栝楼在卷烟烟气引起的气道炎症反应中的应用的制作方法

本发明涉及烟草制品技术领域，更具体地，涉及栝楼在卷烟烟气引起的气道炎症反应中的应用。

背景技术：

卷烟烟气包含大于4000种化学物质，具有多种氧化性化学成分，目前研究证实，吸烟行为对机体多系统尤其呼吸道产生不良影响，可能与人类一些呼吸系统疾病如肺癌、慢性阻塞性肺炎(copd)等发生有关，卷烟烟气会刺激呼吸道进而引起机体内活性氧的增加，导致细胞内氧化和抗氧化平衡被打破，使吸烟者支气管上皮细胞发生炎症反应，在其反应过程中有许多炎症介质的水平将会升高如tnf-α、il-6和il-8等，因此降低烟气刺激所带来的气道炎症风险，是吸烟与健康及降焦减害的重要内容。

栝楼属葫芦目葫芦科多年生攀缘草本植物，其成熟的干燥果皮称为瓜蒌皮，成熟的种子称为瓜蒌子，根称为天花粉，均为我国广泛使用的中药，但不同部位的药理作用不尽相同。现代药理研究证实，瓜蒌皮具有宽胸散结、清化热痰等功效，用于治痰热咳嗽、心胸闷痛。瓜蒌子具有改善心血管疾病、降血糖、降血脂、抑菌、抗肿瘤等多种药理作用，用于治疗肺热咳嗽、肺痈、大便秘结等症；天花粉则具有清热泄火、生津止渴、消肿排脓的功效，用于热病烦渴、肺热燥咳等症。目前，关于栝楼不同部位(瓜蒌皮、瓜蒌子、天花粉)对于由烟气刺激所带来的气道炎症的影响还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供栝楼在卷烟烟气引起的气道炎症反应中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明对栝楼降低卷烟烟气引起的气道炎症反应的可能性进行了研究，采用tpm诱导的beas-2b建立细胞损伤模型，检测该模型的细胞炎症因子，细胞炎症因子检测法是一种评价外源物质对细胞造成炎症效应评估的有效办法之一，适用于卷烟烟气暴露研究。本发明在细胞损伤模型中添加不同浓度的瓜蒌皮、瓜蒌子、天花粉的提取物后，通过检测诱导后beas-2b细胞分泌tnf-α、il-6及il-8的mrna和蛋白水平上表达量的差异，分析栝楼不同部位的抗炎活性，从而探讨栝楼提取物对卷烟烟气的抗炎作用。

具体地，本发明通过研究栝楼不同部位(瓜蒌皮、瓜蒌子、天花粉)对卷烟烟气总粒相物(tpm)诱导人支气管上皮细胞(beas-2b)炎症因子表达的影响从而评价栝楼不同部位(瓜蒌皮、瓜蒌子、天花粉)对于由烟气刺激所带来的气道炎症的影响。用tpm诱导的beas-2b建立细胞损伤模型，细胞分为四组：阴性对照组、阳性对照组、tpm组、中药提取物剂量组。采用rt-qpcr技术检测肿瘤坏死因子(tnf-α)、白细胞介素-6(il-6)和白细胞介素-8(il-8)mrna的表达水平；采用酶联免疫法(elisa)分析细胞上清液中tnf-α、il-6和il-8的蛋白水平表达。结果表明：与阴性对照组比较，tpm诱导beas-2b细胞中tnf-α、il-6和il-8在mrna表达水平都显著升高(p＜0.05)，与tpm组相比，给予每种添加物不同剂量后，炎症因子在mrna水平的表达上受到不同程度的抑制；与阴性对照组比较，tpm诱导beas-2b细胞上清液中tnf-α、il-6和il-8在蛋白表达水平都显著升高(p＜0.05)，与tpm组相比，给予每种添加物不同剂量的后，炎症因子在蛋白水平上受到不同程度的抑制。表明栝楼不同部位均均对tpm诱导beas-2b细胞炎症因子的表达具有抑制作用，从而说明栝楼不同部位(瓜蒌皮、瓜蒌子、天花粉)可用于防治由卷烟烟气引起的气道炎症，降低卷烟烟气引起的气道炎症反应。

