维生素K2和维生素D3的组合物及其应用

维生素k2和维生素d3的组合物及其应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，涉及维生素k2和维生素d3的组合物及其应用，具体涉及维生素k2联合维生素d3在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用，尤其在血钙调节中的应用。


背景技术：

2.癌症是危害人类健康最严重的疾病之一，随着环境污染、人口老龄化、加之生活节奏的不断加快及精神压力的不断增加，导致恶性肿瘤的发病率逐年升高，患者递增。到目前为止，科学家已经尝试开发多种策略来预防和治疗癌症。其中，化学疗法常与其他手段进行联合，适用患者最广，但化疗所产生的耐药、脱发、胃肠功能紊乱等毒副作用较大，大大降低了患者的生存质量。故而开发具有抗肿瘤活性与安全性兼备的抗肿瘤药物进行有效的预防与治疗迫在眉睫。
3.维生素k(vitamin k，vk)是一种脂溶性维生素，发现于1929年,是γ-谷氨酸羧化反应的辅酶，催化谷氨酸残基的羧化以产生γ-羧基谷氨酸。1936年，维生素 k首次被鉴定为凝血关键因素，并于1966年由亨里克
·
达姆从紫花苜蓿和腐烂的鱼粉中分离出两种vk，分别是叶绿醌(vk1)和甲基萘醌(vk2)。vk2被命名为甲基萘醌(mk)-n，“n”表示构成3位侧链的不饱和异戊二烯单元的数量，mk-n 的侧链在长度上可以从c5(n＝1)到c70(n＝14)变化(图1)。vk在动物中最常见的形式是甲基萘醌4(mk-4)，由摄入的vk1、vk3和肠道细菌产生的外源性甲基萘醌在体内细胞中进行内源性转化产生。另外一种重要的k族维生素mk-7主要由天然食物比如纳豆中获得，由于其侧链比mk-4长，在人体内存在的时间较长，在肝外组织的生物利用率也更高，半衰期和生物利用度均优于mk-4，临床用量较 mk-4降低了500倍，服用mk-7能增加循环血液中骨钙素(bgp)及基质gla蛋白(mgp)的γ-羧化水平。
4.随着对vk2的深入研究，流行病学研究表明vk2与多种老年疾病相关，其在预防骨质疏松、心血管疾病和阿尔兹海默症等疾病方面发挥重要作用。除此之外，vk2对肿瘤的治疗也有着显著的效果。有大量研究表明，vk2在多种肿瘤细胞系中具有抑制作用，包括肝癌、结肠癌、白血病、肺癌、胃癌、淋巴癌、鼻咽癌、前列腺癌、口腔表皮样癌和乳腺癌等；此外在诸多的体内动物实验中也表现出一定的抗肿瘤效应，且能与多种抗癌药物具有协同作用。其抗肿瘤机制大致包括：(1)vk2通过氧化还原循环所产生的的活性氧(ros)超过细胞的氧化能力，进而影响线粒体功能，使细胞色素c从线粒体释放到细胞质中形成凋亡小体，驱动caspase-8活化，最终导致caspase-3的激活和细胞凋亡发挥杀伤肿瘤细胞的作用；(2)vk2通过调控bcl-2 拮抗剂及下游转录因子信号的调节如nf-κb，fos/jun和其他转录因子介导肿瘤细胞凋亡；(3)vk2可调控细胞周期蛋白依赖性激酶(cdks)，进而诱导细胞周期停滞，此外还可激活p21基因(细胞周期调节蛋白，在g1-s转换的细胞周期进程中具有负面作用)，进而诱导g1期阻滞；(4)vk2通过抑制iκb激酶(ikk)/iκb/nf-κb 途径，进而介导细胞周期阻滞。
5.juanola等通过分析7216名患者的膳食，发现vk2的摄入可以降低患者心血管疾病及肿瘤的死亡率，而且nimptsch等通过对24340位35-64岁肿瘤患者进行超过10年的回访，
发现常吃奶酪摄入mk-4有助于降低肿瘤的发生率。这说明vk2在预防肿瘤的发生发展中起着一定的作用。肝癌是全球第三大致死性癌症，也是我国预后最差的肿瘤，患者5年存活率只有10％，即使在肝癌早期进行治疗，5年后 70％以上的患者会复发。小规模临床试验发现，vk2能降低女性病毒性肝硬化患者的肝癌发生率。其中mk-4能预防病毒性肝炎转变为肝癌，也可降低原发性肝癌的复发率，同时通过减缓肝癌经门静脉的转移对肝癌细胞的侵袭转移也有一定的抑制作用。vk2的抑癌潜力在43名肝硬化肝炎妇女的随机试验中被证实，其中治疗组接受大剂量的mk-4(45mg/天)2年。随访6年后，与对照组相比治疗组患者患肝癌的风险为0.20(95％ci：0.04,0.91)。一些引人注目的临床案例也支持vk2辅助预防肿瘤复发的作用。同样，一名66岁患有丙型肝炎病毒相关的肝硬化的日本女性，通过计算机断层扫描检测到肿瘤标记物甲胎蛋白(α-fetoprotein，afp)和凝集素反应性分界(afp-l3)的升高，在患者肝脏中发现有发育不良的结节，存在潜在的肝癌风险。口服mk-4(45mg/天)和ace-i(培哚普利；4mg/天)36～48个月后， afp和afp-l3的血清水平逐渐下降，血清转氨酶活性没有明显改变。治疗一年后，不仅血清afp和afp-l3水平恢复到正常范围，而且不典型增生的结节消失，且 mk-4和acei在广泛使用中都没有产生严重的副作用。而且，一名患有hcc破裂的65岁男性中，vk2和维生素e的联合治疗不仅抑制了原发性肿瘤的生长，并且还消除了其腹膜内的传播。有研究表明，vk2和磷脂酰胆碱联合使用可以更强的抑制肿瘤发生，用于预防hcc高风险患者的肝癌发生，特别是那些患有慢性肝炎的患者。此外，研究者给予87例肝癌患者vk2(mk-4；45mg/天)和/或acei(培哚普利，acei；4mg/天)36-48个月，结果表明联合使用vk2和acei可显著抑制肝癌累计复发，下调血清中血管内皮生长因子水平。众所周知，化学疗法不能长期预防癌症发生和复发，故而使用vk2进行化学预防和联合给药将成为未来化学预防和治疗肿瘤的新策略。
