化学遗传学药物组合物在制备防治丙泊酚成瘾药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，涉及化学遗传学药物组合物在丙泊酚成瘾行为中的应用，特别涉及化学遗传学药物组合物在制备预防和治疗丙泊酚成瘾药物中的应用。

背景技术：

丙泊酚(propofol)是以其起效快、消除快、无蓄积等优点广泛应用于临床麻醉、无痛门诊、icu患者镇静等。随着丙泊酚的广泛使用，其潜在的一些问题也逐渐被重视：部分患者使用后出现愉悦，兴奋性和欣快感，具有潜在的精神依赖性。临床调查发现丙泊酚具有精神依赖性，并存在一定的滥用现象，主要适合其管理不当有关。因此，近几年美国禁毒署将丙泊酚列入管制药品目录，但是在我国丙泊酚的管理尚未受到重视，《麻醉药品品种目录2013版》、《精神药品品种目录2013版》尚未将丙泊酚纳入其中。这种管制不完善，为丙泊酚的滥用提供了可能。在动物实验中，丙泊酚被证实能诱导多种成瘾行为模型，比如自身给药模型(self-administration，sa)、条件性位置偏爱模型(conditionedplacepreference，cpp)、复吸模型，说明丙泊酚具有一定的精神依赖性。

化学遗传学技术(chemogenetic)是将已知的生物大分子(如多种代谢酶、核酸杂交体、激酶和g蛋白偶联受体等)进行改造后与未知的小分子化合物相互作用的过程。该技术的应用可人为地调控某种特定细胞内神经元和非神经元信号的转换，从而操纵动物的行为，具有可控和可逆性，被广泛运用于成瘾、疼痛等多种脑疾病的研究。

目前，尽管对丙泊酚的成瘾行为有所研究，但是其内在的机制及治疗方法还未深入探究。因此本专利探索丙泊酚成瘾机制，并提出利用化学遗传学技术改造的化学遗传学药物组合物用于治疗丙泊酚成瘾行为的设想，研发一种安全高效的抑制皮层神经元兴奋性的药物组合物具有广阔的市场价值和应用前景。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，提供一种化学遗传学药物组合物在制备防治丙泊酚成瘾药物中的应用。所述的化学遗传学药物组合物包括携带化学遗传基因的腺相关病毒和激活化学遗传基因的药物叠氮平-n-氧化物溶液(cno)，可用于抑制由丙泊酚成瘾所引起的内侧前额叶皮层(mpfc区)神经元高兴奋的状态。其中化学遗传学药物组合物在大鼠模型中，腺相关病毒最适量为0.3ul/侧，cno为0.1ug/侧。丙泊酚成瘾主要涉及行为敏化和自身给药两种经典的成瘾行为，也即所述的丙泊酚成瘾可用行为敏化模型和自身给药模型两种经典的成瘾模型来建立。所述的药物组合物必须同时存在方可发挥其防治作用。

本发明经过深入研究，发现：通过两种经典的成瘾行为学(自身给药模型和行为敏化模型)充分证明了在长期使用丙泊酚后会产生成瘾行为，也即丙泊酚具有一定的成瘾性。同时对成瘾和正常大鼠皮层mpfc区进行电生理检测，首次发现丙泊酚成瘾行为的产生和皮层mpfc区神经元兴奋性增高有关；利用化学遗传学药物组合物抑制mpfc区神经元兴奋性后，大鼠丙泊酚行为敏化和自身给药行为均可受到抑制。因此认为mpfc区细胞兴奋性变化调节丙泊酚的成瘾行为，而本发明中所提及的化学遗传学药物组合物可调节mpfc区细胞兴奋性。本申请所使用的携带化学遗传基因的腺相关病毒安全性高、免疫原性低，mpfc区定位微量注射后对其自发活动等无改变；同时使用的cno剂量及浓度不影响大鼠的自发活动。

本发明是通过如下技术方案来实现：通过脑立体定位注射仪在大鼠mpfc区微量注射药物组合物中的腺相关病毒，表达3周后应用丙泊酚行为敏化和自身给药训练制备大鼠丙泊酚成瘾模型，模型制备成功后大鼠脑内给予cno来配伍腺相关病毒，监测相应的行为学变化和化学遗传学药物组合物对丙泊酚成瘾防治作用的相关药理学研究。