因此，本发明首先保护栝楼的下列应用：

栝楼在制备防治卷烟烟气引起的气道炎症的药剂中的应用。

栝楼在制备防治卷烟烟气总粒相物诱导的人支气管上皮细胞炎症的药剂中的应用。

栝楼在制备降低卷烟烟气引起的气道炎症的卷烟制品中的应用。

栝楼在制备降低卷烟烟气总粒相物诱导的人支气管上皮细胞炎症的卷烟制品中的应用。

优选地，所述栝楼为瓜蒌皮、瓜蒌子或天花粉中的一种或多种。

优选地，所述栝楼为瓜蒌皮、瓜蒌子或天花粉中的一种或多种的水提取物。

本发明发现，tpm诱导beas-2b细胞炎症介质tnf-α、il-6和il-8在mrna水平表达升高，给予每种添加物不同剂量后，三种炎症因子mrna水平升高受到不同程度的抑制，在瓜蒌皮提取物添加量较小时，三种炎症因子mrna的表达量明显降低，但这种降低程度随着添加量的加大而减弱，添加量至10μg/ml时，il-6和il-8两种炎症因子mrna的表达量反而大于单纯主流烟气粒相物刺激产生的量；同样在tpm刺激细胞后的上清液中炎症介质tnf-α、il-6和il-8在蛋白水平上也明显升高，给予每种添加物不同剂量后，三种炎症因子升高的水平受到不同程度的抑制，在提取物添加量较小时，三种炎症因子的表达量明显降低，添加量到一定时，抑制作用消失，反而会增强炎症因子的分泌，表达量会比单纯主流烟气粒相物刺激产生的量高。说明，只是在一定的剂量范围内，栝楼对卷烟烟气引起的气道炎症反应才有一定的降低作用。

优选地，所述栝楼的添加量为0.1μg/ml～1μg/ml。

同时，本发明将栝楼提取物添加到不同品牌的烟丝中，发现当在卷烟烟丝中添加一定剂量范围的瓜蒌、天花粉的中药提取物可抑制卷烟主流烟气粒相物对支气管上皮细胞刺激带来的炎症反应。进一步表明含有栝楼提取物的卷烟可以降低由卷烟烟气引起的气道炎症反应。

因此本发明还提供一种含栝楼的卷烟制品，其烟丝中含有1％～5wt％的栝楼提取物。

优选地，所述栝楼提取物为瓜蒌皮、瓜蒌子或天花粉中的一种或多种的水提取物。

更优选地，所述烟丝中含有1％～3wt％的栝楼提取物。

优选地，所述水提取物为将栝楼的三个不同部位(瓜蒌皮、瓜蒌子、天花粉)，分别以1:8～12的比例加入蒸馏水，加热回流2～4h，过滤取上清，浓缩后，喷雾干燥，即可分别得到瓜蒌皮、瓜蒌子、天花粉的水提取物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了栝楼在卷烟烟气引起的气道炎症反应中的应用。本发明在卷烟烟气总粒相物诱导诱导的人支气管上皮细胞炎症模型中添加不同浓度的瓜蒌皮、瓜蒌子、天花粉的提取物后，通过检测诱导后beas-2b细胞分泌tnf-α、il-6及il-8的mrna和蛋白水平上表达量的差异，分析栝楼不同部位的抗炎活性，发现栝楼不同部位均对tpm诱导beas-2b细胞炎症因子的表达具有抑制作用。表明栝楼提取物对卷烟烟气具有抗炎作用，可用于制备防治卷烟烟气引起的气道炎症的药剂或制备降低卷烟烟气引起的气道炎症的卷烟制品，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为瓜蒌皮提取物对tpm诱导beas-2b细胞炎症因子mrna水平的影响(n＝3)。注：与阴性对照组比较，+p<0.05；与阴性对照组比较，++p<0.001；与tpm组比较，*p<0.05；与tpm组比较，**p<0.001；与tpm组比较，***p<0.0001。