6.关于vk2依赖蛋白—“生长抑制特异性蛋白6(growth-arrest-specific gene-6protein， gas-6)”促进肿瘤生长的报道屡见不鲜。gas-6于1988年被鉴定，并于1993年在小鼠胚胎nih3 t3成纤维细胞中进一步鉴定。gas-6是由678个氨基酸组成的蛋白质，分子量为75kda。在其n末端含有gla的氨基酸结构域，当维生素k存在的时候，可将谷氨酸残基转化为γ-glu残基，使gas-6发挥生理作用。gas-6在心，肺，肠，肾，脑，脾，卵巢，睾丸，骨髓，血管平滑肌细胞和巨噬细胞中高表达；在肝脏中的表达水平比较低，gas-6可通过抑制内皮细胞和vsmcs的凋亡发挥抑制作用，从而预防血管狭窄，保护血管，抑制血管钙化。gas-6是tam受体家族主要配体， tam是i型跨膜受体酪氨酸激酶，由3个成员组成：tyro3，axl和me。axl对gas-6 的亲和力最高，其次是tyro3和mer成。tam受体在许多人类癌症中异位表达或过度表达，并参与肿瘤的发展。gas-6的shbg结构域通过与细胞表面表达的tam (tyro3，axl和me)的ig样结构域相结合，通过激活在细胞质内的受体末端的酪氨酸激酶并使其产生磷酸化，从而产生下游信号，如磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)，细胞外信号调节激酶(erk)和活化的b细胞的核因子kappa轻链增强子(nf-kb)通路，进而调节增殖，迁移，分化，粘附和凋亡。大量的研究表明上调gas-6/tam(即axl， tyro3和mer)可以促进一些癌症的发展。所以临床上，gas-6和tam受体的表达总是预示着不良的预后。
7.另一方面，toll样受体(toll-like receptor，tlrs)在前哨细胞中显着表达，例如树突状细胞和巨噬细胞，它们驱动先天免疫应答。tlr激活的炎症，通过i型干扰素(和其他细胞因子)以正前馈机制放大信号，最后以tam介导的负反馈机制抑制tlr信号传导。表达在
免疫细胞表面的tam可与gas-6结合进而激活stat1，诱导了socs1和socs3产生，从而产生抑制免疫响应的负反馈作用。此外，严重脓毒症患者的循环gas-6水平升高，机体呈现出免疫抑制的状态，表明过活跃的tam 信号在脓毒症恶化相关。故而gas-6可抑制机体的免疫响应的同时，还可与肿瘤细胞tam相互作用促进肿瘤的生长和转移。由于研究表明vk2的摄入可预防癌症的发生和复发，而vk2相关蛋白gas-6却与肿瘤的发生呈正相关，因此本发明将使用不同剂量vk2进行肿瘤的预防研究。
8.此外，维生素d3(vitamind3)作为天然脂溶性维生素，同样对多种肿瘤细胞系均具备一定的抗肿瘤作用。大量研究表明vd3及相关受体的表达与肿瘤预后呈正相关。其抗肿瘤机制大致包括：(1)下调细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶 (cyclin dependent kinase，cdk)的含量和/或上调不同的cdk抑制剂(例如p21 和p27)，导致cdk活性降低，发挥生长抑制作用；(2)可激活细胞内在凋亡途径，如抑制抗凋亡蛋白bcl2和bcl-xl以及激活凋亡蛋白bax，从而导致细胞色素c 从线粒体中释放出来，激活下游胱天蛋白酶(例如caspase 3和9)。此外，1,25(oh)2d3可能通过干扰其他信号通路(如肿瘤坏死因子tnf-α)来诱导细胞凋亡；(3)可抑制细胞骨架蛋白的表达，导致细胞运动性降低，从而产生抗迁移和抗侵袭的作用； (4)可导致环氧合酶2的减少和15-羟基前列腺素脱氢酶的增加，导致前列腺素合成减少，在炎症反应的产生中起关键作用；(5)用vd3处理可导致肿瘤细胞糖酵解减少，还可使线粒体代谢中间体发生氧化，不能再用于生物合成途径，限制了肿瘤细胞的营养供应和代谢。
9.vd3作为非化疗药物发挥抗肿瘤作用时需要大剂量使用，但是机体摄入过多 vd3后又会产生血钙升高的副作用，限制了其体内抗肿瘤研究。原因在于，吸收摄入的vd3在机体代谢成为1,25(oh)2d3后，1,25(oh)2d3可通过增加肠道顶膜钙通道 trpv6和钙结合蛋白calbindin-d9k的表达从而增强细胞旁和跨细胞途径的钙吸收，极大地促进了肠道钙的吸收，当饮食中钙的摄入量低时，该过程会特别增强。此外，在肾脏远端小管中的钙重吸收也同样受到1,25(oh)2d3调节
62.。所以摄入过多的vd3可通过增强肠道以及肾脏对钙的吸收，进而增加血清中钙的浓度，产生血钙生升高的现象。
