低温等离子体与二甲双胍联用的应用的制作方法

本发明涉及领域低温等离子体和二甲双胍的新用途，特别涉及一种低温等离子体与二甲双胍联用的应用。

背景技术：

胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，其中恶性胶质瘤(gbm)是胶质瘤里恶性程度最高的，其五年生存率约为5％，在过去几十年间，恶性胶质瘤的生存并没有得到有效地改善。胶质瘤在中国的发病率约为4/100000。2016年世界卫生组织中的中枢神经系统肿瘤分类，根据组织病理学和突变特性将胶质瘤分为外周胶质瘤(who，i级)和浸润性胶质瘤(who，ii-iv级)，其中后者又包括胶质母细胞瘤(占所有恶性神经胶质瘤的60-70％)，间变性星形胶质细胞瘤(占10-15％)，间变性少突胶质细胞瘤和间变性少突星形细胞瘤(10％)以及其他一些不常见的亚型。胶质瘤的治疗方式一般包括手术切除，化学治疗，放射治疗。其中，手术治疗联合化疗，放疗是治疗脑胶质瘤的一般疗法，目前，通过手术切除加同步放化疗可以为这些患者提供的最佳中位生存期为14个月。恶性胶质瘤的治疗进展包括以获得最大程度安全切除的新型外科手术技术，特定的放射治疗方案和新的全身化疗方案。替莫唑胺(tmz，一种烷化剂)通过在o⁶位置上将鸟嘌呤烷基化以及在腺嘌呤的n3和n7位置上进行烷基化来杀伤胶质瘤，其代表星形细胞瘤的二线用药和恶性胶质母细胞瘤的一线用药。尽管tmz能够为高级别胶质瘤患者提供积极的治疗效果，但是其在低级别胶质瘤和其他一些基因突变的胶质瘤亚型中的作用还不是很清楚。对于一些亚型，比如idh突变型和低级别星型细胞瘤，tmz治疗会使得这些肿瘤表现出高度突变的恶性肿瘤特性。越来越多的临床病例指出，一些gbm患者对tmz产生抗药性，甚至有些患者对tmz的治疗不响应。因此，迫切需要用于治疗神经胶质瘤的产品或方案。

自然界的等离子体是在高温下形成的继固态、液态、气态之后的物质存在的第四种形态。在实验室条件下，工程师可以产生室温的等离子体，因此也称之为低温等离子体(cap)。等离子由多种活性自由基组成，其中最主要的包括自由氧基和自由氮基(ros/rns)。在过去的十几年间，无论是体外还是体内实验，cap或者cap激活的培养基(cam)展现出了一种广谱性的抗瘤效应。多药剂或联合癌症疗法可以为患者提供更好的治疗效果，而cap/cam已在实验室中被用于与某些药物联合以治疗肿瘤。tetsuoadachi等发现组蛋白去乙酰化酶(hdac)抑制剂能够增强cam对腺癌细胞a549的杀伤作用；将乳腺癌细胞系用hsp90抑制剂(pu-h71)预致敏，能够增强cap对肿瘤细胞的杀伤效果；对tmz有抗药性的gbm细胞用cap处理后，恢复了对tmz的敏感性。而2019年，fda批准了低温等离子体手术刀用于临床上治疗肿瘤，这无疑增加了cap用于临床的可能性。

二甲双胍(met)是二型糖尿病(t2dm)患者最重要的药物。近年来发现二甲双胍能够增强多种肿瘤对某些化疗药物的敏感性。将tmz与二甲双胍联用后，相比于单药治疗，能够显著杀伤胶质瘤细胞；二甲双胍和索拉非尼联用能够显著抑制肝细胞癌增殖并诱导自噬；二甲双胍能够增加非小细胞肺癌对儿茶素的敏感性。由于二甲双胍价格便宜且已经批准在临床上使用，其如能在肿瘤中的应用，相较于从头开发新药和现有的肿瘤特效药有天然的优势。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种低温等离子体与二甲双胍联用的应用。