图2为瓜蒌皮提取物对tpm诱导beas-2b细胞上清液中炎症因子水平的影响(n＝3)。注：与阴性对照组比较，+p<0.05；与阴性对照组比较，++p<0.001；与tpm组比较，*p<0.05；与tpm组比较，**p<0.001；与tpm组比较，***p<0.0001。

图3为瓜蒌子提取物对tpm诱导beas-2b细胞炎症因子mrna水平的影响(n＝3)。

图4为瓜蒌子提取物对tpm诱导beas-2b细胞上清液中炎症因子水平的影响(n＝3)。

图5为天花粉提取物对tpm诱导beas-2b细胞炎症因子mrna水平的影响(n＝3)。注：与阴性对照组比较，+p<0.05；与阴性对照组比较，++p<0.001；与tpm组比较，*p<0.05；与tpm组比较，**p<0.001；与tpm组比较，***p<0.0001。

图6为天花粉提取物对tpm诱导beas-2b细胞上清液中炎症因子水平的影响(n＝3)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

人支气管上皮细胞beas-2b(美国atcc公司)

参比卷烟r4f(美国肯塔基大学)

二甲基亚砜(gibco)；dmem培养液(gibco)；胰蛋白酶(gibco)；胎牛血清(gibco)；胰蛋白酶(gibco)；脂多糖(索莱宝)；人il-6elisa试剂盒(raybiotech)；人tnf-αelisa试剂盒(raybiotech)；人il-8elisa试剂盒(raybiotech)；所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；trizol(invitrogen)；primescriptrtreagentkit试剂盒(takara)；sybrpremixextaq^tmiirealtimepcr试剂盒(takara)

co2细胞培养箱(thermoscientific)；生物光学显微镜(olimpus)；低温超速离心机(thermoscientific)；pcr仪(abi7500)；

实施例1栝楼提取物对tpm诱导beas-2b细胞炎症因子表达的影响

一、方法

1、中药提取物的制备

取栝楼的三个不同部位(瓜蒌皮、瓜蒌子、天花粉)，分别以1:10的比例加入蒸馏水，加热回流3h，过滤取上清，浓缩后，喷雾干燥，分别得到瓜蒌皮、瓜蒌子、天花粉的提取物。

2、卷烟主流烟气粒相物收集方法

按照iso抽吸模式，使用转盘吸烟机，每轮抽吸20支3r4f卷烟。抽吸模式为：60s，持续时间2s，抽吸容量35ml。

将捕集有主流烟气粒相物的剑桥滤片放入馒头瓶中，注意将捕集有粒相物的一面朝下，加入二甲基亚砜，振荡30min，收集萃取液，制备成终浓度10mg/ml的总粒相物提取物。

3、粒相物分组及剂量刺激方法

支气管上皮细胞beas-2b来源于烟气作用的靶器官呼吸道组织，是研究烟气暴露的有效细胞模型，因此本发明选择beas-2b细胞模型评价瓜蒌皮、瓜蒌子和天花粉提取物对tpm刺激细胞产生炎症因子表达的影响。而脂多糖可以诱导细胞炎症介质的表达。因此，选用脂多糖(lps)作为阳性对照来观察tpm刺激beas-2b炎症介质的表达作用。

将对数生长期的支气管上皮细胞beas-2b制备成细胞悬浮液，种植量为2ml/孔，每孔种植2.8×10⁵个细胞于6孔细胞培养板，培养基为dmem培养基，含10％胎牛血清及100u/ml硫酸庆大霉素。将种好的6孔细胞培养板放置于co2细胞培养箱，于37℃，co2浓度为5％条件下培养24h，待细胞融合度达到70％～80％后，移除6孔板中的全培养基，添加不含血清的培养基饥饿细胞24h。

