本发明属于生物医药技术领域，涉及预防病毒性传染病的活疫苗研制、生产和应用，能够用于流感等多种病毒引起的病毒性传染病的预防。
背景技术：
流感病毒、呼吸道合胞病毒、新城疫病毒、冠状病毒等多种病毒能够引起人与动物发生病毒性传染病。病毒性传染病严重危害人和多种动物的健康与生命安全。疫苗是预防病毒性传染病重要物质。现今已经批准使用或正在研究的预防病毒性传染病的疫苗有多种类别，包括全病毒灭活疫苗、全病毒活疫苗、基因工程制备的病毒蛋白质疫苗、编码病毒蛋白质的dna疫苗、编码病毒蛋白质的rna疫苗等。由于全病毒活疫苗的预防效果更好，生产成本更低，在现在使用疫苗预防的人类病毒性传染病中，全病毒活疫苗预防的病毒性传染病远远超过其他疫苗预防的病毒性传染病。
全病毒活疫苗存在安全风险。为了控制这种风险，通常采取以下三种策略之一。
第一，用致病能力下降的病毒(通常称之为“弱毒”)来制备全病毒活疫苗，这类疫苗称为“弱毒活疫苗”。目前已经应用和正在研发的预防流感病毒引起人的病毒性传染病的活疫苗，是弱毒活疫苗，并且它有两种致弱方法：一种是改变病毒的基因组，使其在人体正常温度下难以增殖而降低其致病作用；另一种是改变病毒的基因组，用稀有密码子替换基因组编码相同氨基酸的密码子，这样携带较多稀有密码子的流感病毒在人体内难以增殖而降低其致病作用。弱毒活疫苗具有疫苗种毒制备困难、疫苗中的活病毒存在致病能力返强的风险、不适合于接种免疫缺陷的人等缺点。另外，这种活疫苗接种儿童或幼畜时，可能会遭到母源抗体的干扰。
第二，用致病能力较强的活病毒制备全病毒活疫苗，这类疫苗中的活病毒进入宿主体内的途径或部位，与自然感染时病毒进入宿主体内的途径或部位是不一样的，从而避免自然感染而导致的疾病。这类活疫苗称为“异位接种的活疫苗”。目前已经在美国军队新兵群体中应用的预防腺病毒引起人的病毒性传染病的活疫苗，采用异位接种的活疫苗。自然感染的腺病毒从呼吸道进入人体后，宿主免疫系统与腺病毒在娇嫩而免疫力弱的肺部发生斗争，导致病毒性传染病；把活的腺病毒装入肠溶胶囊，让接种者口服这种肠溶胶囊，则活的腺病毒将在接种者肠道内释放，并感染免疫力强大的肠道组织，避开了娇嫩的肺，从而使接种者不发生肺炎等严重病变，又能产生良好的免疫力。这种活的腺病毒异位接种的活疫苗在美国新兵群体中使用了数十年，显示出很高的安全性和很高的免疫保护作用，但是这类疫苗是否适合于预防其他病毒性传染病，还不清楚。另外，这种活疫苗接种儿童或幼畜时，可能会遭到母源抗体的干扰。
第三，用致病能力较强或者较弱的活病毒制备全病毒活疫苗，这类疫苗中的活病毒与相应的抗体结合，形成免疫复合物。这类活疫苗称为“免疫复合物活疫苗”。这类疫苗曾经用于牛瘟和黄热病的预防控制，现在还用于鸡传染性法氏囊病的预防控制。它具有安全性高、免疫效果好、能够避免母源抗体干扰等优点。但是，这类疫苗制造所用的抗体来自于对应的病毒感染而康复的人或动物的血清，或者对应的疫苗免疫接种后的人或动物的血清，这些血清都含有针对目标病毒的中和性抗体。这类疫苗的缺点是提供相应抗体的人或动物的血清来源受到限制，并且这些血清中可能还存在其他致病性病原体。
技术实现要素：
本发明公布一类用于预防病毒性传染病的活疫苗，所述活疫苗能够克服上述三类活疫苗的缺点，具有疫苗种毒制备快速、不担心疫苗病毒致病能力返强、适合于多种病毒性传染病的预防、能够避免母源抗体干扰、能够克服提供相应抗体的血清来源受限问题、能够避免提供相应抗体的血清存在其他病原体污染的隐患等优点。
本发明公布一类用于预防病毒性传染病的活疫苗，所述活疫苗含有活病毒，并且所述活疫苗中的活病毒与单克隆抗体结合而形成免疫复合物。
进一步的，所述活疫苗含有活的正黏病毒科的病毒，用于预防正黏病毒科的病毒引起病毒性传染病。
进一步的，所述活疫苗含有活的副黏病毒科的病毒，用于预防副黏病毒科的病毒引起病毒性传染病。
进一步的，所述活疫苗含有活的冠状病毒科的病毒，用于预防冠状病毒科的病毒引起病毒性传染病。