本发明的一方面在于，提供低温等离子体与二甲双胍联用在体外非治疗性诱导胶质瘤细胞死亡的应用。

优选的是，通过对体外胶质瘤细胞先采用二甲双胍进行处理，然后再使用低温等离子体处理。

本发明的第二方面在于，提供低温等离子体与二甲双胍联用在体外非治疗性诱导u251细胞死亡的应用。

优选的是，通过对体外培养的u251细胞先采用二甲双胍进行处理，再培养6-24小时，然后用低温等离子体处理5-120秒，以诱导u251细胞死亡。

本发明的第三方面在于，提供低温等离子体与二甲双胍联用在体外非治疗性诱导u87细胞死亡的应用。

优选的是，通过对体外培养的u87细胞先采用二甲双胍进行处理，再培养6-24小时，然后用低温等离子体处理5-120秒，以诱导u251细胞死亡。

本发明的有益效果是：本发明提供的低温等离子体与二甲双胍联用在体外非治疗性诱导胶质瘤细胞死亡的应用，显示出低温等离子体与二甲双胍联用对体外培养的胶质瘤细胞系u251、u87细胞具有明显的协同抑制作用，能显著诱导细胞死亡。通过本发明提供的二甲双胍和低温等离子体联用在诱导神经胶质瘤死亡的应用的方案可为研究低温等离子体与二甲双胍联用在胶质瘤治疗方面的应用提供新策略，以期为设计治疗胶质瘤的新产品或新方案提供新的思路。

附图说明

图1本发明的实施例1中的实验结果；

图2本发明的实施例2中的实验结果；

图3本发明的实施例3中的实验结果；

图4本发明的实施例4中的实验结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供低温等离子体与二甲双胍联用在体外非治疗性诱导胶质瘤细胞死亡的应用。通过对体外胶质瘤细胞先采用二甲双胍进行处理，然后再使用低温等离子体处理，诱导体外培养的胶质瘤细胞死亡。本发明用于非疾病治疗，主要是用于体外研究，通过本发明的方案可研究低温等离子体与二甲双胍联用在胶质瘤治疗方面的应用，以期为设计治疗胶质瘤的新产品或新方案提供新的思路。

以下实施例中以u251和u87脑胶质瘤细胞为对象进行实验，以对本发明作进一步说明，其中使用的都是常用的分子生物学和细胞生物学相关的试剂与耗材。

实施例一：测定低温等离子体(cap)与二甲双胍(met)单用、联用对u251/u87脑胶质瘤细胞的抑制效果

1、为了判断低温等离子体和二甲双胍单独作用对胶质瘤细胞系的细胞活力是否有影响，本实施例中首先分别检测低温等离子体和二甲双胍对胶质瘤细胞系活力的影响。将u251细胞系按7.5*10⁴个/ml，u87细胞系5*10⁴/ml的密度接种于96孔板中，培养24小时后：

(1)等离子单独作用实验：分别按10，20，40，60秒的低温等离子体处理时间处理，分别于处理24小时和48小时后，用celltiterblue法检测细胞活力，结果如图1a-1b所示，从图中结果可以看出，低温等离子体可以有效抑制胶质瘤细胞的细胞活力，且抑制效果与细胞暴露在等离子体下的时间成正相关，但低温等离子体处理后，继续培养24小时和48小时，低温等离子体对细胞活力的抑制没有显著差异。

对图1a-1b进行分析：胶质瘤细胞系u251(图1a)、u87细胞系(图1b)培养24小时后，用cap分别处理10，20，40，60秒，再将细胞继续培养24和48小时后，用celltiterblue试剂盒检测细胞活力，可以发现，cap对细胞活力的抑制效果与cap处理肿瘤细胞的时间成正相关(横坐标代表cap处理的时间，纵坐标代表细胞活力(用百分比表示))；cap处理完后，胶质瘤细胞系培养24小时和48小时后，两种时间段检测的细胞活力差异不大；同时可以发现cap对u87细胞的抑制效果比u251的明显。

