一种乙酸根调控的阿霉素无载体纳米药物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及纳米药物，具体涉及一种乙酸根调控的阿霉素无载体纳米药物及其制备方法和应用。

背景技术：

目前，化疗是常见的治疗癌症手段，其可弥补手术和放疗的不足和缺陷，但是，由于化疗药物的水溶性低和稳定性有限等缺陷，治疗效果达不到预期。

随着近20年纳米技术的发展，纳米药物克服了恶性肿瘤传统疗法的某些缺点。但是，这些药物载体本身是有惰性的，它们作为药物传输的工具，在体系中所占比重较大，药物负载率低(一般不大于10％)，而且还存在其它问题，比如：毒性大和体内代谢未知等。因此，如何减少甚至不用纳米载体，从而降低毒副作用、提高治疗效率是下一步研究的重要课题。

为了降低纳米载体使用量，近几年，人们提出了无载体纳米药物设计思路并制备了相应的纳米药物。比如：2012年，苏州大学张秀娟教授课题组研究了喜树碱自组装无载体纳米药物的制备，发现其具有比单一药物更好的抗肿瘤功效，随后他们课题组又相继研究了具有高稳定性、高负载率的无载体纳米药物和无载体有机纳米荧光探针。中国科学院国家纳米科学研究员梁兴杰调整了10-羟基喜树碱和dox的比例，通过自组装制备出一种无载体纯纳米药物。

虽然无载体纳米药物比纳米载体药物有更低的毒副作用，但是在应用方面也存在着一定的局限性，比如：目前合成工艺中用到的有机溶剂具有一定的毒性，增加药物毒副作用。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种乙酸离子调控的阿霉素无载体无有机溶剂纳米药物的制备及其应用。本发明通过阿霉素与乙酸离子通过沉淀法形成纳米药物，以解决现有技术中负载率低、有机溶剂毒性较大的问题。

本发明提供的一种乙酸根调控的阿霉素无载体纳米药物，是由阿霉素与乙酸盐通过沉淀法制备得到的。

优选的所述的乙酸盐为乙酸钠、乙酸钾中的任一种。

所述的一种乙酸根调控的阿霉素无载体纳米药物(dox-ac)的制备方法，包括以下步骤：

(1)将阿霉素溶于乙酸盐溶液中，使用超声仪辅助使物料充分溶解混合均匀；

(2)将上述混合溶液置于红外线加热电磁搅拌器上室温避光反应0.5-6h。

(3)待反应结束后高速离心，并用乙酸盐溶液洗涤4次，待洗涤完毕，冷冻干燥即可制得目标产物。

优选的，所述乙酸离子浓度为0.05-1.0mol/l，体积优选为0.5-1.0ml。

优选的，所述阿霉素重量为0.1-1.0mg。

优选的，所述高速离心转速为≥12000rpm。

所述的乙酸根调控的阿霉素无载体纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。

与相关技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明通过阿霉素的胺基与乙酸离子中的羟基形成氢键，利用沉淀法形成的纳米药物负载率高；

2、本发明的制备工艺没有引入其他大分子材料和有机溶剂，因此本发明的乙酸根调控阿霉素无载体纳米药物的也避免了大分子材料引入造成的代谢问题和有机溶剂的较大毒性；

3、本发明的乙酸根调控阿霉素无载体纳米药物制剂组分明确，质量易控，制备工艺绿色简单，易于大规模工业化生产，可在制备抗肿瘤药物中应用。

附图说明

图1乙酸根调控阿霉素无载体纳米药物悬液的照片

图2a不同浓度乙酸盐对阿霉素无载体纳米药物负载率的紫外-可见吸收光谱图

图2b不同浓度乙酸盐对阿霉素无载体纳米药物负载率的影响

图3a作用时间对阿霉素无载体纳米药物负载率的紫外-可见吸收光谱图

图3b作用时间对阿霉素无载体纳米药物负载率的影响

图4a不同阿霉素加入量对阿霉素无载体纳米药物负载率的紫外-可见吸收光谱图

图4b不同阿霉素加入量对阿霉素无载体纳米药物负载率的影响

图5乙酸根调控阿霉素无载体纳米药物的透射电镜图

图6乙酸根调控阿霉素无载体纳米药物的粒径分布图

图7pc13细胞摄取乙酸根调控阿霉素无载体纳米药物的激光共聚焦图

图8p815细胞摄取乙酸根调控阿霉素无载体纳米药物的激光共聚焦图

具体实施方式

以下为实施例中使用的材料：

无水乙酸钠(ch3coona，分子量为82.0)和盐酸阿霉素(dox，c27h29no11·hcl，分子量为579.99)为上海阿拉丁(aladdin)试剂有限公司生产。

实施例1

(1)取棕色反应瓶，先加入1.0ml1.0mol/l的乙酸钠溶液，再向其中加入200μgdox，使用超声仪辅助使物料充分溶解混合均匀；

(2)将上述混合溶液置于红外线加热电磁搅拌器上室温避光反应6h；

(3)待反应结束后以12000rpm高速离心，并用乙酸钠溶液洗涤4次，待洗涤完毕，冷冻干燥即可制得目标产物。用棕色试剂瓶收集所有洗涤液并避光保存，待测定阿霉素负载率。用紫外-可见光分光光谱法检测阿霉素500nm处的吸光度，计算dox的吸附量，经计算可知阿霉素负载率可高达99.55±1.83％。