本发明的有益技术效果：抑制性的化学遗传学药物组合物具有显著的抗丙泊酚成瘾的作用，其机理主要与抑制皮层mpfc区神经元兴奋性有关；该药物组合物及其应用安全稳定，对神经元无毒性，表达高效、效果显著，可用于防治丙泊酚成瘾，具有巨大的应用前景。

附图说明

图1为化学遗传学药物组合物的位置及功能验证，其中a是化学遗传学药物组合物注射位置代表图，b是膜片钳下功能验证代表图，c是功能验证结果统计图。

图2为验证化学遗传学药物组合物在丙泊酚行为敏化模型中的作用，其中a是行为敏化训练中两组大鼠运动距离比较结果图，b和c分别是行为敏化训练后两组大鼠mpfc区细胞兴奋性比较结果代表图和结果统计图，d是注射化学遗传学药物组合物后各组大鼠运动距离结果统计图。

图3为验证化学遗传学药物组合物在自身给药行为中的作用，其中a和b分别是自身给药训练中两组大鼠有效鼻触次数和泵注次数的结果图，c和d分别是自身给药训练后两组大鼠皮层mpfc区细胞兴奋性比较结果代表图和结果统计图，e和f分别是注射化学遗传学药物组合物后各组大鼠有效鼻触次数和泵注次数结果统计图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但是本发明不仅限于实施例中。

为检测丙泊酚成瘾行为，我们建立自身给药模型和行为敏化模型。在自身给药模型中，我们通过有效鼻触次数及泵注次数进行比较；在行为敏化模型中，我们检测其单位时间内的运动距离。

为检测化学遗传学药物组合物注射入大鼠脑内的功能及位置，我们通过膜片钳技术检测其功能；同时通过荧光显微镜观察其注射及转染的位置。

实施例1:构建并验证化学遗传学药物组合物

本发明提及的化学遗传学药物组合物由携带化学遗传基因的腺相关病毒和激活化学遗传基因的药物cno组成，具体制备及验证操作如下：

(1)构建病毒：将化学遗传基因、绿色荧光基因和神经细胞特异性启动子构建在paav病毒上，得到paav-hsyn-hm4di-gfp。

(2)转染病毒并验证其位置：利用脑立体定位仪将步骤(1)所得的腺相关病毒注射至sd大鼠mpfc区，病毒注射最适量为0.3ul每侧mpfc区。腺相关病毒注射后会感染注射部位的相关脑区神经元。感染最适时间为3-4周，4周后进行验证并标记胞体位置。验证位置的方法为通过将sd大鼠脑制成厚度为300um的包含mpfc区的脑片，在荧光显微镜下观察脑片，若转染成功则会表达绿色荧光，如图1a所示。

(3)验证化学遗传学药物组合物的功能：在荧光显微镜下选取表达绿色荧光的细胞，并利用全细胞膜片钳技术将细胞钳制在电流钳下给予电流刺激观察并记录其动作电位发放的情况。随后灌流系统给予激活化学遗传学基因的药物cno，观察并记录细胞动作电位发放情况的变化。该病毒携带抑制性化学遗传基团，在cno的作用下会使感染病毒的皮层神经元动作电位发放减少。如图1b和c所示，表明该化学遗传学药物组合物功能正常，能有效抑制皮层神经元的兴奋性。其中灌流中使用的cno浓度为10um。

实施例2:化学遗传学药物组合物在丙泊酚行为敏化模型中的作用

本发明首先检测了长期反复注射丙泊酚能诱导敏化行为的形成，主要由于皮层mpfc区神经元兴奋性增高有关。选取17只7-8周龄健康的雄性sd大鼠，分为丙泊酚组与生理盐水对照组两组，分别给予腹腔连续7天丙泊酚注射或生理盐水注射。于最后一天注射丙泊酚或生理盐水后，将其置于旷场装置中通过检测其单位时间内运动距离即自发活动度来观察其敏化行为。检测完毕后，异氟烷麻醉并用冰水混合状态的nmdg液体进行灌注取脑，在震荡切片机中将鼠脑切成厚度为300um的冠状切片，收集含有mpfc区的脑片于34℃的恒温水浴锅中进行复温孵育，孵育60分钟后将其移至记录槽内检测其动作电位发放情况来比较两组大鼠神经元的兴奋性，全程持续通含95％氧气和5％二氧化碳的混合气，保证细胞活性。