10.骨钙素(osteocalcin；oc)又称“骨γ-羧化谷氨酸蛋白(bone gla protein， bgp)”，由成骨细胞、软骨细胞合成并分泌，是骨组织中的特异性非胶原蛋白，主要存在于细胞外的骨基质中，有一部分则会被释放到血液循环中。临床上以血清中oc含量作为骨形成的重要指标。oc可与骨基质中的i型胶原蛋白和其他非胶原蛋白结合形成网络支架，为钙盐沉积提供场所；oc与羟磷灰石钙盐有特殊亲和性，可促进钙盐的沉积。其中oc分子中存在3个γ-羧基谷氨酸残基，是与ca
2+
结合不可缺少的结构，具有吸附血液中ca
2+
的能力，能将血液中游离的ca
2+
定向转移到骨骼中用于骨骼矿化；若使γ-羧基谷氨酸残基还原为谷氨酸后，oc将失去与ca
2+
结合的能力。在oc形成过程中，由谷氨酸转变为γ-羧基谷氨酸残基时需要vk2作为辅酶才能完成。因此服用vk2后可增强oc的生理活性，降低血液中ca
2+
的浓度，缓解vd3带来的血清ca
2+
升高的现象。因此本发明尝试将vk2联合vd3使用，消除 vd3血钙升高的现象，同时进行联合抗肿瘤研究，考察是否具有协同作用。


技术实现要素：

11.为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种药物组合物，包含维生素
k2和维生素d3，在两者合适的比例条件下组合后，不仅能够消除vd3血钙升高现象，而且起到协同的抗肿瘤作用。
12.本发明通过如下方案实现的：
13.本发明提供维生素k2和维生素d3的组合物，包含维生素k2和维生素d3，其中，按质量比计，维生素d3：维生素k2＝1：90～1：270。
14.所述的vk2的结构如下，其中，n＝7(mk-7):
[0015][0016]
进一步地，所述的维生素k2和维生素d3的组合物可以与药学上可接受的载体或赋形剂制备成临床上可接受制剂，如纳米乳、脂质体等。
[0017]
进一步地，所述的纳米乳和脂质体可以根据本领域常规的方法制备。
[0018]
本发明的维生素k2和维生素d3的组合物或含有其组合物的制剂可以通过口服、注射的方式给药。
[0019]
本发明为vk2进行肿瘤预防的日常摄入剂量提供一个参考依据，并进行相关机制探讨。
[0020]
本发明所述的预防肿瘤日常摄入vk2剂量参考依据中，根据口服不同剂量vk2进行肿瘤预防药效学的考察，结果表明摄入低剂量的vk2具有较好的肿瘤预防效果，随着vk2摄入剂量的增加预防肿瘤效果越差。
[0021]
本发明所述的摄入高剂量vk2不利于肿瘤的预防的机制探讨中，通过口服不同剂量的vk2检测血清及肿瘤组织中的gas-6浓度，结果表明血清中gas-6浓度随着 vk2的摄入呈剂量依赖性的增长，而肿瘤组织中的gas-6浓度又与肿瘤体积呈正相关，因此口服高剂量vk2所产生的高血清浓度gas-6可促进肿瘤的发生发展，不利于肿瘤的预防。
[0022]
本发明所述的提供vk2联合vd3消除血钙升高现象的给药剂量最佳比例中，通过口服不同比例组合的vk2和vd3，对血清ca
2+
浓度进行检测。结果表明当高剂量 vd3联合vk2进行口服治疗后，vd3和vk2的给药剂量比例达到1:90时，vk2可消除vd3带来的血钙升高现象，当进一步提高vk2的给药浓度，血清ca
2+
浓度并不会进一步下降，因此当给药剂量vd3:vk2＝1:90时为最佳比例。
[0023]
本发明所述的提供一种能够协同抗肿瘤的组合物，即vk2联合vd3中，通过建立s180肉瘤模型，分别考察vk2、vd3单独给药以及二者联合给药(比例给药剂量为vd3:vk2＝1:90)的抗肿瘤效果。结果表明分别单独使用vd3和vk2进行抗肿瘤时，虽具有一定程度抗肿瘤效果，但效果并不理想；将二者联合后，抗肿瘤效果有所上升；当制剂修饰有唾液酸(sa)后，抑瘤效果进一步提高。
[0024]
综上述所，本发明为了将vk2预防和治疗肿瘤的作用发挥的更有价值，将vk2包载于纳米乳中进行口服，以s180肿瘤细胞为模型，通过长期口服不同剂量的vk2作为预防，考察vk2的摄入剂量是否与预防肿瘤效果呈正相关，并对相关结果进行机制探讨。着重选择vd3与
vk2联合抗肿瘤，借助vk2消除vd3大剂量使用所导致的血钙升高现象，提高vd3使用的安全治疗剂量，二者相互协同，共同发挥抗肿瘤作用。即本发明提供了口服vk2进行肿瘤预防的摄入剂量标准，并提供了vk2联合vd3消除血钙升高现象的给药剂量最佳比例，为二者联合抗体内肿瘤提供基础，并进行了联合抗肿瘤的考察，充分发挥了vk2预防和治疗肿瘤的价值。
[0025]
本发明的优点：
①
尽管大量文献报道长期摄入vk2与罹患癌症的风险呈反比，但我们意外的发现vk2的摄入并非越多越好，本发明为vk2预防肿瘤的日常摄入剂量提供一个参考依据，使vk2的使用规范化；
②
本发明通过将vk2联合vd3使用，消除了高剂量vd3带来的血钙升高的现象，扩大了vd3的安全使用范围，筛选出了 vk2联合vd3使用的比例(vd3:vk2＝1:90～1：270)；
③
本发明通过联合vk2和 vd3进行了相关抗肿瘤研究，表明二者联合具有一定协同作用，拓宽了肿瘤的治疗方式。
附图说明
[0026]
图1为实施例2中，透射电镜下，vk2纳米乳样品形态。