进一步的，所述活疫苗是通过肌肉内注射接种、皮内注射接种、皮下注射接种或静脉注射接种的疫苗。
进一步的，所述活疫苗中的活病毒与两种或两种以上的单克隆抗体结合而形成免疫复合物，并且所述两种或两种以上的单克隆抗体所结合的抗原表位是不同的。
进一步的，所述活疫苗中含有两种或两种以上的活病毒，并且每种活病毒都与对应的单克隆抗体结合而形成免疫复合物。
进一步的，所述活疫苗含有活的呼吸道合胞病毒、诺如病毒、新型冠状病毒、非洲猪瘟病毒、古典猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪传染性腹泻病毒、新城疫病毒、马立克病毒、鸡传染性支气管炎病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、狂犬病毒的一种或几种。
进一步的，所述单克隆抗体是人源化单克隆抗体。
针对不同的病毒性传染病，本发明所述活疫苗的制备方法有所不同，但都大致包括以下步骤。第一，制备大量的能够抑制所述活疫苗中的活病毒在人或动物体内增殖的单克隆抗体，进行分装和保存；第二，选择合适的病毒，作为疫苗种子病毒；第三，利用疫苗种子病毒，在细胞、鸡胚或动物体内，增殖病毒，分装成疫苗祖代种子病毒；第四，取出一支疫苗祖代种子病毒，在细胞、鸡胚或动物体内，进行增殖，分装成疫苗父代种子病毒，某一批疫苗父代种子病毒快要用完时，再取出一支疫苗祖代种子病毒，在细胞、鸡胚或动物体内，进行增殖，分装成新一批疫苗父代种子病毒；第五，取出一支疫苗父代种子病毒，在细胞、鸡胚或动物体内，增殖病毒，将增殖的病毒混合在一起，测定病毒混合液中的病毒含量，测定保存的单克隆抗体中和疫苗病毒的中和效价，依据测定结果，在病毒混合液中加入适量的抗体，确保病毒被完全中和，然后在适当温度下，放置数分钟到数小时。第六，对病毒与单克隆抗体的混合溶液，用高速离心、超滤浓缩、超速离心等方法的组合，提纯病毒-抗体免疫复合体，对提纯的病毒-抗体免疫复合体进行病毒含量的检测，依据检测结果，分装成疫苗，每份疫苗含有设定数量的病毒。第七，对所生产的疫苗进行安全性和有效性检验。
本发明所述活疫苗是利用中和性单克隆抗体来消除活病毒的致病性，又利用病毒-抗体免疫复合物的免疫调理作用，提升疫苗的保护效果。
本发明的新颖性和创造性如下：本发明所述免疫复合物活疫苗采用抗体不是来自于动物的血清中多克隆抗体，而是用单克隆抗体，而单克隆抗体从未用于免疫复合物疫苗。
本发明所述活疫苗的实用性或优点在于：①本发明所述活疫苗可以直接用宿主体内分离到的有致病作用的病毒，制备活疫苗，从而避免了弱毒活疫苗具有疫苗种毒制备困难的缺点；②本发明避免疫苗中的活病毒存在致病能力返强的风险，这是因为本发明所述活疫苗可以用的致病能力强的病毒作为疫苗种毒；③本发明避免既往活疫苗不适合于接种免疫缺陷的人的缺点，这是因为用致病能力强的病毒制备的本发明所述的活疫苗，接种免疫缺陷的人，在抗体的作用下，疫苗中的病毒在这些人的体内也不能增殖，因而也不致病；④与异位接种的活疫苗相比，本发明所述活疫苗具有一定的普适性，只要研制出高效抑制某种病毒在宿主体内增殖的中和性单克隆抗体，那么就大概率上能够用本发明所述活疫苗预防这种病毒引起的病毒性传染病；⑤与现有的免疫复合物疫苗相比，它所需的抗体不是来自人或动物的血清中的多克隆抗体，而是来自单克隆抗体，这可以克服提供相应抗体的血清来源受限问题，又可以避免提供相应抗体的血清存在其他病原体污染的隐患，并且随着单克隆抗体体外培养技术的改进，单克隆抗体的生产成本更低，质量更为稳定；⑥本发明所述活疫苗免疫效果更好，还能够避免母源抗体的干扰，这是因为本发明所述的活疫苗接种有母源抗体的人或动物体内，该活疫苗在体内消耗的母源抗体较少。
本发明所述活疫苗的安全性有充分保障。这是因为本发明所述活疫苗中的活病毒是结合了足够多的中和性抗体的，这就保证了这些活病毒都无法在人或动物体内增殖。那些破坏病毒与中和性抗体结合的因素，如高温、酸、碱、去污剂、酒精等，都能杀灭引起病毒性传染病的活病毒。为了进一步保证所述活疫苗的安全，本发明进一步指出，本发明所述的针对同一种病毒的活疫苗，在生产时，可以同时使用两种或两种以上的针对不同抗原表位的单克隆抗体，使同一个病毒颗粒同时结合两种或两种以上的中和性抗体。