实施例2

(1)取5个清洗干净的棕色反应瓶，先分别依次加入1.0ml浓度分别为0.05mol/l、0.1mol/l、0.2mol/l、0.6mol/l、1.0mol/l的乙酸钠溶液，再向其中加入200μgdox，使用超声仪辅助使物料充分溶解混合均匀；

(2)将上述混合溶液置于红外线加热电磁搅拌器上室温避光反应6h；

(3)待反应结束后以12000rpm高速离心，并用乙酸钠溶液洗涤4次，待洗涤完毕，冷冻干燥即可制得目标产物。用棕色试剂瓶收集所有洗涤液并避光保存，待测定阿霉素负载率。用紫外-可见光分光光谱法检测阿霉素500nm处的吸光度，计算不同浓度乙酸钠下对dox负载率影响。

结果如图2所示，随着乙酸钠浓度的增大，dox吸附量也随之增大。当乙酸钠浓度为1.0mol/l时，dox负载率最大。

实施例3

(1)取8个清洗干净的棕色反应瓶，加入1.0ml浓度为1.0mol/l的乙酸钠溶液，再向其中加入200μgdox，使用超声仪辅助使物料充分溶解混合均匀；

(2)将上述混合溶液置于红外线加热电磁搅拌器上室温避光分别反应10min、25min、45min、75min、135min、225min、360min、580min；

(3)待反应结束后以12000rpm高速离心，并用乙酸钠溶液洗涤4次，待洗涤完毕，冷冻干燥即可制得目标产物。用棕色试剂瓶收集所有洗涤液并避光保存，待测定阿霉素负载率。用紫外-可见光分光光谱法检测阿霉素500nm处的吸光度，计算不同作用时间对dox负载率影响。

结果如图3所示，随着时间的延长，dox负载率不断增加，6h后达到平衡。

实施例4

(1)取5个清洗干净的棕色反应瓶，加入1.0ml浓度为1.0mol/l的乙酸钠溶液，再分别依次向其中加入100μg、200μg、400μg、600μg、1000μgdox，使用超声仪辅助使物料充分溶解混合均匀；

(2)将上述混合溶液置于红外线加热电磁搅拌器上室温避光反应6h；

(3)待反应结束后以12000rpm高速离心，并用乙酸钠溶液洗涤4次，待洗涤完毕，冷冻干燥即可制得目标产物。用棕色试剂瓶收集所有洗涤液并避光保存，待测定阿霉素负载率。用紫外-可见光分光光谱法检测阿霉素500nm处的吸光度，计算不同作用时间对dox负载率影响。

结果如图4所示，当dox加入量为200μg时，dox负载量为195.1μg，负载率达到97.55％；当dox加入量为200μg时，dox负载量为195.1μg，负载率达到97.55％；当dox加入量为600μg时，dox负载量为593.3μg，负载率达到98.88％；当dox加入量为1000μg时，dox负载量为991.5μg，负载率达到99.15％。

实施例5

为了确认乙酸根调控阿霉素无载体纳米药物的形貌和尺寸大小，将纳米药物超声半小时滴在铜网上制样，待液体挥发，用透射电镜进行观察。此外将超声的纳米药物放入马尔文粒度仪中测量粒径。

图5为所制备纳米药物的透射电镜图，从图中可看出所制得的无载体纳米药物呈棒状。这种形貌的出现是由于乙酸钠的存在，可使阿霉素和乙酸钠通过氢键和范德华力作用，从而诱导dox聚集，形成纳米颗粒。图6为所制备的无载体纳米药物的粒径分析谱图，结果表明当dox加入量为100μg时，dox-naac粒径为1371.7nm，当加入量不断增加，粒径降低到200nm左右。

实施例6

将处于对数生长期的人前列腺癌细胞(pc13)和小鼠肥大细胞(p815)细胞(10％fbs/dmem培养基，5％co2，37℃)按每孔1.0×10³个接种于激光共聚焦专用培养皿中，细胞贴壁后，换1.0ml含无载体纳米药物(5.0μg/ml)的10％fbs/dmem培养基，分别孵育1.0h、6.0h和16.0h，待孵育完毕，冷pbs(ph7.4)洗涤，4％多聚甲醛固定细胞，以dapi染色细胞核，置于镜头下观察无载体纳米药物的分布并拍照记录。dapi的激发波长为405nm，dox的激发波长为488nm。

图7和图8分别为无载体纳米药物孵育处理pc13和p815细胞1.0h、6.0h和16.0h后的激光共聚焦图像，蓝色代表由dapi染色的细胞核，绿色为dox的荧光信号。由图可以看出最初的1.0h，细胞中荧光微弱，表明无载体纳米药物进入细胞量很少，而当时间延长到6.0h时，细胞中有荧光出现但只是位于细胞质中，当孵育时间延长至16.0h后，细胞质和细胞核中都有很强的荧光，且主要位于细胞核中。结果表明该无载体纳米药物可以进入细胞进行药物输送。