[0027]
图2为实施例3中各组小鼠口服高剂量vk2纳米乳的肿瘤生长曲线(n＝6)。
[0028]
图3为实施例3中各组小鼠口服高剂量vk2的抑瘤指数(n＝6)。
[0029]
图4为实施例3中各组小鼠口服高剂量vk2的小鼠体貌。
[0030]
图5为实施例3中各组小鼠口服高剂量vk2的体质量变化(n＝6)。
[0031]
图6为实施例3中各组小鼠口服高剂量vk2的脾指数和胸腺指数(n＝6)。
[0032]
图7为实施例4中各组小鼠口服中等剂量vk2的肿瘤生长曲线(n＝6)。
[0033]
图8为实施例4中各组小鼠口服中等剂量vk2的抑瘤指数(n＝6)。
[0034]
图9为实施例4中各组小鼠口服中等剂量vk2的小鼠体貌。
[0035]
图10为实施例4中各组小鼠口服中等剂量vk2的体质量变化(n＝6)。
[0036]
图11为实施例4中各组小鼠口服中等剂量vk2的脾指数和胸腺指数(n＝6)。
[0037]
图12为实施例5中各组小鼠口服低剂量vk2的肿瘤生长曲线(n＝6)。
[0038]
图13为实施例5中各组小鼠口服低剂量vk2的抑瘤指数(n＝6)。
[0039]
图14为实施例5中各组小鼠口服低剂量vk2的小鼠体貌。
[0040]
图15为实施例5中各组小鼠口服低剂量vk2的体质量变化(n＝6)。
[0041]
图16为实施例5中各组小鼠口服低剂量vk2的脾指数和胸腺指数(n＝6)。
[0042]
图17为实施例6中各组小鼠肿瘤的h&e病理切片(标尺：50μm)。
[0043]
图18为实施例7中正常小鼠口服不同剂量vk2(50、2、0.08mg
·
kg-1
)后，血清gas-6浓度；数据显示为平均值
±
sd(n＝5)；与空白组相比**p<0.01和*p <0.05。
[0044]
图19为实施例7中口服高剂量vk2(50mg
·
kg-1
)药效实验结束后，血清及肿瘤组织中的gas-6浓度；数据显示为平均值
±
sd(n＝5)；与对照组相比**p<0.01 和*p<0.05。
[0045]
图20为实施例7中口服中等剂量vk2(2mg
·
kg-1
)药效实验结束后，血清及肿瘤组织中的gas-6浓度；数据显示为平均值
±
sd(n＝5)；与对照组相比**p<0.01 和*p<0.05。
[0046]
图21为实施例7中口服低剂量vk2(0.08mg
·
kg-1
)药效实验结束后，血清及肿瘤组织中的gas-6浓度；数据显示为平均值
±
sd(n＝5)；与对照组相比**p<0.01 和*p<0.05。
[0047]
图22为实施例8中口服不同剂量vd3的血清ca
2+
浓度(n＝6)。
[0048]
图23为实施例8中联合口服不同比例vd3,vk2的血清ca
2+
浓度(n＝6)。
[0049]
图24为实施例9中不同给药组别的肿瘤生长曲线(n＝6)。
[0050]
图25为实施例9中不同给药组别的抑瘤指数(n＝6)。
[0051]
图26为实施例9中不同给药组别的体质量变化曲线(n＝6)。
[0052]
图27为不同给药组别的脾/胸腺指数(n＝6)。
[0053]
图28为gas-6和tam结构及两者结合示意图。
具体实施方式
[0054]
为了更清楚的理解本发明，以下结合发明人给出的依本发明的技术方案所完成的实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0055]
以下是本发明人给出的实施例，应当理解为，本发明并不局限于这些实施例，对于本发明所做的任何形式上的变通和/或改变，都将落入本发明的保护范围。
[0056]
实施例1维生素k2纳米乳的制备
[0057]
vk2纳米乳液是一种水包油纳米乳液。vk2纳米乳制备处方如表1所示，精密称取处方量的vk2、mct、spc、tpgs、ap组成油相，另称取处方量的na2s2o5、 cana2edta和gly加适量蒸馏水组成水相。油相在60℃水浴中搅拌溶解，水相在 65℃搅拌加热。待油相中物质完全溶解后，在磁力搅拌条件下，将水相缓慢加入到油相中，继续搅拌25min，制得初乳。使用高压均质机将初级乳液在800bar条件下均化四次。最后，将乳液装入小瓶中并冲入氮气，用铝盖密封，并在100℃下高压灭菌30分钟。
[0058]
表1.vk2纳米乳的制备处方
[0059][0060]
实施例2维生素k2纳米乳的表征
[0061]
(1)平均直径，多分散指数(pdi)
[0062]
取制备好的vk2纳米乳适量，样品适量，以灭菌注射用水进行稀释后，放入样品池内，采用基于nicomp-380激光粒度测定仪进行测定，结果见表2。
[0063]
表2.vk2纳米乳的粒径、pdi、(n＝3)
[0064][0065]
(2)透射电镜扫描下的形态学鉴定
[0066]
通过透射电子显微镜(tem，jm-1200ex，jeol ltd，japan)观察vk2纳米乳的形态。将纳米乳液用蒸馏水稀释，滴在覆盖碳膜的铜网(300目)上。在纳米乳剂粘附后，加入磷钨酸溶液(2％，w/v)进行染色2min。用滤纸吸走多余液体，将样品在室温下风干过夜，最后通过tem观察vk2纳米乳的形态并拍照，结果如图1所示。
[0067]
