一种广藿香提取液的制备方法及其应用与流程

技术领域：
：本发明涉及中药制剂的制备方法及应用，具体涉及广藿香提取液的制备方法及其应用。
背景技术：
：：糖尿病是最常见的慢性疾病。据统计，2017年全球约有4.51亿人患有糖尿病，成人糖尿病患病率高达8.4%。糖尿病主要有两种类型：1型糖尿病(胰岛素依赖型)和ⅱ型糖尿病(非胰岛素依赖型)，前者是由胰岛β-细胞功能衰竭、胰岛素分泌绝对不足而致；后者是胰岛素相对不足与胰岛素抵抗（ir）所致，其中，ⅱ型糖尿病占比高达90%以上。而胰岛素抵抗（ir）是ⅱ型糖尿病的病理基础，主要表现在脂肪、肝脏和骨骼肌等三大外周组织，其中脂肪是率先发生ir的部位。目前关于ir的发生机制尚未有明确的定论，但众多研究发现ir的发生与胰岛素信号转导、脂肪分化和脂肪因子的分泌，以及炎症反应密切相关。因此胰岛素抵抗的发生并不是由单一的机制影响造成，而是由多途径，多方面共同影响的结果。3t3-l1前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化能力的特异性的前体细胞，在体外诱导后能分化为脂肪细胞，用诱导因子刺激可产生胰岛素抵抗，是体外研究胰岛素抵抗机制和降糖药物作用机制的重要细胞模型。脂肪细胞分为两种，未分化的前脂肪细胞又称小脂肪细胞，分化完全的脂肪细胞又称大脂肪细胞，大脂肪细胞对胰岛素具有高敏感性，其数量的增多和体积的增大对脂肪的积累起着关键作用。脂肪组织不仅是能量储存器官和内分泌器官，而且是胰岛素作用的主要靶组织，在维持胰岛素敏感性和糖脂代谢平衡中起着至关重要的作用。有研究发现脂肪细胞分化后可抑制ir，其机制主要是小脂肪细胞数量增多，细胞膜上胰岛素受体增多，敏感性增强，促进外周组织对葡萄糖信号的转导，通过pparγ-rxr结合于靶基因启动子上的ppre，激活脂肪组织特异性的基因表达，从而促进前脂细胞的分化。因此脂质的生成表明具有增强胰岛素敏感性和摄取葡萄糖的能力，ir的病理状态也能大大改善。由多潜能性3t3-l1成纤维细胞分化而来的脂肪样细胞是研究糖脂代谢相关性基础研究最常用的体外模型之一，可由3t3-l1前脂肪细胞在体外通过3-异丁基-1-黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，ibmx)、地塞米松(dexamethason，dex)和胰岛素联合诱导分化而成。广藿香又名刺蕊草、南藿香，该品为唇形科植物广藿香pogostemoncablin(blanco)benth.的干燥地上部分。按产地不同分石牌广藿香及海南广藿香。枝叶茂盛时采割，日晒夜闷，反复至干。中国福建、台湾、广东、海南与广西等均有分布。现已被2010版《中国药典》所收录。是广东著名的道地药材之一，具有芳香化浊、和中止呕、发表解暑之效，是气候湿热的岭南地区常用中药材，是“藿香正气丸”“抗病毒口服液”等的30多种中成药的重要原料。在广藿香的成分中挥发油占有重要地位，其主要成分有萜类化合物、酮类、醇类、醛类、稠环芳香烃类化合物，同时还含有挥发性生物碱等物质，其中以广藿香酮和广藿香醇研究较为深入和全面。广藿香除了具有镇痛解热、止咳化痰的经典效果，另外还发现了其有调节胃肠道功能、抗炎、抗菌等功效，是治疗消化系统疾患和暑湿季节的常备中药之一。目前，尚未发现广藿香或其提取物用于胰岛素抵抗疾病的相关报道。技术实现要素：：本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的不足之处，而提供一种广藿香提取液的制备方法及其应用。