将受试物分为四组：阴性对照组、阳性对照组、tpm组、中药提取物剂量组。阴性对照组只加不含血清的培养基；阳性对照组在无血清培养基中添加终浓度0.5μg/ml的脂多糖(lps)；tpm组在无血清培养基中添加终浓度5μg/ml的总粒相物提取物；中药提取物剂量组在无血清培养基中添加终浓度5μg/ml的总粒相物提取物，再按0.1、1、2.5、5、10μg/ml梯度添加各中药提取物。将加好刺激物的6孔细胞培养板置于二氧化碳培养箱中孵育24h，孵育条件为37℃，co2浓度为5％。取细胞及上清液进行炎症因子蛋白水平和基因水平的检测。

4、rt-pcr法检测细胞tnf-α、il-6、il-8的mrna水平变化

(1)利用primerpremier5.1软件设计的pcr引物，见表1。

表1pcr引物序列参数

(2)细胞总rna的提取

弃去各组细胞培养液，每孔加trizol试剂1ml裂解细胞，加入三氯甲烷0.2ml，4℃，12000g/min离心15min吸取上层水相，加等量的异丙醇沉淀rna，4℃，12000g/min离心10min，缓慢加入75％乙醇1ml洗涤，4℃，7500g/min离心5min，弃上清液后室温风干10min，加入rnase-free水30μl水溶解，用nanodrop测其浓度，即得总rna样品。

(3)cdna合成

按primescriptrtreagentkit试剂盒说明进行实验，取细胞总rna32.5μl，加入oligodtprimer(50μm)2.5μl，random6mers2.5μl，primescripttmenzymemixi(5×)10.0μl，用rnase-free水补足至50.0μl，轻轻混匀后离心5s，于37℃水浴15min，85℃水浴30s，反应结束后，分装保存于-20℃，进行后续实验。

(4)realtimepcr

按sybrpremixextaqtmiirealtimepcr试剂盒操作说明进行实验：取cdna样品2μl，加入sybrpremixextaqtmii(2×)10μl，引物1(10μm)0.8μl,引物2(10μm)0.8μl,roxreference0.08μl，rnase-free水补足至25μl。pcr扩增条件：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s；反应40个循环；：95℃，15s；60℃，60s；95℃，15s：60℃，15s；采用2^-△△ct方法分析目的基因mrna相对表达量，并进行溶解曲线分析，ct是荧光达到荧光阈值的循环数，△△ct＝(ct目的基因-ct管家基因)实验组-(ct目的基因-ct管家基因)对照组。采用spss21.0统计软件对实验结果进行处理。

5、elisa法检测tnf-α、il-6、il-8炎症因子的表达量

分别按照elisa试剂盒操作说明进行实验，每孔加入试剂盒中稀释液50μl，再吸取细胞培养基上清液或标准对照液各50μl，分别加入样品孔和对照孔，37℃孵育2h，倒去孔内液体，加入生物素话抗体工作液100μl，37℃孵育2h，洗涤3次，加入酶结合工作液100μl，37℃孵育30min，洗涤5次，加入酶作用底物100μl，避光37℃孵育30min，每孔加入终止液50μl，立即在450nm波长处测量od值，计算结果。采用spss21.0统计软件对实验结果进行处理。

二、结果

1、瓜蒌皮提取物对tpm诱导beas-2b细胞炎症因子表达的影响

(1)瓜蒌皮提取物对tpm诱导beas-2b细胞炎症因子mrna水平的影响

研究表明tnf-α、il-6和il-8基因的表达量可以用作炎症反应的标志物。如图1所示：图中数据均为平行测定3次后取平均值，添加瓜蒌皮提取物不同剂量后，发现三种炎症因子的mrna表达量均随着添加物的增加呈先减少后增加的趋势，瓜蒌皮提取物在添加量为0.1μg/ml到1μg/ml时，三种炎症因子的mrna表达抑制作用明显，添加量为5μg/ml到10μg/ml之间时，三种炎症因子mrna的表达量会比单纯主流烟气粒相物刺激产生的量高。

