有在受损的外周血管部位游走、附着的性质。因此，细胞制剂的施用部位和施用形式没有特别限定，也可以通过向外周血流紊乱部位或其附近注射等方法局部施用，也可以通过向血管内注射等方法施用。被施用的血管的种类(静脉及动脉)没有特别限定，根据疾病适当地进行选择，但优选为静脉内注射，通过多次进行静脉内注射，能够长期维持治疗效果，所以更优选。

本发明的细胞制剂可以再生患有外周血流紊乱的患者的发生紊乱的外周血管部位的血管。

在下文中，通过实施例对本发明进行进一步具体说明，但是本发明并非仅限于这些实施例。

实施例

实施例1：下肢缺血模型小鼠的制备

本实施例中使用小鼠的实验方案符合“京都府立医科大学动物实验等相关规则”，并且根据该规则在京都府立医科大学动物实验中心的监督下制备实验动物。更具体地，是通过以下步骤制备的。

通过吸入异氟烷麻醉(诱导时：4％，维持时：2％)8-10周龄的雌性balb/c裸鼠。切开下肢，在立体显微镜(konanoperationmicroscopekom)下用5-0丝线结扎左股总动静脉以及左股浅动静脉的外周。如此制备的小鼠在以下的实验中用作下肢缺血模型小鼠。

实施例2：人muse细胞的制备

根据涉及人muse细胞的分离及识别的国际公开第wo2011/007900号中记载的方法获得muse细胞。市售的间充质干细胞(msc，lonza公司)被用作muse细胞的来源。用于移植的muse细胞表达绿色荧光蛋白(gfp)，以确认其已附着至受损的外周动脉部位，并预先将慢病毒gfp基因导入muse细胞中，从而对细胞进行标记。通过facs将gfp标记的muse细胞作为gfp和ssea-3的双重阳性细胞分离出来。此外，从msc中分离出muse细胞的剩余细胞作为非muse细胞使用。此外，gfp阳性msc也通过facs分离，作为msc组使用。

实施例3：向下肢缺血模型小鼠施用各细胞

将实施例1中制备好的下肢缺血模型小鼠分成4组，在模型制备后的第1天，将muse细胞(3×10⁴个、100μl)(muse)、非muse细胞(3×10⁴个、100μl)(nmuse)、msc(2×10⁵个、100μl)(bm)或vehicle(磷酸缓冲液)(ve)向各组的小鼠的左大腿分两个部位施用。一组中的动物数量为5只。

实施例4：通过激光多普勒进行随时间变化的下肢血流评估

制备下肢缺血模型小鼠后0、3、7、10和14天，使用二维激光血流成像装置[激光多普勒灌注图像(ldpi)分析仪(laserdopplerperfusionimage(ldpi)analyzer)(omegazoneoz-1,omegawave,inc.tokyo,japan)]测定血流。测定各个体的左右两边下肢血液，并计算左侧(患侧)/右侧(健康侧)的比，将其作为ldpi指数。

如图1所示，muse细胞组的血流在14天后也继续改善，缺血的左下肢的血流改善到了与健康的右下肢相同的程度。另一方面，非muse细胞组(nmuse)、msc组(bm)以及vehicle组(ve)在第10天之前都显示出一定的血流改善，但在14天后未见改善。

实施例5：作为血管生成因子的血管生成关联基因的表达量的测定

细胞施用后第6天，提取左侧(患侧)下肢骨骼肌的mrna，使用实时(real-time)rt-pcr的绝对定量法测定作为血管生成关联基因的代表性vegf和bfgf(特别是fgf-2)的表达量。测定方法基于非专利文献8进行。结果如图2所示。与vehicle组相比，muse细胞组的这些作为血管生成因子的血管生成关联基因(mrna)的表达量明显较高。

实施例6：缺血骨骼肌中血管密度的测定

细胞施用后28天，左侧(患侧)下肢骨骼肌组织用4％多聚甲醛(paraformaldehude:pfa)固定以制备石蜡切片，然后用抗isolectings-ib4抗体alexafluor568conjugate(thermofisherscientific公司，整300倍稀释使用)对缺血下肢骨骼肌中的血管内皮细胞进行免疫组织化学染色，并测定每根骨骼肌纤维中的血管内皮细胞的比例作为血管密度。结果如图3所示。与vehicle组(图3右)相比，在muse细胞组(图3左)中可以看出这些缺血骨骼肌内的血管密度较高。

实施例7：使用野生型小鼠在下肢缺血模型中的评估

使用野生型balbc小鼠(雄性12周龄)，以与实施例1相同的方式制备下肢缺血模型小鼠。将制备好的下肢缺血模型小鼠分成几组，在模型制备后的第1天，向各组的小鼠的尾部静脉内(i.v.)或肌肉内(i.m.)注射muse细胞(3×10⁴个细胞，200μl)(muse)、非muse细胞(3×10⁴个细胞，200μl)或骨髓单核细胞(2×10⁵细胞，200μl)(bmmnc)。作为对照，将pbs注射到尾部静脉中。一组中的动物数量为5只。

与实施例4相同地，在术前、术后不久、术后第1天、第3天、第7天、第14天，通过激光多普勒血流分析仪对各组的血流进行评估，测定缺血后肢和非缺血后肢的血流量，计算出其比。结果如图4的a所示。此外，在图4的b和c中还示出了第7天和第14天的结果。

结果表明，在野生型小鼠中，人muse细胞在肌注和静注中也都能改善下肢的缺血。人muse细胞静注与muse细胞肌注、以及小鼠自体骨髓单核细胞肌注有大致相同的效果，表明muse细胞从静脉到达患部并附着，发挥了改善缺血的效果。

接下来，在术后第14天采集对照组或muse细胞静注组的小鼠的缺血性内收肌，进行组织分析。将采集到的缺血性内收肌在4％的pfa中固定1小时，然后在30％的蔗糖溶液中孵育过夜。然后，将组织包埋在最佳裂解温度(oct)化合物(sakurafinetek)中，在液氮中速冻并在低温恒温器上裂解。将组织切片与兔抗cd31(ab182981；abcam)以1：5000的稀释度孵育过夜。山羊抗兔alexa594(abcam)被用作二抗。用具有dapi(赛默飞公司)的prolonggoldantifade固定后，使用bzx800光学显微镜(keyence公司)进行成像。结果如图5所示。在施用muse的组中，作为内皮细胞标记物的cd31的表达显著增强，表明muse细胞促进了缺血后肢的血管生成并改善了缺血状态。

产业上的可利用性

本发明的细胞制剂通过施用于患有外周动脉疾病等的外周血流紊乱的受试者，(muse细胞)在受损的外周血管部位中聚集、附着，以再生发生紊乱的外周血管部位的血管，能够改善或恢复外周血管部位的血流紊乱。