一种冠状病毒疫苗的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种针对冠状病毒的疫苗。


背景技术：

2.新型冠状病毒(sars-cov-2(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)，或2019-ncov)感染已全球性流行，开发有效性疫苗刻不容缓。采用传统策略制备疫苗包括灭活病毒疫苗、dna疫苗、mrna疫苗或者蛋白质疫苗等，其目标是激活b细胞，产生保护性中和抗体。然而，传统疫苗基本都是预防性疫苗，难以发挥治疗性疫苗的效果。面对数十万感染患者，研制出治疗性疫苗是当务之急。本发明制备出一种同时具备预防性和治疗性的疫苗，为新冠肺炎(covid-19(corona virus disease 2019))的预防和治疗提供一种新的治疗方法。
3.机体针对病毒蛋白可产生多种抗体，然而，只有表面抗体才有效，因此传统的组分疫苗都是针对冠状病毒颗粒表面spike蛋白进行研发的，这类抗体不能有效清除藏匿在细胞内的病毒。因此，对病毒的最终清除还得依赖于特异性t细胞，t细胞是病毒感染免疫的关键因素，特异性t细胞激活的时间远远小于b细胞产生特异性抗体所需时间，24至48小时就有较多数量 t细胞被扩增出来，其进入感染部位，通过识别病毒感染的细胞表面的mhc
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病毒抗原肽复合体，高效杀伤被感染的细胞，从而从根本上清除病毒。由于产生速度更快，因此t细胞更适用于作为治疗型疫苗使用。
4.有研究证明，凋亡细胞释放的微颗粒(microparticle，mp)可以作为高效的疫苗激活特异性t细胞免疫反应。mp是由细胞膜包裹细胞内容物所形成的一类大小在几百纳米间的囊泡状结构物质，具备优势疫苗的两个关键点：一是具有强大的携带抗原能力，二是适当有效的共刺激信号。例如，李斯特菌感染的巨噬细胞来源的mp，包含李斯特菌抗原，经dc提呈激活李斯特菌特异性t细胞
1.；而ova-b16肿瘤细胞来源的mp，含有肿瘤抗原，激活特异性cd8+t细胞
[2,3]
。t-mp(t代表tumor cell)的共刺激信号，是因为其囊腔包含了线粒体dna片段，其能够有效激活cgas-sting途径，诱导i型干扰素产生
[2]
。另外，t-mp进入dc的溶酶体，激活nadph氧化酶系统，一方面升高溶酶体的ph值，促进肿瘤抗原肽更高效产生，一方面通过ros信号上调cd80、cd86及il-12的表达
[3]
。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供针对冠状病毒的疫苗，所述疫苗作为预防和治疗冠状病毒感染导致的相关疾病的疫苗和/或药物。
[0006]
本发明的第二个目的是提供含有所述冠状病毒疫苗的药物组合物。
[0007]
本发明的第三个目的是提供所述疫苗和/或药物组合物在制备预防和治疗与冠状病毒感染相关疾病中的用途。
[0008]
根据本发明的一个方面，一种冠状病毒疫苗，包含凋亡细胞释放的微颗粒，所述凋亡细胞释放的微颗粒包括凋亡细胞释放的囊泡状结构物质和包裹于所述囊泡状结构物质
中的冠状病毒来源的抗原。
[0009]
本发明所述的冠状病毒疫苗，通过将来源于人的细胞与选自药剂、放射线和/或紫外线的任一种接触而致所述细胞凋亡并释放出囊泡状结构物质，优选的来源于人的细胞为可进行培养的人源细胞株。
[0010]
本发明所述的冠状病毒疫苗，其中所述冠状病毒来源的抗原优选的可以为可激活特异性t细胞的冠状病毒组分蛋白；优选的冠状病毒组分蛋白可以选自冠状病毒的spike蛋白、核衣壳蛋白、包膜蛋白和开放读码框1ab蛋白。
[0011]
作为本发明的优选实施方案，凋亡细胞释放的微颗粒的粒径为50-1000nm，更优选的是50-500nm。
[0012]
应用本发明的概念和方法，通过选择不同的病毒抗原，可以制备针对不同冠状病毒的疫苗，例如，针对sars-cov-2病毒的疫苗。
[0013]
用作包裹病毒抗原的微颗粒，可以使用任何能使人源细胞凋亡的方法获得，这些使人源细胞凋亡的方法包括但不限于：将人源细胞与各种药剂、放射线、紫外线接触，使得细胞凋亡，形成囊泡状结构物质。再将所需要的病毒抗原与凋亡的细胞接触，使所述病毒被包裹进入囊泡状结构物质中，获得本发明的病毒疫苗。或者，将人源细胞与表达病毒抗原的表达载体共培养，将所述病毒抗原转染入人源细胞，再使所述人源细胞凋亡，获得包裹有病毒抗原的囊泡。
[0014]
在一个优选实施方案中，本发明所述的冠状病毒疫苗可通过下述方法制备：