本发明的一种广藿香提取液的制备方法，具体步骤如下：去广藿香中药饮片中加入10倍蒸馏水浸泡过夜后，加热至微沸，保持微沸50min后过滤得中药液ⅰ，将剩余药渣加入8倍量蒸馏水，保持微沸30min后过滤得中药液ⅱ，合并中药液ⅰ和中药液ⅱ，90℃下浓缩至生药浓度500mg/ml，冷却至室温，使用0.22μm的滤器过滤，即得广藿香提取液，4℃保存待用。利用上述方法制备的广藿香提取液对胰岛素抵抗具有改善作用。本发明的方法制备的广藿香提取液，具有改善3t3-l1脂肪细胞的胰岛素抵抗状态，增强脂肪细胞对葡萄糖摄取和利用的能力，从体外细胞水平上说明藿香具有改善胰岛素抵抗的作用。本实验通过选用3t3-l1脂肪细胞作为体外研究载体，诱导3t3-l1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的方法，研究藿香对3t3-l1前脂肪细胞增殖、成脂分化的影响。并进一步通过游离脂肪酸诱导建立胰岛素抵抗细胞模型,在有胰岛素刺激下,棕榈酸刺激组的细胞葡萄糖消耗量较正常组明显减少,提示胰岛素抵抗模型复制成功。实验结果表明藿香不仅能抑制前脂肪细胞的增殖，还能显著促进前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞，增强细胞对tg的累积能力。藿香作用于棕榈酸（pa）诱导的胰岛素抵抗的3t3-l1脂肪细胞，明显促进了脂肪细胞对葡萄糖的摄取，这说明藿香具有改善3t3-l1脂肪细胞的胰岛素抵抗状态，增强脂肪细胞对葡萄糖摄取和利用的能力，从体外细胞水平上说明藿香具有改善胰岛素抵抗的作用。附图说明：图1为各组油红o染色图；图2为各组油红o染色od值对比图；图3为各组tg浓度含量对比图。具体实施方式：一种广藿香提取液的制备方法，具体步骤如下：去广藿香中药饮片（购自大庆福瑞邦药房）中加入10倍蒸馏水浸泡过夜后，加热至微沸，此微沸的状态为：锅底有少量的气泡冒出，此时的状态可减少水分的蒸发，有利于有效成分的煎出；保持微沸50min后过滤得中药液ⅰ，将剩余药渣加入8倍量蒸馏水，保持微沸30min后过滤得中药液ⅱ，合并中药液ⅰ和中药液ⅱ，90℃下浓缩至生药浓度500mg/ml，冷却至室温，使用0.22μm的滤器过滤，即得广藿香提取液，4℃保存待用。利用上述方法制备的广藿香提取液对胰岛素抵抗具有改善作用。下面通过实验数据对广藿香提取液对胰岛素抵抗具有改善作用进行进一步解释说明。1、实验材料3t3-l1细胞（中科院）；dmem高糖培养基（美国gibco-brl公司）；特级胎牛血清（美国clark公司）；pbs、油红o染色液、胰蛋白酶、青链霉素（solarbio公司）、二甲基亚砜(dmso)、地塞米松、3-异丁基3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx)均购自sigama、胰岛素(上海源叶生物科技有限公司）、四氮甲基偶氮唑盐(mtt)，酶标仪；小鼠甘油三酯酶联免疫试剂盒（上海朗顿生物科技有限公司）；葡萄糖测定试剂盒（葡萄糖氧化酶法，南京建成生物工程研究所）。2、实验方法将3t3-l1脂肪细胞培养于培养瓶中，用含10%的胎牛血清和1%青链霉素的高糖dmem完全培养液，37℃、5%c02培养箱中培养。待细胞生长至对数期时进行传代。2.1mdi诱导剂配制将ibmx用dmso配制成0.05mol/l，将地塞米松用乙醇配制成1mmol/l，将25mg胰岛素溶于25mlph3.0的hcl中。诱导分化剂mdi的配方为10%胎牛血清，0.5mmol/l3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，1μmol/l地塞米松，10μg/ml胰岛素。