(2)瓜蒌皮提取物对tpm诱导beas-2b上清液中炎症因子水平的影响

如图2所示：添加瓜蒌皮提取物不同剂量后，发现细胞上清液中三种炎症因子的表达量均随着添加物的增加呈先减少后增加的趋势，剂量添加在5ug/ml到10ug/ml时抑制作用消失，反而会增强三种炎症因子的分泌，表达量会比单纯主流烟气粒相物刺激产生的量高。

2、瓜蒌子提取物对tpm诱导beas-2b细胞炎症因子表达的影响

(1)瓜蒌子提取物对tpm诱导beas-2b细胞炎症因子mrna水平的影响

如图3所示：瓜蒌子提取物在添加量为0.1μg/ml到1μg/ml时，il-8和tnf-α两种炎症因子的mrna表达抑制作用明显；添加量为5μg/ml到10μg/ml之间时，三种炎症因子mrna的表达量会比单纯主流烟气粒相物刺激产生的量高；添加量为0.1μg/ml到10μg/ml中，瓜蒌子提取物对il-6炎症因子mrna的表达量抑制作用变化不明显，反而致使三种炎症因子mrna的表达量增加。

(2)瓜蒌子提取物对tpm诱导beas-2b上清液中炎症因子水平的影响

如图4所示：添加瓜蒌子提取物不同剂量后，发现细胞上清液中三种炎症因子的表达量均随着添加物的增加呈先减少后增加的趋势，剂量增加在5ug/ml到10ug/ml时抑制作用消失，反而会增强三种炎症因子的分泌，表达量会比单纯主流烟气粒相物刺激产生的量高。

3、天花粉提取物对tpm诱导beas-2b细胞炎症因子表达的影响

(1)天花粉提取物对tpm诱导beas-2b细胞炎症因子mrna水平的影响

如图5所示：天花粉提取物添加量为0.1μg/ml到1μg/ml之间时，il-6和tnf-α两种炎症因子的mrna表达抑制作用明显；添加量为2.5μg/ml到10μg/ml之间时，三种炎症因子mrna的表达量会比单纯主流烟气粒相物刺激产生的量高；添加量为0.1μg/ml到10μg/ml中，天花粉提取物对il-8炎症因子mrna的表达量抑制作用变化不明显，反而致使三种炎症因子mrna的表达量增加。

(2)天花粉提取物对tpm诱导beas-2b上清液中炎症因子水平的影响

如图6所示：添加天花粉提取物不同剂量后，发现细胞上清液中的tnf-α和il-8表达量随着添加物的增加呈先减少后增加的趋势，而il-6的表达量随着添加量的增加而不断降低，可减少50％的il-6分泌量。

如图6所示：与阴性对照组比较，tpm诱导beas-2b细胞中tnf-α、il-6和il-8三种炎症因子在mrna和蛋白表达水平上都显著升高，差异有统计学意义(p＜0.05)，给予三种添加物不同剂量后，炎症因子在两个水平的表达上受到不同程度的抑制。

上述结果表明，栝楼不同部位提取物的添加，在一定的添加范围内，有利于抑制tpm诱导beas-2b细胞中tnf-α、il-6和il-8三种炎症因子在mrna和上清液蛋白水平表达量，可一定程度的降低卷烟刺激的炎症危害性，但随着量的加大，上述作用会减弱，甚至出现负面的作用，因此，在实际应用时应根据具体情况做更细致的研究来确定其添加浓度。