[0015]
构建过表达病毒组分蛋白的人源细胞：将病毒组分蛋白转染培养的人源细胞株，筛选获得过表达病毒组分的人源细胞；
[0016]
体外大量培养所述过表达病毒组分的人源细胞，采用紫外线uvb照射使其凋亡；
[0017]
收集凋亡细胞释放的微颗粒，获得所述冠状病毒疫苗。
[0018]
本发明所述的方案中，优选使用紫外照射诱导人源细胞凋亡，对于囊泡状结构物质(细胞囊泡)的收集可使用常规离心机和冷冻高速离心机在低温条件下或室温条件下进行分离。优选的，通过高速离心机，在低温条件下(4℃左右)，以500-50,0000g的离心力，收集细胞囊泡。同样的，对于包裹病毒抗原的微颗粒的收集也可使用超速离心机在低温条件下进行。优选的，通过离心机，在低温条件下(4℃左右)，以500-50,0000g的离心力，收集包裹病毒抗原的微颗粒。优选的收集微颗粒的方法为密度梯度离心法，以1000-50,0000g的离心力，收集微颗粒。
[0019]
对于所收集到的包裹病毒抗原的微颗粒，可以按照常规方法制成药物制剂，包括但不限于如皮下注射和/或静脉注射的注射剂，口服剂，雾化治疗的喷雾剂等。
[0020]
本领域技术人员可根据所要预防和/或治疗的冠状病毒感染类型及所使用的作为病毒抗原类型的不同，根据以上描述的基于人源细胞来源的冠状病毒疫苗的制备方法，选择适当的诱导人源细胞凋亡的方法，收集包裹病毒抗原的细胞囊泡的方法及合适的细胞囊泡与病毒抗原的量的比例等条件，只要最终获得的囊泡状结构物质内包裹的作为抗原成分的冠状病毒组分蛋白足以发挥所期望的预防和/或治疗效果即可。
[0021]
根据本发明的另一方面，也提供含有本发明病毒疫苗的药物组合物，可以将本发明的冠状病毒疫苗添加药学和/或生理学上可接受的各种辅料和/或添加剂而制备药物组合物。
[0022]
本发明的冠状病毒疫苗除了作为预防型疫苗预防冠状病毒感染外，还可以作为治疗型疫苗使用。作为治疗型疫苗使用时，可以用于治疗sars-cov-2病毒感染导致的相关疾病，包括但不限于新冠肺炎(covid-19)，也可以用于治疗病毒感染治疗后的复阳和无症状患者。
附图说明
[0023]
图1为流式细胞仪检测稳定过表达sars-cov-2spike(s1)的细胞的筛选；
[0024]
图2流式细胞仪检测mps表面sars-cov-2spike(s1)的表达情况；
[0025]
图3显示elisa检测小鼠t细胞过表达spike s1的mps中ifn-γ和 granzyme b的表达情况；
[0026]
图4显示elisa检测人t细胞过表达spike s1的mps中ifn-γ和 granzyme b的表达情况；
[0027]
图5显示小鼠ctl对sars-cov-2感染细胞的杀伤效果；
[0028]
图6显示人ctl对sars-cov-2感染细胞的杀伤效果。
具体实施方式
[0029]
为了说明本发明的技术方案，下面结合附图和实施例进一步说明本发明，下述实施例不构成对本发明的任何限制。
[0030]
本发明使用的术语“微颗粒(microparticle，mp)”是由凋亡细胞产生的，具有囊泡状结构，其中包裹内容物；“细胞囊泡”是由凋亡细胞产生的，没有包裹内容物；“冠状病毒”为套式病毒目(nidovirales)冠状病毒科 (coronaviridae)冠状病毒属(coronavirus)的一类病毒，其是一类具囊膜 (envelope)、基因组为线性单股正链的rna病毒。sars-cov-2(2019新型冠状病毒，或称2019-ncov)是其中的一种，感染后可能引发新型冠状病毒肺炎covid-19。
[0031]
下述为实施例中使用的各种肿瘤细胞、药物、实验动物、仪器设备未特别言明均为市售商购。
[0032]
实施例1：构建过表达spike s1蛋白的细胞
[0033]
1.实验设备和材料：
[0034]
bd facs canto ii流式细胞仪
[0035]
sars-cov-2(2019-ncov)spike(s1)开放阅读框哺乳动物表达质粒购自北京义翘神州；
[0036]
sars-cov spike antibody抗体，cat:40150-d001，该抗体与 sars-cov-2(2019ncov)spike s1蛋白有交叉反应，购自北京义翘神州；
[0037]
lipofectamine3000购自invitrogen；
[0038]
g418 geneticin抗生素购自gibco，货号11811-031；
[0039]
无内毒素质粒小提中量试剂盒购自tiangen，目录号dp118；
[0040]