2.2细胞复苏及培养将3t3-l1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%胎牛血清和1%青链霉素的高糖dmem完全培养液在37℃、5%co2条件下培养，待细胞长满至80%～90%、融合2d后开始诱导分化(第0天)并加入药物，每2d换液1次，每次换液时重新加入。2.3细胞分组及诱导分化将细胞分为对照组(只加10%胎牛血清高糖dmem培养基，不加诱导剂)、诱导分化组(加入诱导剂)、藿香0.1mg/ml组(加入诱导剂和0.5mg/ml藿香)、藿香1mg/ml组(加入诱导剂和1.0mg/ml藿香、藿香2.5mg/ml组(加入诱导剂和2.5mg/ml藿香)、藿香5.0mg/ml组(加入诱导剂和5.0mg/ml半枝莲)。同时，再加入含终浓度0.5mmol/l3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、终浓度1μmol/l地塞米松、终质量浓度10μg/ml胰岛素的10%胎牛血清高糖dmem培养液培养48h为第一次诱导，然后第二次诱导换含终质量浓度10μg/ml胰岛素的10%胎牛血清高糖dmem培养液继续培养48h，接着第三次诱导换只含血清和双抗的完全培养液，之后每48h换液1次，共2次，诱导分化第8天后结束实验。3指标检测3.1油红o染色在细胞诱导分化8d后，先移去旧培养基，然后用pbs洗2-3次,4%多聚甲醛固定1h，固定好后用pbs洗后控干，再用0.5%油红o溶液染色1h，再用pbs洗2-3次，于显微镜下观察到细胞浆内被染成红色的环状脂滴，并进行照相。照相完毕，加入异丙醇于平板混匀器上摇匀5min，吸出每孔液体，酶标仪检测492nm波长处的光密度(od)值。3.2甘油三酯(tg)用elisa试剂盒检测。3.3mtt法检测3t3-l1前脂肪细胞增殖的影响收集各时间点细胞(0、12、24、48h)，加入mtt溶液。孵育4h后，酶标仪读板，检测读450nm处od值，并计算增殖率和抑制率，公式分别为增殖率=某时间点平均od值/0h平均od值×100%(同一样品)、抑制率=(1－实验组平均od值/对照组平均od值)×100%(同一时间)。3.4胰岛素抵抗模型的建立取分化成熟的脂肪细胞，换用不含游离脂肪酸的0.2%bsa培养基过夜，再分为模型组和正常对照组，对照组给予常规高糖dmem培养基，模型组给予1mmol/l棕榈酸（pa）作用24h，之后换含有100nmol/l的胰岛素培养液刺激30min用于造模，提取细胞培养上清液，采用葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖消耗确定是否造模成功。取造模成功的细胞用于糖脂代谢实验。3.5葡萄糖过氧化酶法检测葡萄糖消耗量将诱导分化成熟的脂肪细胞，加入藿香(0.5、1.0、2.5、5.0mg/ml)继续培养24h，同时设正常对照组，模型组收集细胞培养上清，应用葡萄糖氧化酶法测定残余的葡萄糖浓度，以未经培养的培养基中的浓度与之相减，计算出各孔细胞的葡萄糖消耗量。4、结果4.1藿香对3t3-l1前脂肪细胞增殖和抑制藿香水提取液在0.5、1.0、2.5、5.0mg/ml浓度范围内对细胞无明显的细胞毒性。由表1可知，除了0.5mg/ml浓度时藿香能促进细胞的增殖，在24h和48h差异极显著（p<0.01）。而加入藿香1.0、2.5和5.0mg/ml的浓度，在24h、36h和48h能抑制了3t3-l1前脂肪细胞的增殖率，结果差异极显著（p<0.01）。由表2可知不同浓度的藿香，随着时间的延长，对3t3-l1前脂肪的抑制率也越高。且在36h时抑制率达到最高，此时不同浓度的藿香抑制率分别是18%、28%、37%和47%。