(2)二甲双胍单独作用实验：分别用2，4，8，16毫摩尔/升的二甲双胍处理细胞，分别在处理24小时和48小时后，用celltiterblue法检测细胞活力，结果如图1c-1d所示，从图中结果可以看出，二甲双胍对细胞活力没有明显的抑制效果。之后，将细胞在96孔板中培养12小时后，分别加入2，4，8，16毫摩尔/升的二甲双胍，继续培养12小时，再分别用低温等离子体处理10，20，40，60秒，结果如图1e-1f所示，从图中结果可以看出，用二甲双胍处理后，能够增加低温等离子体对细胞活力的抑制效果。然后用compusyn软件分析，结果如图1g-1h，从图中结果可以看出，低温等离子体和二甲双胍的联合用药具有协同抑制效应。

图1c-1d中，胶质瘤细胞系u251(图1c)、u87细胞系(图1d)培养24小时后，分别用2，4，8，16毫摩尔/升的met处理，于处理24小时和48小时后检测细胞活力，可以发现met对胶质瘤细胞系并没有很明显的抑制效果(横坐标met浓度，纵坐标细胞活力，用百分比表示)；24小时和48小时检测细胞活力，两个时间段同一met浓度下的细胞活力相差不大(黑色柱子代表24小时，灰色柱子代表48小时)。

图1e-1f中，胶质瘤细胞系u251(图1e)、u87细胞系(图1f)培养12小时后，分别加入2，4，8，16毫摩尔/升的met，继续培养12小时后，再用cap分别处理10，20，30秒，12小时后检测细胞活力(横坐标met的浓度，纵坐标细胞活力，用百分比表示)。可以发现相比于单独用met或者单独用cap处理，用met处理后再用cap处理，能够更为明显的抑制细胞活力。

图1g-1h中，胶质瘤细胞系u251如图1g、u87细胞系如图1h，将图1e、1f中的数据用compusyn软件分析(此软件是生物学中常用来分析多种药物是否有协同效应的软件)，可知met和cap具有协同抑制效应(图中不同颜色的小圈代表不同浓度和不同cap处理时间的组合，纵坐标表示ci值(cooperativityindex，协同指数)，当ci小于1时表示两种手段在此种组合下具有协同作用，大于1则表示没有)。

实施例二：测定低温等离子体和二甲双胍联用诱导u251/u87脑胶质瘤细胞死亡的效果

将u251，u87胶质瘤细胞在96孔板中培养12小时后，加入16毫摩尔/升的二甲双胍，继续培养12小时，再用低温等离子体处理30秒，继续培养12小时后，结果如图2a-2b所示；从图中可以看出，低温等离子体和二甲双胍联合用药能够改变细胞形态，使细胞变圆，呈现一种死亡样的形态。通过细胞活死试剂盒检测，相比于单一处理，联用确实能够显著诱导细胞死亡(如图2c-2d，圆框内为活细胞，方框内为死细胞；图2e-2f为细胞死亡率统计图)。

图2a-2b中，胶质瘤细胞系u251(图2a)、u87细胞系(图2b)培养12小时后，加入16毫摩尔/升的met，继续培养12小时后，再用cap处理30秒，12小时后于明场显微镜下拍照观察细胞形态(左一图对照组control，左二图单独用met处理met，左三图单独用cap处理，左四图met和cap联合处理)，met单独处理对细胞形态没有影响(与对照组相比)，cap单独处理可以使细胞触角回缩，met和cap联用能够明显使细胞变圆，产生一种类似于死亡的细胞形态。

图2c-2d中，胶质瘤细胞系u251(图2a)、u87细胞系(图2b)培养12小时后，加入16毫摩尔/升的met，继续培养12小时后，再用cap处理30秒，12小时后用细胞活/死试剂检测活细胞和死细胞，并在荧光倒置显微镜下观察结果(左一图对照组：control，左二图单独用met处理：met，左三图单独用cap处理：cap，左四图met和cap联合处理：met+cap)，可以发现met和cap联用能够显著诱导细胞死亡，图中圆框内为活细胞，方框内为死细胞。