llc(lewis鼠源性肺腺癌细胞)、a549(腺癌人类肺泡基底上皮细胞)、 beas-2b(人正常肺上皮细胞)和293t细胞(转染腺病毒e1a基因的人肾上皮细胞系，表达sv40大t抗原)购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
[0041]
2.实验步骤：
[0042]
1)扩增sars-cov-2spike(s1)质粒：质粒转化感受态细菌，用含氨苄抗性的lb培养皿过夜培养；涂板培养，挑单克隆扩大培养，采用质粒提取试剂盒抽提质粒。
[0043]
2)采用脂质体转染试剂lipofectamine3000将sars-cov-2spike(s1)质粒分别转染llc、a549、beas-2b和293t细胞；
[0044]
3)筛选单克隆细胞株，构建稳定细胞株：培养48小时后的感染细胞按 0.5个细胞/孔接种到96孔板，用含5μg/ml嘌呤霉素及10％fbs的rpmi1640培养基进行筛选培养。将单克隆生长的细胞转到24孔板扩大培养。
[0045]
4)在细胞中加入sars-cov-2spike抗体，再加入pe荧光二抗，筛选出过表达spike s蛋白的单克隆细胞株，对稳定筛选出来的细胞株进行扩大培养。
[0046]
3.实验结果：筛选出稳定过表达sars-cov-2spike(s1)的细胞， llc-hs1、a549-hs1、beas-2b-hs1和293t-hs1。如图1。
[0047]
实施例2：制备过表达spike s1蛋白的微颗粒，并检测其表面spike s1 蛋白的表达情况。
[0048]
1.实验设备和材料：
[0049]
uvb紫外线灯管为飞利浦uvb 311nm tl 100w/01紫外线灯管；
[0050]
高速冷冻离心机为上海卢湘，型号gl-21ms；
[0051]
bd facscanto ii流式细胞仪；
[0052]
sars-cov spike antibody抗体，cat:40150-d001，该抗体与sars-cov-2 (2019ncov)spike s1蛋白有交叉反应，购自北京义翘神州；
[0053]
g418 geneticin抗生素购自gibco，货号11811-031；
[0054]
无内毒素质粒小提中量试剂盒购自tiangen，目录号dp118；
[0055]
四种过表达sars-cov-2spike(s1)的细胞llc-hs1、a549-hs1、 beas-2b-hs1和293t-hs1(按照实施例1的方法制备)。
[0056]
2.实验步骤：
[0057]
1)微颗粒mp的制备：以制备llc-hs1细胞来源mp为例，其他三株细胞方法相同。体外大量培养llc-hs1细胞，每皿细胞数为1
×
108。采用 gibco rpmi-1640培养基，添加10％四季青胎牛血清培养，20ml/皿。培养在二氧化碳培养箱，条件为37℃，5％co2。采用紫外线uvb照射，强度300j/m2，照射时间1小时，放在37℃，5％co2条件的二氧化碳培养箱中，培养时间 24小时。细胞收集到50ml高速离心管，加等体积pbs缓冲液稀释。离心步骤如下：500g
×
8min，取上清液；转换新的离心管，将上清液再离心， 3000g
×
5min，再取上清；14000g
×
2min，4℃，转换新的离心管，将上清液再离心，14000g
×
60min，4℃；倒掉上清液，预冷pbs洗涤离心管内表面2次，加入1ml新的预冷pbs重悬管底囊泡沉淀，得到llc-hs1-mps。同样，制备 a549-hs1-mps、beas-2b-hs1-mps和293t-hs1-mps。
[0058]
2)检测llc-hs1-mps表面sars-cov-2spike(s1)的表达情况：流式检测管中加入100μlpbs重悬的llc-hs1-mps，然后加入1μlsars-cov-2 spike抗体，30min后加入3ml pbs，14000g
×
60min离心洗掉多余的抗体； 100μlpbs重悬后加入pe荧光二抗，避光冰浴孵育30min，加入3ml pbs，然后14000g
×
60min；0.5ml pbs重悬mps，流式细胞仪检测mps表面 sars-cov-2spike(s1)的表达情况。
[0059]
3.实验结果：llc-hs1制备的mps表面高表达sars-cov-2spike (s1)蛋白。a549-hs1-mps、beas-2b-hs1-mps和293t-hs1-mps结果同样。如图2所示。
[0060]
实施例3：体外验证过表达spike s1的mps对t细胞的激活作用。
[0061]
1.实验设备和材料：