其次，本发明发现利用化学遗传学药物组合物可抑制丙泊酚敏化行为的形成。取28只7-8周龄健康的雄性sd大鼠，脑内mpfc区定位注射含化学遗传学基因的腺相关病毒，将大鼠随机分成4组：腹腔注射生理盐水+脑内注射cno组(saline+cno组，n＝5)、腹腔注射生理盐水+脑内注射vehicle对照组(saline+vehicle组，n＝5)、腹腔注射丙泊酚+脑内注射cno组(propofol+cno组，n＝9)和腹腔注射丙泊酚+脑内注射vehicle组(propofol+vehicle组，n＝9)。根据分组要求对大鼠腹腔注射丙泊酚或生理盐水、脑内给予cno或溶剂对照vehicle后，通过检测自发活动度来观察化学遗传学药物组合物对丙泊酚敏化行为的作用。其中含化学遗传学基因的腺相关病毒注射量为0.3ul每侧mpfc区。cno的注射量为0.3ul每侧mpfc区，包含0.1ug的cno。

结果见图2，结果显示：丙泊酚能显著增加大鼠运动距离也即其能成功建立行为敏化模型，且与皮层mpfc区神经元兴奋性增高有关；利用化学遗传学药物组合物选择性抑制mpfc区神经元兴奋后，其敏化行为能被抑制。

实施例3:化学遗传学药物组合物在丙泊酚自身给药行为中的作用

本发明首先检测了长期反复注射丙泊酚能成功建立丙泊酚自身给药行为，主要与皮层mpfc区神经元兴奋性增高有关。选取16只7-8周龄健康的雄性sd大鼠，分为丙泊酚组与生理盐水对照组两组，对其进行颈外静脉置管操作，恢复一周后进行为期14天的静脉内自身给药训练。训练过程中，计算机自动记录大鼠有效鼻触及泵注次数，以此来观察其自身给药训练情况。训练完毕后，异氟烷麻醉并用冰水混合状态的nmdg液体进行灌注取脑，在震荡切片机中将鼠脑切成厚度为300um的冠状切片，收集含有mpfc区的脑片于34℃的恒温水浴锅中进行复温孵育，孵育60分钟后将其移至记录槽内检测其动作电位发放情况来比较两组大鼠神经元的兴奋性，全程持续通含95％氧气和5％二氧化碳的混合气，保证细胞活性。

其次，本发明发现利用化学遗传学药物组合物可抑制丙泊酚自身给药行为。取26只7-8周龄健康的雄性sd大鼠，脑内mpfc区定位注射含化学遗传学基因的腺相关病毒(hm4di-gfp病毒)或只含荧光基团无化学遗传学基团的对照病毒(gfp病毒)，将大鼠随机分成4组：(1)hm4di+vehicle组：mpfc区注射hm4di-gfp病毒，训练前30min给药管内注射vehicle；(2)hm4di+cno组：mpfc区注射hm4di-gfp病毒，训练前30min给药管内注射cno；(3)gfp+vehicle组：mpfc区注射对照病毒，训练前30min给药管内注射vehicle；(4)gfp+cno组：mpfc区注射对照病毒，训练前30min给药管内注射cno。根据分组要求对大鼠处理后，通过检测其有效鼻触和泵注次数变化来观察化学遗传学药物组合物对丙泊酚自身给药行为的作用。其中含化学遗传学基因的腺相关病毒注射量为0.3ul每侧mpfc区。cno的注射量为0.3ul每侧mpfc区，包含0.1ug的cno。

结果见图3，结果显示丙泊酚能成功建立自身给药模型，且与皮层mpfc区神经元兴奋性增高有关；利用化学遗传学药物组合物选择性抑制mpfc区神经元兴奋后，其自身给药行为能被抑制。

以上结果均表明化学遗传学药物组合物能有效抑制丙泊酚成瘾行为。以上实施方案用来解释本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。