表1藿香对3t3-l1前脂肪细胞增殖的影响组别浓度12h24h36h48h正常对照组―1.08±0.101.97±0.132.50±0.163.07±0.05藿香第1组0.5mg/ml1.21±0.08*2.17±0.15**2.56±0.063.19±0.09**藿香第2组1.0mg/ml1.10±0.061.90±0.052.24±0.05**2.90±0.14**藿香第3组2.5mg/ml1.06±0.081.70±0.08**1.98±0.03**2.52±0.06**藿香第4组5.0mg/ml1.00±0.061.49±0.08**1.66±0.07**2.12±0.07**注：标注“*”表示与对照组相比，差异显著（0.01<p<0.05），标注“**”表示与对照组相比，差异极显著（p<0.01）。表2藿香对3t3-l1前脂肪细胞抑制的影响组别浓度12h24h36h48h藿香第1组0.5mg/ml0.09±0.060.11±0.060.18±0.020.16±0.02藿香第2组1.0mg/ml0.18±0.050.22±0.020.28±0.010.24±0.04藿香第3组2.5mg/ml0.21±0.060.31±0.030.37±0.010.35±0.02藿香第4组5.0mg/ml0.25±0.050.39±0.030.47±0.020.45±0.024.2细胞形态变化第8天诱导分化组在显微镜下可见细胞大多呈成熟脂肪细胞表型，视野中大约90%分化为典型的成熟脂肪细胞，体积增大，胞体变圆，胞浆内脂滴明显，部分融合成较大脂滴；藿香组可见细胞脂滴数量较诱导分化组增加明显，随着浓度增加，脂滴越多。4.3藿香对成脂分化的促进作用图1显示,诱导分化组较对照组有明显的脂滴生成，od值与对照组相比增加。随着藿香质量浓度的增加，细胞脂质的生成有增加的趋势。其中5.0mg/ml组与诱导分化组有显著差异(p<0.05)。图2显示,与对照组相比，诱导分化组细胞tg含量增加，随着藿香质量浓度增加,tg水平逐渐上升,尤其2.5和5.0mg/ml藿香组的tg含量显著增加(p<0.05)。4.4胰岛素抵抗建模结果完全分化的3t3-l1脂肪细胞加入pa刺激24h后，由表3可知，建模组的葡萄糖消耗量低于对照组，结果有极显著性差异（p<0.001）。再加入100nmol/ml胰岛素刺激细胞30min，模型组的葡萄糖消耗量极显著低于对照组（p<0.001）。证明建模成功。表33t3-l1细胞建立胰岛素抵抗模型pa刺激24hins刺激30min对照组7.18±1.473.97±0.55模型组2.28±0.93**1.28±0.88**注：标注“**”表示与对照组相比，差异极显著（p<0.01）。4.5葡萄糖消耗量药物干预24h后，与对照组相比，模型组葡萄糖消耗量低于对照组，差异极显著（p<0.01）。加入藿香的各组与模型组相比较，0.5、1.0、2.5和5.0mg/ml的藿香组有极显著性差异(p<0.01)，提示藿香可显著提高ir脂肪细胞的葡萄糖消耗量。表4藿香干预细胞的葡萄糖消耗量对照组胰岛素抵抗模型组藿香0.5mg/ml组藿香1.0mg/ml组藿香2.5mg/ml组藿香5.0mg/ml组11.58±0.934.39±1.37##6.72±1.43**6.60±0.99**7.48±1.03**7.33±1.29**注：标注“##”表示与对照组相比，差异极显著（p<0.01），标注“**”表示与胰岛素抵抗模型组相比，差异极显著（p<0.01）。5、讨论胰岛素抵抗是2型糖尿病（t2dm）的主要病理机制，一直以来作为糖尿病研究的热点问题。胰岛素敏感性的下降主要由肝糖输出功能增强，脂肪组织和肌肉组织摄取葡萄糖能力减弱导致。