[0062]
nest 6孔细胞培养板(非tc处理)货号703011；
[0063]
c57bl/6小鼠购自湖北省疾病预防控制中心下属的湖北省医学实验动物研究中心；
[0064]
人血液来自于正常自愿者；
[0065]
重组小鼠和人的gm-csf、il-4和il-2购自peprotech公司；
[0066]
biotin anti-mouse cd3antibody和biotin anti-human cd3antibody购自 ebioscience公司；
[0067]
streptavidin microbeads(2ml)购自美天旎公司；
[0068]
小鼠干扰素-γ(inf-γ)elisa试剂盒、人干扰素-γ(inf-γ)elisa试剂盒和小鼠颗粒酶素(granzyme b)elisa试剂盒和人颗粒酶素(granzyme b) elisa试剂盒购自r&d公司。
[0069]
2.实验步骤：
[0070]
小鼠t细胞活化实验
[0071]
1)小鼠dc(树突状细胞)细胞的分离和培养：无菌条件下取小鼠四肢骨，pbs冲洗2次后，放入新平皿中，吸取10ml 1％fbs的rpmi1640培养基放入平皿中，剪除腿骨两端部位，用2ml注射器吸取培养基冲洗骨髓腔, 直至将红色骨髓都吹出，腿骨呈现白色为止。反复吹打红色骨髓，采用200 目筛网过滤，1300rpm
×
8min离心。弃上清，加入2ml红细胞裂解液常温孵育5分钟，加入5ml 1％fbs rpmi1640培养液中和，1300rpm
×
8min离心弃上清，加10ml 1％fbs的pbs吹打洗涤2次，10％fbs的rpmi1640培养基重悬，计数。采用悬浮细胞培养6孔板，每孔2
×
105个细胞，加入3ml添加 20ng/ml gm-csf和10ng/ml il-4的10％fbs rpmi1640培养液。37℃， 5％co2，隔天半量换液，并补充细胞因子。培养6天后收集悬浮和半贴壁的未成熟的dc。用llc-hs1-mps处理小鼠未成熟的dc mps与dc比例为 1:100，24小时后离心收集处理好的dc细胞，计数。
[0072]
2)小鼠t细胞的分离：取小鼠脾脏，用磨砂的载玻片进行碾磨、吹打，经过200目过滤网过滤制成细胞悬液。400g
×
8min离心，弃上清后，加入 5ml红细胞裂解液孵育5min裂红，1％fbs的pbs中和，400g
×
8min离心，洗涤3次。弃上清，500μl pbs重悬沉淀，加入biotin anti-mouse cd3(1μ l，1
×
107cells)，冰上孵育15min。labeling buffer洗一次，1300rpm
×
8min 离心，弃上清，用450μl labeling buffer重悬细胞，加入50μl macs的 streptavidin microbeads混匀，4℃孵育15min。预先润洗分选柱，而后将500 μl细胞悬液通过柱子，再用500μl labeling buffer洗三次。卸下柱子，放在15ml离心管上，加入1ml labeling buffer将柱子中吸附的细胞推出，即为 cd3阳性的细胞。1％fbs pbs洗两遍，500g
×
8min离心，计数。
[0073]
3)小鼠t细胞活化检测：将t cells和mps处理过的dc细胞混合种在圆底96孔板中，t细胞/dc为10:1，加入il-2(30u/ml)。4天后，elisa 检测各组ifn-γ和granzyme b的表达情况。
[0074]
人t细胞活化实验
[0075]
1)人dc细胞的分离和培养：dc细胞的分离。取健康志愿者的静脉血20ml于抗凝管中，pbs稀释后使用淋巴细胞分离液ficoll分离pbmc。将得到的pbmc重悬于gt551无血清培养基中，加入至6孔板中培养2-4h，贴壁细胞即为dc的前体细胞，悬浮细胞即为t细胞。分离两种细胞，贴壁的dc前体细胞使用含有20ng/ml gm-csf和10ng/ml il-4的gt551培养基培养，隔天半量换液补充细胞因子，诱导培养dc细胞5天，第6天收集悬浮和半贴壁的未成熟的dc。用293t-hs1-mps处理人未成熟的dc，，mps与dc比例为1:100，24小时后离心收集处理好的dc细胞，计数。
[0076]
2)悬浮的t细胞收集后加入新的6孔板中，使用含有il-2的551培养基培养t细胞5天，收集计数。
[0077]
3)人t细胞活化检测：将t cells和mps处理过的dc细胞混合种在圆底96孔板中，t细胞/dc为10:1，加入il-2(30u/ml)。4天后，elisa检测各组ifn-γ和granzyme b的表达情况。