图2e-2f中，图2e、2f为分别为图2c、2d的定量统计图，用imagej软件分别数出2c、2d图中活细胞和死细胞的数目，并算出死细胞占总细胞个数的百分比，绘出2e、2f图。备注：c，d为代表性的图，因为实验做了三个重复，其他图未放出来，e，f图是统计了三次重复组的数据。

实施例三进行低温等离子体和二甲双胍的协同抑制效果机理的进一步分析实验

将u251，u87胶质瘤细胞在96孔板中培养24小时后，再用低温等离子体处理30秒，分别用活性氧检测试剂盒检测细胞内自由氧基的水平以及用过氧化氢试剂盒检测低温等离子体处理过的细胞培养基内的过氧化氢水平。

如图3a，胶质瘤细胞系u251(上面)、u87细胞系(下面)培养12小时后，用cap处理30秒，用活性氧检测试剂盒检测细胞内自由氧基的水平(圆框内为细胞内的活性氧)，发现cap处理后明显提高了细胞内的自由氧基水平。

如图3b，用过氧化氢试剂盒检测cap处理过的细胞培养基内的过氧化氢水平(圆框内为细胞内的活性氧)，发现cap处理能够明显提高培养基内的h2o2水平(纵坐标表示h2o2水平倍数的改变)。

如图3c-3d，胶质瘤细胞系u251(图3c)、u87细胞系(图3d)培养12小时后，加入16毫摩尔/升的met，继续培养12小时后，分别做以下实验：(图中cap组)再用cap处理30秒，12小时后检测细胞活力；(图中cat组)，加入300u的过氧化氢酶，再用cap处理30秒，12小时检测细胞活力；(图中h2o2组)在细胞中加入h2o2，12小时后检测细胞活力。发现加入cat(过氧化氢酶，能清除过氧化氢)后，met和cap的协同抑制效果消失了。而met和h2o2对细胞的抑制效果与met、cap联用对细胞的抑制效果相似，说明cap产生的h2o2在met和cap的协同抑制效果中起重要作用。

如图3e-3f，为图3c-3d实验的明场显微镜观察图，可以发现加入过氧化氢酶之后，met和cap联用对细胞形态的影响消失了(图e-f中cap+met+cat组)；用met与h2o2联用明显使细胞变圆(图e-f中met+h2o2)组，与met与cap联用时现象类似。说明cap产生的h2o2在met和cap的协同抑制效果中起重要作用。

以上实验说明由低温等离子产生的h2o2在低温等离子体和二甲双胍的协同抑制效果中有重要作用。通过该实验结果，一方面能对低温等离子体和二甲双胍的协同抑制机理进行研究，另一方面可为设计以低温等离子体和二甲双胍联用为基础的胶质瘤治疗方案、产品或装置等提供参考。需要理解的是，虽然以上实验说明cap产生的h2o2在met和cap的协同抑制效果中起重要作用，仅是对其协同抑制效果的机理进行探索，为其应用提供更多的参考，但并非说明可以直接采用h2o2代替cap与met联用。主要原因在于：h2o2在医学中的应用主要在于消毒，极少见其用于疾病的治疗，部分原因由于h2o2的氧化性不仅会对病害细胞有损伤，对正常细胞也有损伤，而cap是已经验证过的能够在一定剂量内能够选择性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞没影响。

实施例四进行低温等离子体和二甲双胍的协同抑制效果机理的进一步分析实验

将u251、u87胶质瘤细胞在96孔板中培养12小时后，加入16毫摩尔的二甲双胍，继续培养12小时，再用低温等离子体处理30秒，继续培养12小时后，分别收集rna和蛋白质，实验结果如图4所述。