vk2纳米乳是粒度分布均匀的类球体，且粒径与nicomp-380粒径仪测定的数据基本吻合。
[0068]
实施例3口服高剂量维生素k2纳米乳预防及治疗肿瘤药效学试验
[0069]
通过s180肿瘤的异种移植小鼠模型进行口服高剂量vk2(50mg/kg)的肿瘤预防药效研究。将小鼠随机分为5组，每组6只，给药途径为口服灌胃：对照组(0.9％生理盐水，10ml
·
kg-1
)，a50(在荷瘤前口服vk2预防15天50mg
·
kg-1
)，b50 (在荷瘤前口服vk2预防15天，荷瘤后口服vk2治疗15天；50mg
·
kg-1
)，c50 (荷瘤前不预防，荷瘤后立即口服vk2治疗15天；50mg
·
kg-1
)，d50(荷瘤前不预防，荷瘤三天后口服vk2治疗15天；50mg
·
kg-1
)。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、瘤体质量，并对天数作图；为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算“抑瘤指数 (tumor-inhibition index,tiindex)”，即体重/瘤重，并对天数作图；在给药结束后剥离脾，胸腺，进行免疫学损伤评价。
[0070]
表3.口服高剂量vk2预防s180肿瘤的抑瘤指数和抑瘤指数(n＝6)
[0071][0072][0073]
口服高剂量vk2的药效实验结果显示，抑瘤率依次为：d50>a50≈c50>b50。说明长期口服高剂量vk2预防肿瘤(a50)组的效果相对较低，抑瘤效果为33.4％；而长期口服高剂量vk2预防合并治疗肿瘤(b50)组的效果最差，抑瘤率仅为13.6％；荷瘤后立即口服高剂量vk2进行抗肿瘤(c50)的效果相对较差，抑瘤率仅为33.4％；而口服高剂量vk2进行肿瘤成型后的抗肿瘤(d50)效果最好，抑瘤率高达61.8％；。由于肿瘤的减小并不能客观代表小鼠的健康状况，治疗的目的应不仅仅在于缩小肿瘤体积，还应保证机体其它功能的正常，因此，有必要从抑瘤指数上看各组的效果。从可以体现出小鼠生存状态的抑瘤指数(体重/瘤重)
上看：d50>a50>c50>b50> control，可见长期口服高剂量的vk2不仅具有一定程度的抗肿瘤效果，而其对机体无显著性的非特异性损伤，相反会极显著的提高小鼠的生存质量(p<0.01)。与此同时，所有组别小鼠的体质量均呈上升趋势，各组小鼠体质量与对照组相比无显著差异，表明小鼠生存状态良好，说明长期口服高剂量的vk2对小鼠产生的毒性作用均较小。此外，从各组小鼠的免疫学损伤评价结果中得出，各组小鼠的脾指数和胸腺指数与对照组相比，虽然存在一定的差异(与肿瘤生长状态相关)，但并无显著性(p>0.05)。
[0074]
实施例4口服中等剂量维生素k2纳米乳预防及治疗肿瘤药效学试验
[0075]
通过s180肿瘤的异种移植小鼠模型进行口服中等剂量vk2(2mg
·
kg-1
)的肿瘤预防药效研究。将小鼠随机分为5组，每组6只，给药途径为口服灌胃：对照组 (0.9％生理盐水，10ml
·
kg-1
)，a2(在荷瘤前口服vk2预防15天；2mg
·
kg-1
)， b2(在荷瘤前口服vk2预防15天，荷瘤后口服vk2治疗15天；2mg
·
kg-1
)，c2 (荷瘤前不预防，荷瘤后立即口服vk2治疗15天；2mg
·
kg-1
)，d2(荷瘤前不预防，荷瘤三天后口服vk2治疗15天；2mg
·
kg-1
)。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量，并对天数作图；为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算抑瘤指数(体重/瘤重)，并对天数作图；在给药结束后剥离脾，胸腺，进行免疫学损伤评价。
[0076]
表4.口服中等剂量vk2预防s180肿瘤的抑瘤指数和抑瘤指数(n＝6)
[0077][0078]
口服中等剂量vk2的药效实验结果显示，抑瘤率依次为：a2>c2>d2>b2。说明口服中等剂量vk2预防肿瘤(a2)组的效果较好，抑瘤率高达56.4％；长期口服中等剂量vk2预防合并治疗肿瘤(b2)组的效果最差，抑瘤率仅为18.3％；荷瘤后立即口服中等剂量vk2进行抗肿瘤(c2)的效果相对较好，抑瘤率为49.0％；而长期口服高剂量vk2进行肿瘤成型后的抗肿瘤(d2)效果相对较低，抑瘤效果为 26.8％。体现出小鼠生存状态的抑瘤指数(体重/瘤重)结果表明：a2>c2>d2>b2> control，可见长期口服中等剂量的vk2具有一定程度的抗肿瘤效果之外，对机体并无显著性的非特异性损伤，相反会随着肿瘤生长的抑制，显著提高了小鼠的生存质量(p<0.05)。与此同时，所有组别小鼠的体质量均呈上升趋势，各组小鼠体质量与对照组相比无显著差异，表明小鼠生存状态良好，说明长期口服中等剂量的vk2对小鼠产生的毒性作用均较小。此外，从各组小鼠的免疫学损伤评价结果中得出，各组小鼠的脾指数和胸腺指数与对照组相比，虽然存在一定的差异(与肿瘤生长状态相关)，但并无显著性(p>0.05)。
[0079]