[0078]
3.实验结果：高表达spike s1的mps处理的dc可以活化特异性t细胞，使其高表达ifn-γ和granzyme b。如图3和图4所示。
[0079]
4.实施例4：体外实验检测ctl(细胞毒性t淋巴细胞)细胞对表达spike
[0080]
s1的巨噬细胞，树突状细胞和肺上皮细胞的杀伤
[0081]
1.实验设备和材料：
[0082]
分选式流式细胞仪型号为bd facsariaⅲ；
[0083]
abi7500荧光定量pcr仪；
[0084]
fitc anti-mouse cd3 antibody和apc anti-mouse cd8 antibody购自 biolegend；
[0085]
2.实验步骤：
[0086]
小鼠ctl杀伤表达spike s1的巨噬细胞实验
[0087]
1)按照实施例3制备活化的小鼠t细胞，用流式分选分离出cd8+ctl 做杀伤细胞用。
[0088]
2)制备过表达spike s1蛋白的小鼠巨噬细胞来模拟病毒感染：调整巨噬细胞浓度为5
×
104/ml，加入到96孔板中，每孔200μl(1
×
104)。将表达spike s1基因的腺病毒加入细胞孔中，moi＝5.0，培养12小时后，更换新鲜培养基，嘌呤霉素筛选，48h后检测巨噬细胞中spike s1的表达。
[0089]
3)检测小鼠ctl对过表达spike s1蛋白的巨噬细胞的杀伤效果：以过表达spike s1巨噬细胞作为靶细胞，调整细胞浓度为1
×
106/ml，加入到 96孔板中，每孔100μl(1
×
105)。将上述制备的ctl细胞与靶细胞按 40/1、20/1、10/1加入96孔板中，复种三孔，以空白对照和正常巨噬细胞作对照。培养4小时后收集各孔上清，ldh检测试剂盒检测各孔的杀伤效率。
[0090]
人ctl杀伤表达spike s1的肺上皮细胞和巨噬细胞实验
[0091]
1)按照实施例3制备活化的人t细胞，用流式分选分离出cd8+ctl做杀伤细胞用。
[0092]
2)制备过表达spike s1蛋白的人肺上皮细胞beas-2b或巨噬细胞来模拟病毒感染：调整beas-2b或巨噬细胞浓度为5
×
104/ml，加入到96 孔板中，每孔200μl(1
×
104)。将表
达spike s1基因的腺病毒加入细胞孔中，moi＝5.0，培养12小时后，更换新鲜培养基，嘌呤霉素筛选， 48h后检测beas-2b或巨噬细胞中spike s1的表达。
[0093]
3)检测人ctl对过表达spike s1蛋白的beas-2b或巨噬细胞的杀伤效果：以过表达spike s1beas-2b或巨噬细胞作为靶细胞，调整细胞浓度为1
×
106/ml，加入到96孔板中，每孔100μl(1
×
105)。将上述制备的ctl细胞与靶细胞按40/1、20/1、10/1加入96孔板中，复种三孔，以正常beas-2b或巨噬细胞作对照。培养4小时后收集各孔上清，ldh 检测试剂盒检测各孔的杀伤效率。
[0094]
3.实验结果：高表达spike s1的mps诱导的t细胞能够高效杀伤表达表达spike s1的巨噬细胞，而对正常细胞无明显杀伤作用，如图5和图 6所示，说明spike s1的mps可以有效诱导特异性的ctl，进而杀伤表达spike s1的细胞。
[0095]
病毒spike s2蛋白，包膜蛋白(envelope protein，e)、膜蛋白(membraneglycoprotein，m)，核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，n)以及开放读码框 1ab蛋白(orf1ab polyprotein)也可以按照此方法制备相应蛋白的过表达mps，同样做成疫苗，单用或联用用来预防和治疗新冠肺炎。
[0096]
参考文献：
[0097]
1.zhang y,zhang r,zhang h,liu j,yang z,xu p,cai w,lu g, cui m,schwendener ra,shi hz,xiong h,huang b*.microparticles released by listeria monocytogenes-infected macrophages are required for dendritic cell-elicited protective immunity.cell mol immunol.2012 nov；9(6):489-96.
[0098]
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