如图4a-4b，胶质瘤细胞系u251(图4a)、u87细胞系(图4b)培养12小时后，加入16毫摩尔/升的met，继续培养12小时后，再用cap处理30秒，12小时后收集细胞提取rna，用q-pcr检测相关基因的表达情况。可以发现，met和cap联用可以显著提高hspa6和c-fos的mrna水平(4a、4b图中横坐标表示基因种类，纵坐标表示基因的相对表达量，con代表对照组，met代表met单独处理的组，cap代表cap单独处理的组，con代表met和cap联合处理的组)。

如图4c，胶质瘤细胞系u251(4c左图)、u87细胞系(图4c右图)培养12小时后，加入16毫摩尔/升的met，继续培养12小时后，再用cap处理30秒，12小时后收集细胞提取蛋白质，可以发现met和cap联用提高了c-fos的蛋白表达水平，但对hspa6和c-parp的表达没有影响，实验说明met和cap联用能够显著提高c-fos的mrna和蛋白水平表达。(图中的黑色横条颜色越深越粗代表表达量越高，β-actin代表内参)。

如图4d，胶质瘤细胞系u251(4d左图)、u87细胞系(图4d右图)培养12小时后，加入16毫摩尔/升的met，继续培养12小时后，分别做以下实验：(图中cat-，met+，cap+组)再用cap处理30秒，12小时后检测相关蛋白表达水平；(图中cat+，met+，cap+组)，加入300u的过氧化氢酶，再用cap处理30秒，12小时检测细胞活力；发现met和cap联用提高了c-fos的蛋白表达水平(图中cat-，met+，cap+组)，而加入cat(过氧化氢酶简写)后，met和cap联用后c-fos蛋白水平没有变化。

如图4e，胶质瘤细胞系u251(4e左图)、u87细胞系(图4e右图)培养12小时后，分别做以下实验：(图中met+，h2o2+组)加入16毫摩尔/升的met，继续培养12小时后，在细胞中加入h2o2，12小时后收集蛋白。而met与h2o2联用也提高了c-fos的表达量，只加入met和只加入h2o2的c-fos表达量没有变化。

进一步说明cap产生的h2o2在met和cap的联用中起重要作用，且联合作用的结果是使c-fos的表达量上调了。这说明低温等离子体和二甲双胍对细胞的协同抑制效果可能是通过c-fos通路实现的。通过该实验的结果可为设计以低温等离子体和二甲双胍联用为基础的胶质瘤治疗方案、产品或装置提供进一步的参考。

图1-4中标尺代表100微米，**表示p≤0.01,***表示p≤0.001,****表示p≤0.0001。

本发明的实施例中，通过使用神经胶质瘤细胞系u251和u87作为究对象，研究了二甲双胍和低温等离子体联用在诱导神经胶质瘤死亡的应用，通过实施例一和施例二的结果可以得出，二甲双胍和低温等离子体联用对体外培养的胶质瘤细胞系u251、u87细胞具有明显的协同抑制作用，能显著诱导细胞死亡。说明二甲双胍对神经胶质瘤细胞进行预处理可增强肿瘤细胞对低温等离子体的敏感性，这可能是神经胶质瘤的潜在治疗策略。本发明用于体外研究而非疾病治疗，通过本发明提供的二甲双胍和低温等离子体联用在诱导神经胶质瘤死亡的应用的方案可研究低温等离子体与二甲双胍联用在胶质瘤治疗方面的应用，以期为设计治疗胶质瘤的新产品或新方案提供新的思路。进一步的，通过实施例三和实施例四的结果可以看出低温等离子体产生的h2o2在协同抑制作用中具有重要作用；二甲双胍和cap共同处理后，c-fos的转录和蛋白水平显着增加；说明低温等离子体和二甲双胍对细胞的协同抑制效果可能是通过c-fos通路实现的。通过这些实验的结果可为设计以低温等离子体和二甲双胍联用为基础的胶质瘤治疗方案、产品或装置提供进一步的参考。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。