实施例2卷烟中添加栝楼提取物对卷烟主流烟气致炎效应的影响

一、方法

1、中药提取物

取瓜蒌、天花粉，分别以1:10的比例加入蒸馏水，加热回流3h，过滤取上清，浓缩后，喷雾干燥，得提取物。

2、卷烟中添加中药提取物

将卷烟的烟丝吹出，按1％、3％、5％比例加入上述的提取物，混匀，以烟筒填充仪重新卷制卷烟。

3、卷烟主流烟气粒相物收集方法

将待测卷烟样品放入恒温恒湿箱中，在22±1℃、60±3％湿度条件下平衡48h，按照iso3308抽吸条件在转盘吸烟机上进行抽吸。每轮抽吸20支烟，抽吸时，环境温湿度控制在22±2℃、60±5％。抽吸参数控制在60s抽一口，每口抽吸2s，抽吸至烟蒂长度为接装纸外3mm时停止抽吸，全部抽吸完后，空吸5口以清除管道残留烟气。取出捕集器后，拿出捕集器中的收集有主流烟气粒相物的剑桥滤片，将剑桥滤片放入馒头瓶中，注意将收集有粒相物的一面朝下，加入二甲基亚砜，进行振荡萃取30min，收集萃取液。

4、粒相物刺激条件

将制备好的支气管上皮细胞beas-2b细胞悬浮液种植到6孔细胞培养板中。培养基为dmem培养基，使用前添加10％胎牛血清，及100u/ml硫酸庆大霉素。将种好的板置于二氧化碳培养箱中培养24h，培养条件为37℃，co2浓度为5％。

移除6孔板中的培养基，添加不含血清的培养基饥饿24h，添加100μg/ml总粒相物提取物刺激24h，取细胞上清测定tnf-α肿瘤坏死因子；添加10μg/ml总粒相物提取物刺激24h，取细胞上清测定il-6细胞因子；添加30μg/ml总粒相物提取物刺激24h，取细胞上清测定il-8细胞因子。孵育条件为37℃，co2浓度为5％。

4、炎症因子的检测

分别采用试剂盒操作说明进行。

二、结果

1、添加上述栝楼提取物后对肿瘤坏死因子tnf-α的影响见表1，由表中所列数据可看出，各种中药提取物的添加均对卷烟主流烟气粒相物刺激beas-2b细胞分泌的肿瘤坏死因子的反应有抑制作用，细胞上清液中的tnf-α量均随着卷烟中添加物的增加均有不同程度的减少

表1添加中药提取物对细胞分泌tnf-α的影响(pg/ml)

2、添加上述栝楼提取物后对白细胞介素-6的影响见表2，由表中所列数据可看出，各种中药提取物的添加均对卷烟主流烟气粒相物刺激beas-2b细胞分泌的il-6因子的反应有抑制作用，细胞上清液中的il-6量均随着卷烟中添加物的增加均有不同程度的减少。但需注意天花粉的剂量增加抑制作用有所减弱，因此可推断部分中药提取物的添加需注意剂量。

表2添加中药提取物对细胞分泌il-6的影响(ng/ml)

3、添加上述栝楼提取物后对白细胞介素-8的影响见表3，由表中所列数据可看出，各种中药提取物的添加均对卷烟主流烟气粒相物刺激beas-2b细胞分泌的il-8因子的反应有抑制作用，细胞上清液中的il-8量均随着卷烟中添加物的增加均有不同程度的减少。但需注意部分中药提取物的剂量增加抑制作用有所减弱，因此可推断一些中药提取物的添加需注意剂量。

表3添加中药提取物对细胞分泌il-8的影响(ng/ml)

从上述结果可以看出，当在卷烟烟丝中添加一定剂量范围的瓜蒌、天花粉的中药提取物可抑制卷烟主流烟气粒相物对支气管上皮细胞刺激带来的炎症反应.。表明含有栝楼提取物的卷烟可以降低由卷烟烟气引起的气道炎症反应。