实施例5口服低剂量维生素k2纳米乳预防及治疗肿瘤药效学试验
[0080]
通过s180肿瘤的异种移植小鼠模型进行口服低剂量vk2(0.08mg
·
kg-1
)的肿瘤预防药效研究。将小鼠随机分为5组，每组6只，给药途径为口服灌胃：对照组 (0.9％生理盐
水，10ml
·
kg-1
)，a0.08(在荷瘤前口服vk2预防15天；0.08mg
·
kg-1
)， b0.08(在荷瘤前口服vk2预防15天，荷瘤后口服vk2治疗15天；0.08mg
·
kg-1
)， c0.08(荷瘤前不预防，荷瘤后立即口服vk2治疗15天；0.08mg
·
kg-1
)，d0.08(荷瘤前不预防，荷瘤三天后口服vk2治疗15天；0.08mg
·
kg-1
)。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量，并对天数作图；为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，计算抑瘤指数(体重/ 瘤重)，并对天数作图；在给药结束后剥离脾，胸腺，进行免疫学损伤评价。
[0081]
表5.口服低剂量vk2预防s180肿瘤的抑瘤指数和抑瘤指数(n＝6)
[0082][0083]
口服低剂量vk2的药效实验结果显示，抑瘤率依次为：b0.08>a0.08>c0.08> d0.08。说明口服低剂量vk2预防肿瘤(a0.08)组的效果较好，抑瘤率为52.1％；长期口服低剂量vk2预防合并治疗肿瘤(b0.08)组的效果最好，抑瘤率为55.4％；两组效果接近。荷瘤后立即口服中等剂量vk2进行抗肿瘤(c0.08)的效果相对较差，抑瘤率为23.9％；而长期口服高剂量vk2进行肿瘤成型后的抗肿瘤(d0.08)的效果最差，抑瘤效果仅为10.7％。体现出小鼠生存状态的抑瘤指数(体重/瘤重)结果表明：b0.08>a0.08>c0.08>d0.08>control，可见长期口服低剂量的vk2具有一定程度的抗肿瘤效果之外，对机体并无显著性的非特异性损伤，相反会随着肿瘤生长的抑制，同样会显著提高小鼠的生存质量(p<0.05)。与此同时，所有组别小鼠的体质量均呈上升趋势，各组小鼠体质量与对照组相比无显著差异，表明小鼠生存状态良好，说明长期口服低剂量的vk2对小鼠产生的毒性作用均较小。此外，从各组小鼠的免疫学损伤评价结果中得出，各组小鼠的脾指数和胸腺指数与对照组相比，虽然存在一定的差异(与肿瘤生长状态相关)，但并无显著性(p>0.05)。
[0084]
实施例6 s180荷瘤昆明小鼠肿瘤的he染色病理学组织切片
[0085]
上述抗肿瘤的实验研究主要以瘤体积、抑瘤率、瘤体质量及抑瘤指数这四个宏观的指标来评价抗肿瘤疗效。因此考虑用病理学上的微观改变作为评价指标，寻找各组抗肿瘤效果之间的差别。取出各组高、中、低剂量的vk2药效研究结束后的小鼠的肿瘤用于he病理切片制作：
[0086]
1组织固定：
[0087]
将新鲜剥离的心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织用pbs(ph 7.4)洗净后用4％多聚甲醛固定24h以上，固定结束后将组织从固定液取出，在通风橱内用手术刀将组织修平整。
[0088]
2冲洗：
[0089]
将修整好的组织块放入包埋盒，将包埋盒置于蒸馏水下，用较低的流水速度冲洗组织，冲洗12～24h。
[0090]
3脱水：
[0091]
将包埋盒放进吊篮里，置于脱水机内，用不同梯度的乙醇进行脱水，依次用75％乙醇作用4h，85％乙醇、90％乙醇各作用2h，95％乙醇作用1h，再用无水乙醇作用2次进行脱水。
[0092]
4透明与浸蜡：
[0093]
将各组织转移至密闭容器内，二甲苯:乙醇(1:1，v/v)作用5～10min，二甲苯 i作用5～10min，二甲苯ii作用5～10min。透明结束后将各组织块浸没在完全融化的石蜡中(60℃恒温箱)1h，再将组织块转移到新的石蜡液中进行二次浸蜡1 h。
[0094]
5包埋：
[0095]
将浸好蜡的组织置于包埋机中进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，在蜡凝固之前，将组织从脱水盒内取出，按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。在-20℃冻台冷却，待蜡凝固后，将蜡块从包埋框中取出并对蜡块进行修整。
[0096]
6切片：
[0097]
将蜡块置于石蜡切片机上连续切片，片厚5μm，将切片漂浮于摊片机上，40℃温水将组织展平，用防脱载玻片将组织捞起，并于60℃烘箱内烤片。待水烤干、蜡烤化后，将载玻片取出，常温保存备用。
[0098]
7 he染色。
[0099]
8石蜡切片脱蜡至水：
[0100]
将组织切片放入二甲苯i、二甲苯ii溶液中各浸泡20min，100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各浸泡5min，最后用蒸馏水冲洗10min。
[0101]
9染核：
[0102]
