甲基萘醌-4用于制备防治中枢神经系统缺氧性疾病的药品的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及甲基萘醌-4在制备预防和/或治疗中枢神经系统缺氧性疾病的药品中的应用。

背景技术：

少突胶质细胞是中枢神经系统有髓神经纤维髓鞘的形成细胞和脑白质的重要组成细胞。少突胶质细胞除了以上功能外，还具有营养和保护轴突；为中枢神经系统提供神经营养因子和生长因子，产生轴突生长抑制因子等作用。临床上少突胶质细胞与中枢神经系统疾病如多发性硬化症、脊髓损伤、脑白质损伤等有着重要联系，同时少突胶质细胞和神经元一样对缺氧极为敏感，缺氧造成的中枢神经系统细胞损伤和死亡是各种脑疾病的发生和发展的病理基础，如缺氧是导致新生儿脑白质损伤的最主要原因。

但目前临床上针对治疗少突胶质细胞缺氧性损伤疾病的药物疗效并不显著。因此，研究少突胶质细胞的缺氧损伤机制和寻找缺氧少突胶质细胞的保护剂将会对脑白质损伤、脱髓鞘脑病等中枢神经系统缺氧性损伤具有重要意义。

甲基萘醌-4（menaquinone-4,mk-4）又称为维生素k2（vitamink2,vk2），在除肝脏以为器官中，vk2均将转换成mk-4。同时，mk-4是脑中维生素k主要活性形式。现有研究表明：mk-4可以促进胚胎后期皮层、海马和纹状体的神经元细胞存活；mk-4能够抑制脂多糖诱导的小胶质细胞炎症反应；mk-4可降低发育中胚胎皮层神经元和少突胶质前体细胞氧化应激损伤。这些研究均表明mk-4在抗氧化应激和抗炎中起到一定作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供甲基萘醌-4在制备防治中枢神经系统缺氧性疾病的药品中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

甲基萘醌-4在制备提高缺氧少突胶质细胞活性的药品中的应用。

甲基萘醌-4在制备保护缺氧少突胶质细胞线粒体的药品中的应用。

甲基萘醌-4在制备降低缺氧少突胶质细胞il-1β、il-6和/或tnf-α的药品中的应用。

甲基萘醌-4在制备预防和/或治疗中枢神经系统缺氧性疾病的药品中的应用。

甲基萘醌-4在制备预防和/或治疗中枢神经系统缺氧性疾病的保健食品中的应用。

本发明通过大鼠少突胶质细胞的培养，研究了甲基萘醌-4对缺氧少突胶质细胞的作用，发明人发现缺氧可导致少突胶质细胞大量死亡，并且此作用可能是通过线粒体大量释放ros和促炎细胞因子大量表达引起的；但可以改善因缺氧导致的少突胶质细胞大量ros释放和促炎因子表达，进而起到了保护细胞的作用，这为临床上防治和治疗缺氧导致的中枢神经系统疾病提供帮助。

附图说明

图1为实施例1中mk-4对缺氧4h的少突胶质细胞活力的影响，^#p<0.05vsdmso处理正常氧含量组，*p<0.05vsdmso处理缺氧组。

图2为实施例1中mk-4对缺氧6h的少突胶质细胞活力的影响，^#p<0.05vsdmso处理正常氧含量组，*p<0.05vsdmso处理缺氧组。

图3为实施例1中mk-4对缺氧12h的少突胶质细胞活力的影响，^#p<0.05vsdmso处理正常氧含量组，*p<0.05vsdmso处理缺氧组。

图4为实施例2中mk-4对缺氧少突胶质细胞ros产生影响的实验结果，a为oln-93经dhe染色，共聚焦检测细胞内ros产生；b为图a中单位面积平均荧光强度定量。其中：a为dmso处理正常氧含量组、b为dmso处理缺氧组、c为mk-4处理正常氧含量组、d为mk-4处理缺氧组，^#p<0.05vsdmso处理正常氧含量组，*p<0.05vsdmso处理缺氧组。