因此调节糖脂代谢提高胰岛素敏感性的药物研究显得尤为重要。胰岛素抵抗通常与遗传背景、增龄、肥胖、体力活动少、血脂异常、脂肪肝等因素有关，这些因素又是心血管病变的危险因素。胰岛素抵抗既是2型糖尿病发生发展的重要病因,又是动脉粥样硬化的病理生理基础。预防胰岛素抵抗对于预防糖尿病和动脉粥样硬化有着十分重要的意义。胰岛素抵抗是由其主要目标器官（即脂肪组织，肝脏和肌肉）对胰岛素的敏感性减弱所决定的。胰岛素调节葡萄糖的摄取和循环脂肪酸（ffa）的浓度。在脂肪组织中，胰岛素可减少脂肪分解，从而减少脂肪细胞中的ffa外流；在肝脏中，胰岛素通过降低关键的酶活性来抑制糖异生，而在骨骼肌中，胰岛素主要通过刺激glut4葡萄糖转运蛋白向质膜的转运来诱导葡萄糖摄取。胰岛素抵抗导致循环ffa浓度增加和异位脂肪蓄积，从而阻碍骨骼肌中胰岛素介导的葡萄糖摄取和肝脏中葡萄糖生成的增加。最后，胰岛素抵抗和胰岛素分泌异常会导致t2dm。在细胞水平，胰岛素抵抗主要表现在胰岛素靶细胞脂肪细胞、肝细胞、肌细胞对胰岛素反应的功能障碍，其中脂肪细胞是胰岛素作用的重要靶点，与胰岛素抵抗的发生与发展密切相关3t3-l1前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化的特异化前体细胞,广泛应用于糖、脂代谢相关研究中。分化完全的3t3-l1脂肪细胞具有高胰岛素敏感性且稳定性较好,因此3t3-l1脂肪细胞是广泛采用的ir细胞模型。目前常用的3t3-l1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的造模方法包括使用游离脂肪酸(ffa)、地塞米松、高糖高胰岛素3种诱导剂,均可诱导产生胰岛素抵抗。通过建立3t3-l1脂肪细胞胰岛素抵抗模型考察中药或其有效组分对胰岛素抵抗的作用,其方法已被诸多研究人员广泛应用。而前脂肪细胞分化后可抑制ir,其机制主要是小脂肪细胞数量增多,细胞膜上胰岛素受体增多,敏感性增强,促进外周组织对葡萄糖信号的转导,通过pparγ-rxr结合于靶基因启动子上的ppre,激活脂肪组织特异性的基因表达,促进前脂细胞的分化过程，并且当脂肪组织储存tg能力下降可以导致脂肪易位沉积于肌肉和肝脏，从而引起胰岛素抵抗、糖耐量异常和糖尿病。本实验选用了3t3-l1脂肪细胞作为体外研究载体，诱导3t3-l1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的方法，研究藿香对3t3-l1前脂肪细胞增殖、成脂分化的影响。并进一步通过游离脂肪酸诱导建立胰岛素抵抗细胞模型,在有胰岛素刺激下,棕榈酸刺激组的细胞葡萄糖消耗量较正常组明显减少,提示胰岛素抵抗模型复制成功。实验结果表明藿香不仅能抑制前脂肪细胞的增殖，还能显著促进前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞，增强细胞对tg的累积能力。藿香作用于棕榈酸（pa）诱导的胰岛素抵抗的3t3-l1脂肪细胞，明显促进了脂肪细胞对葡萄糖的摄取，这说明藿香具有改善3t3-l1脂肪细胞的胰岛素抵抗状态，增强脂肪细胞对葡萄糖摄取和利用的能力，从体外细胞水平上说明藿香具有改善胰岛素抵抗的作用。实验结果证实了藿香作为降糖药物的应用价值，为中药藿香的进一步研究开发提供了实验依据，为从传统中药中开发改善胰岛素抵抗的药物提供了新的思路与方法。同时藿香改善体外脂肪细胞胰岛素抵抗的作用机制及藿香对葡萄糖转运率的影响及其机制尚有待进一步深入研究。综上所述，藿香对体外前脂肪细胞的分化有促进作用，并能促进脂肪细胞对葡萄糖的摄取以改善胰岛素抵抗。本发明结果显示，藿香对胰岛素抵抗具有改善作用。当前第1页12