切片入苏木素染液染8min，用蒸馏水冲洗去浮色，再用1％的盐酸酒精分化数 20s，最后用蒸馏水冲洗返蓝。
[0103]
10染质：
[0104]
切片入伊红染液中染色3min，再用蒸馏水冲洗20s。
[0105]
11脱水封片：
[0106]
将切片依次用95％酒精i、95％酒精ii各浸泡5min，再用无水乙醇ⅰ、无水乙醇ⅱ各浸泡5min，然后在二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ中各浸泡5min脱水透明，最后将切片从二甲苯中拿出晾干，用中性树胶封片。
[0107]
12镜检拍照：
[0108]
待封片干燥完毕后，将载玻片置于倒置显微镜下观察。结果如图17所示。
[0109]
肿瘤的h&e染色病理组织切片结果显示，对照组小鼠的肿瘤内发现众多核大深染的肿瘤细胞，肿瘤细胞生长比较旺盛；在高剂量组中，a50，b50，c50组存在部分的肿瘤坏死区，而d50存在的粉染较多，肿瘤细胞死亡面积较大；在中等剂量组中，a2、c2中粉染较多肿瘤细胞死亡面积大，b2、d2虽有肿瘤细胞的凋亡，但相对a2、c2而言肿瘤细胞生长相对比较旺盛；在低剂量组中，a0.08、b0.08图中粉染较多，肿瘤细胞死亡面积大，c0.08、d0.08组的粉染较少，肿瘤细胞生长相对比较旺盛。说明肿瘤细胞的生长状态与药效结果一致，高剂量vk2的抗肿瘤效果较好，低剂量vk2的预防肿瘤效果较好。
[0110]
实施例7血清及肿瘤部位gas-6浓度检测
[0111]
将85只昆明小鼠随机分为17组，每组5只，分别给药：空白健康组(blank)、荷瘤对
照组(control)、a50(在荷瘤前口服vk2预防15天；50mg
·
kg-1
)、b50(在荷瘤前口服vk2预防15天，荷瘤后口服vk2治疗15天；50mg
·
kg-1
)、c50(荷瘤前不预防，荷瘤后立即口服vk2治疗15天；50mg
·
kg-1
)、d50(荷瘤前不预防，荷瘤三天后口服vk2治疗15天；50mg
·
kg-1
)、e50(正常小鼠口服15d；50mg
·
kg-1
)； a2(在荷瘤前口服vk2预防15天；2mg
·
kg-1
)、b2(在荷瘤前口服vk2预防15天，荷瘤后口服vk2治疗15天；2mg
·
kg-1
)、c2(荷瘤前不预防，荷瘤后立即口服vk2治疗15天；2mg
·
kg-1
)、d2(荷瘤前不预防，荷瘤三天后口服vk2治疗15天；2mg
·
kg-1
)、 e2(正常小鼠口服15d；2mg
·
kg-1
)；a0.08(在荷瘤前口服vk2预防15天；0.08 mg
·
kg-1
)、b0.08(在荷瘤前口服vk2预防15天，荷瘤后口服vk2治疗15天；0.08 mg
·
kg-1
)、c0.08(荷瘤前不预防，荷瘤后立即口服vk2治疗15天；0.08mg
·
kg-1
)、d0.08(荷瘤前不预防，荷瘤三天后口服vk2治疗15天；0.08mg
·
kg-1
)、e0.08(正常小鼠口服vk
2 15d；0.08mg
·
kg-1
)。
[0112]
当给药结束后，通过小鼠眼静脉丛取血，获得血液样品，将血液静止2h后，在2000
×
g的离心条件下，高速离心20min，吸取上清液获得血清样品。将解剖分离的肿瘤组织按照肿瘤质量：生理盐水体积(1:1)的比例进行组织匀浆，待研磨均匀后，在12000rpm的离心条件下离心10min获取匀浆上清液样品。将样品按照 gas-6试剂盒说明进行浓度检测，结果见图18、19、20、21：
[0113]
图18结果显示，相比于未口服vk2的空白组(blank)，正常小鼠长期口服高剂量(e50)的vk2会使血清中的gas-6水平显著上升(p<0.05)。长期口服中等剂量(e2)和低剂量(e0.08)的vk2虽然会增加血清gas-6的浓度，但无显著性差异(p>0.05)。
[0114]
图19表明，当小鼠患有肿瘤时，对照组(control)血清中的gas-6浓度相对于正常组(blank)会有所降低，但是并无显著性差异(p>0.05)。当使用高剂量的vk2进行预防及治疗后会发现，a50、b50血清中的gas-6含量极显著的高于对照组(p<0.01)，c50、d50组血清中的gas-6含量显著的高于对照组(p<0.05)，说明长期口服大剂量的vk2同样会使荷瘤小鼠血清gas-6浓度增高。而a50、b50 和c50组肿瘤部位的gas-6浓度显著高于对照组(p<0.05)，而d50组与对照组无显著性差异，说明肿瘤组织gas-6浓度与肿瘤生长相关，当肿瘤体积过大时会增加肿瘤部位gas-6的浓度。
[0115]
由图20可知，荷瘤小鼠口服中等剂量的vk2后，由于b2组小鼠口服vk2长达30天，是其余组口服时间的一倍，故而血清中的gas-6浓度相比于对照组显著升高(p<0.05)。而其余组血清gas-6浓度相比于对照组虽有一定程度的增加，但无显著性差异(p>0.05)。此外；从肿瘤组织分布中发现，a2、c2和d2组肿瘤部位的gas-6浓度与对照组无显著性差异(p>0.05)，而b2组的肿瘤体积最大，其肿瘤部位gas-6浓度极显著高于对照组(p<0.01)，进一步说明肿瘤组织gas-6浓度与肿瘤生长相关。