图5为实施例3中mk-4对缺氧少突胶质细胞促炎因子il-1βmrna表达的实验结果，其中：n+d为dmso处理正常氧含量组、n+m为mk-4处理正常氧含量组、h+d为dmso处理缺氧组、h+m为mk-4处理缺氧组，^#p<0.05vsn+d组，*p<0.05vsh+d组。

图6为实施例3中mk-4对缺氧少突胶质细胞促炎因子il-6mrna表达的实验结果，其中：n+d为dmso处理正常氧含量组、n+m为mk-4处理正常氧含量组、h+d为dmso处理缺氧组、h+m为mk-4处理缺氧组，^#p<0.05vsn+d组，*p<0.05vsh+d组。

图7为实施例3中mk-4对缺氧少突胶质细胞促炎因子tnf-αmrna表达的实验结果，其中：n+d为dmso处理正常氧含量组、n+m为mk-4处理正常氧含量组、h+d为dmso处理缺氧组、h+m为mk-4处理缺氧组，^#p<0.05vsn+d组，*p<0.05vsh+d组。

图8为实施例4中mk-4对缺氧大鼠少突胶质细胞oln-93内gas6mrna表达的影响结果。其中：^#p<0.05vsdmso处理正常氧含量组，*p<0.05vsdmso处理缺氧组。

具体实施方式

少突胶质细胞和神经元一样对缺氧极为敏感，缺氧造成的中枢神经系统细胞损伤和死亡是各种脑疾病的发生和发展的病理基础。本发明通过大鼠少突胶质细胞的培养，研究mk-4对缺氧少突胶质细胞的作用，并探讨其作用机制，为临床上防治和治疗缺氧导致的中枢神经系统疾病提供帮助。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

实施例1

mk-4对缺氧少突胶质细胞活性的影响

为探究在缺氧环境下mk-4对少突胶质细胞活性的影响，本实施例以dmso为对照，采用5个不同mk-4浓度（1μm、2μm、4μm、8μm、15μm）和3个缺氧时间点（缺氧4h、缺氧6h、缺氧12h）对大鼠少突胶质细胞oln-93进行cck-8实验。

oln-93细胞按每孔10⁴细胞接种于96孔板，每孔100μl细胞悬液，置于培养箱。次日，细胞均分为正常氧含量组和缺氧组，分别用0.01%dmso或者1μm、2μm、4μm、8μm、15μm的mk-4处理细胞，分别孵育4h、6h、12h。每种浓度设置3个复孔，实验重复3次。终止孵育，每孔加入10μlcck-8溶液，培养箱内孵育2h。用tecanm200酶标仪测定在450nm处各孔的吸光度。

结果显示在缺氧4h、6h和12h后，细胞活性均显著下降。如图1所示，mk-4浓度在2μm、4μm、8μm时可以显著提高缺氧4h的少突胶质细胞活性。如图2和图3所示，mk-4浓度在2μm、4μm、8μm、15μm时可以显著提高缺氧6h和12h少突胶质细胞的活性。

由以上结果可知，2μm、4μm、8μm浓度的mk-4对缺氧少突胶质细胞的活性有显著提高的作用。综合实验结果，选择8μmmk-4和缺氧12h进行后续研究。

实施例2

mk-4降低缺氧少突胶质细胞内ros的产生

由于缺氧会影响线粒体的功能，为探究mk-4对缺氧少突胶质细胞线粒体功能的影响，本实施例采用dhe染色，以dmso为对照、选择8μmmk-4和缺氧12h，检测大鼠少突胶质细胞oln-93线粒体释放ros的含量。细胞染色荧光强度与胞内ros含量成正相关，荧光强度越高，则胞内ros含量越高。

oln-93细胞接种于24孔板，用dhe染色检测细胞内线粒体释放活性氧(radicaloxygenspecies,ros)的量。正常氧含量组和缺氧组分别用0.01%dmso或者8μmmk-4处理细胞，孵育12h。pbs清洗细胞3遍，每遍15min。每孔加入50μmdhe，避光37℃孵育30min。采用激发光480-535nm共聚焦显微镜拍片。利用imagej软件计算单位面积平均荧光强度，统计比较正常氧含量组合缺氧组之间差异。实验重复3次，每组统计30个细胞。