[0116]
由图21可知，荷瘤小鼠长期口服低剂量vk2后，各组小鼠血清gas-6浓度相比于对照组没有显著性上升(p>0.05)。由于a0.08、b0.08组具有较高的肿瘤预防作用，抑瘤效果较好，故而其肿瘤组织中gas-6浓度显著低于对照组(p<0.05)。由于vk2的摄入剂量较小，故而其肿瘤治疗效果较差，导致c0.08、d0.08组的肿瘤体积较大，肿瘤中gas-6浓度与对照组不显著性差异(p>0.05)。
[0117]
实施例8 vk2联合vd3血钙浓度考察
[0118]
将66只健康昆明小鼠随机分为11组，每组6只，即口服生理盐水对照组 (control)、vd3(1μg
·
kg-1
)、vd3(10μg
·
kg-1
)、vd3(100μg
·
kg-1
)、vd3(500μg
·
kg-1
)、 vd3+
vk2(500μg
·
kg-1
、500μg
·
kg-1
；1:1)、vd3+vk2(500μg
·
kg-1
、5000μg
·
kg-1
； 1:10)、vd3+vk2(500μg
·
kg-1
、15mg
·
kg-1
；1:30)、vd3+vk2(500μg
·
kg-1
、45mg
·
kg-1
； 1:90)、vd3+vk2(500μg
·
kg-1
、90mg
·
kg-1
；1:180)、vd3+vk2(500μg
·
kg-1
、135 mg
·
kg-1
；1:270)，分别口服灌胃7d。第8d立即通过小鼠眼静脉丛取血，获得血液样品，将血液静止2h后，在2000
×
g的离心条件下，高速离心20min，吸取上清液获得血清样品，进行血清ca
2+
浓度检测，结果如图22，23。,
[0119]
由上图可知，与对照组相比，单独口服500μg
·
kg-1的vd3时会引起小鼠ca
2+
浓度极显著增加(p<0.01)，在此剂量下联合不同剂量的vk2后，血钙浓度会呈剂量依赖性的降低。当vk2的给药剂量在vd3给药剂量的30倍以内时，虽然会使ca
2+
浓度在一定程度上降低，但其浓度仍极显著高于对照组(p<0.01)；值得注意的是，当vk2的使用剂量增加到vd3使用剂量的90倍时，可极大地降低由vd3引起的血清高ca
2+
浓度现象，且ca
2+
浓度与对照组相比无显著性差异(p>0.05)；随后继续增大vk2的给药浓度至vd3使用剂量的180、270倍时，ca
2+
浓度并未发生显著波动，与90倍时相当，达到平台期。综上所述，当vk2使用剂量为vd3的使用剂量 90倍时，可显著抑制vd3引起的ca
2+
浓度升高现象，在此基础上继续增大vk2的使用剂量，ca
2+
浓度并不会呈剂量依赖性的降低。因此，维生素d3与维生素k2联合剂量比大于等于1：90，首选维生素d3：维生素k2＝1：90～1：270。
[0120]
实施例9 vk2联合vd3抗肿瘤研究
[0121]
以s180肿瘤的异种移植小鼠为模型，考察二者以1:90(vd3:vk2)比例联合后的抗肿瘤效果。将54只接种s180瘤株的小鼠随机分为9组，每组6只，即生理盐水对照组(control)、口服vd3(vdi.g.；555μg
·
kg-1
)、口服vk2(vk i.g.；50mg
·
kg-1
)、口服dk(dk i.g.；555μg
·
kg-1
；50mg
·
kg-1
)、口服sa-dk(sa-dk i.g.；555μg
·
kg-1
； 50mg
·
kg-1
)、注射vd3(vdi.v.；555μg
·
kg-1
)、注射vk2(vk i.v.；50mg
·
kg-1
)、注射dk(dk i.v.；555μg
·
kg-1
；50mg
·
kg-1
)、注射sa-dk(sa-dk i.v.；555μg
·
kg-1
；50mg
·
kg-1
)。接种后分别于第3、5、7、9、11d给药，共给药5次，第13d处死动物。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量、死亡事件等数据。
[0122]
实验结果显示，单独口服或注射vd3和vk2均具有一定的抑瘤效果，但抑瘤效果较低；当联合二者进行口服或注射治疗时，抑瘤效果有所上升。由于注射的生物利用度高于口服，当二者联合注射进行抗肿瘤治疗时，抑瘤率提高至43％，当修饰有sa(唾液酸)时，抑瘤率高达53％，与单独给药组产生显著性差异(p<0.05)。并且各组抑瘤指数结果与抑瘤率结果相对应，抑瘤率越高抑瘤指数越大。有sa修饰的联合注射组的抑瘤指数最高，说明整体治疗效果最好；其余组的抑瘤指数均高于对照组，说明对机体没有显著的损害。
[0123]
从体质量变化曲线来看，生理盐水对照组增长最快，各组小鼠体质量增长趋势一致。各给药组小鼠体质量与对照组相比无显著差异(p>0.05)，所有组别的小鼠体质量都呈上升趋势，表明小鼠生存状态良好，口服vd3和vk2对小鼠产生的毒性作用均较小，在整个给药期间内，相比于对照组的体质量没有出现较大的波动或非常明显的下降的趋势。以脾指数和胸腺指数作为评价指标评价时，各治疗组与对照组之间均无显著性差异(p>0.05)，说明vd3和vk2对荷瘤小鼠的免疫系统均无显著性损伤。