如图4所示，少突胶质细胞在缺氧12h后，胞内红色荧光强度显著增强；但当加入8μmmk-4后，胞内荧光强度对比加入dmso的缺氧组则明显减弱。

上述结果表明缺氧可以影响少突胶质细胞线粒体功能，进而导致胞内ros的大量释放，但mk-4可以明显降低缺氧少突胶质细胞内ros的产生，进而达到保护细胞线粒体的作用。

实施例3

mk-4抑制缺氧少突胶质细胞内促炎因子的表达

已知线粒体与炎症关系密切，且缺氧又与炎症密切联，ros又可介导炎症反应。

根据实施例2的结果可知mk-4可以降低缺氧少突胶质细胞线粒体ros的产生，本实施例将对mk-4是否参与缺氧少突胶质细胞的炎症反应进行研究。

为研究mk-4对缺氧少突胶质细胞分泌促炎细胞因子基因的影响，正常氧含量组和缺氧组分别用0.01%dmso或者8μmmk-4处理细胞，孵育12h。用trireagnet提取各实验组细胞的总rna，用逆转录试剂盒合成cdna。利用primer3softwareversion1.0设计白介素-1beta(interleukin-1beta,il-1β)、白介素-6(interleukin-6,il-6)和肿瘤坏死因子-alpha(tumornecrosisfactoralpha,tnf-α)和β-actin的引物。

如图5、图6、图7所示，当oln-93细胞缺氧12h后，胞内促炎细胞因子il-1β、il-6、tnf-α的mrna水平明显升高；但当用8μmmk-4处理缺氧细胞，其胞内il-1β、il-6、tnf-α的mrna水平相较于dmso处理缺氧组则明显降低。

以上结果表明，缺氧可以导致少突胶质细胞内促炎因子的表达增加，引起细胞的炎症，但mk-4可以有效降低缺氧引起的少突胶质细胞炎症反应，进而达到保护细胞的作用。

实施例4

mk-4提高少突胶质细胞内维生素k依赖性蛋白基因的表达

gas6是维生素k依赖性的蛋白，已有研究指出gas6会影响线粒体功能且可以抑制促炎细胞因子的表达。

根据实施例2和实施例3的结果可知mk-4能抑制缺氧少突胶质细胞的ros产生和炎症反应，本实施例将对gas6是否参与mk-4抑制缺氧引起的少突胶质细胞炎症反应进行研究。

为研究mk-4对缺氧少突胶质细胞维生素k相关蛋白基因的影响，正常氧含量组（normaloxygen）和缺氧组（hypoxia）分别用0.01%dmso或者8μmmk-4处理细胞，孵育12h。用trireagnet提取各实验组细胞的总rna，用逆转录试剂盒合成cdna。利用primer3softwareversion1.0设计生长停滞特异性蛋白6(growtharrest-specific6,gas6)和β-actin的引物。如图8所示，缺氧12h（hypoxia12h）可以使oln-93细胞内gas6基因的mrna水平降低；但当加入8μmmk-4后，细胞内gas6基因的mrna水平则明显升高。

以上结果表明，缺氧会降低少突胶质细胞内gas6的含量，但mk-4却可以显著提高缺氧少突胶质细胞内gas6的表达。综合之前的实验结果，发明人推测gas6可能参与了mk-4对缺氧少突胶质细胞的保护作用。

本发明主要探讨了mk-4在缺氧少突胶质细胞中的作用。通过以上实施例，发明人发现缺氧可导致少突胶质细胞大量死亡，并且此作用可能是通过线粒体大量释放ros和促炎细胞因子大量表达引起的；但mk-4却可以改善因缺氧导致的少突胶质细胞大量ros释放和促炎因子表达，进而起到了保护细胞的作用；并初步探讨gas6可能在mk-4发挥作用的过程中扮演重要角色。为临床上防治中枢神经系统缺氧性疾病和mk-4更广泛地应用提供了一定理论支持。