在有效性方面，本发明所述活疫苗含有完好的病毒颗粒，含有相应的致病病毒所有的或者绝大多数的t细胞表位和b细胞表位，因而能够刺激机体产生很强的免疫保护反应。
对于人类病毒性传染病的预防，如果本发明所述活疫苗所用的单克隆抗体是人源化单克隆抗体，那么还可以利用免疫调理作用，进一步提升疫苗的保护效果。这是因为人源化单克隆抗体的fc端能够与抗原提呈细胞的fc受体结合，从而帮助抗原提呈细胞捕获抗原。
本发明所述活疫苗如果含有两种或两种以上的活病毒，并且每种活病毒都与对应的中和性单克隆抗体结合，那么该活疫苗可以同时预防两种或两种以上的病毒感染，即可以预防两种或两种以上的病毒性传染病。
具体实施方式
实施例1
实施例1阐述了预防新城疫病毒的一种活疫苗的制备方法与使用方法。实施例1是说明本发明的具体应用方式。该实施例不是用于限定本发明的应用范围和本发明专利的保护范围。
实施例1所述活疫苗的制备包括以下五个步骤。第一，通过分子流行病学调查，确定某一株新城疫病毒与当地新城疫病毒流行毒株都很相似，并且不含有其他已知的动物病毒，将它确定为疫苗种毒；第二，用疫苗种子病毒接种大量的鸡胚，制备祖代种子病毒，分装成一万支，每支含有的活病毒数量至少为1千万个半数鸡胚感染量，置于负80摄氏度下保存；取出一支保存的疫苗祖代种子病毒，接种大量的鸡胚，制备疫苗父代种子病毒，分装成一万支，每支含有的活病毒数量至少为1千万个半数鸡胚感染量；第三，委托单克隆抗体制备公司完成杂交瘤细胞的筛选，步骤是用疫苗种毒肌肉接种balb/c小鼠，每只小鼠接种10万个半数鸡胚感染量，接种后第28日对这些小鼠再次接种疫苗种毒，每只小鼠接种100万个半数鸡胚感染量，在第二次接种后的第16日，采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出小鼠脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液，再按照常规的单克隆抗体制备方法，筛选两株杂交瘤细胞克隆，这两株杂交瘤细胞克隆分泌能够中和疫苗种毒的igg抗体，并且它们分泌的igg抗体是结合到疫苗病毒不同的抗原表位的，使得它们能够同时结合到疫苗病毒上，并且互不干扰；第四，对获得的杂交瘤细胞进行扩大培养，分装成1000支，置于负80摄氏度下保存，用作这些细胞的祖代种子，取出1支父代种子细胞，进行扩大培养，分装成1000支，置于负80摄氏度下保存，用作这些细胞的父代种子；第五，每株杂交瘤细胞各取出1支父代种子，利用体外细胞培养系统，进行培养，收获杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，测定它们的中和效价，进行分装冻存；第六，取出一支疫苗父代种子病毒，接种大量的鸡胚，增殖病毒，收获含有大量病毒的鸡胚尿囊液，进行混合，用血凝试验测定混合的尿囊液中病毒含量；第七，取出冻存的单克隆抗体，依据它们的中和效价，添加到含有大量病毒的鸡胚尿囊液的混合液中，要求每株单克隆抗体都能够完全中和混合液中4倍的病毒，确保病毒被完全中和，添加混匀后，在25摄氏度下，放置3小时；第八，对上述抗体与病毒混合液进行高速离心，去除沉淀，对上清液用0.45nm的滤膜进行过滤，在过滤后的溶液中添加氯化镁、甘油、庆大霉素，然后进行分装，制备成疫苗，用于预防家禽新城疫。
如表1所示，对疫苗进行安全性和效果测试：spf鸡60只随机分为6组，即a、b、c、d、e、f组，每组10只；a组直接接种疫苗种毒(具有高致病性)，每只鸡接种1万个半数鸡胚感染量；b组接种实施例1活疫苗，每只鸡接种1万个半数鸡胚感染量(按照添加抗体之前测定的病毒含量计算)；c组接种实施例1活疫苗，每只鸡接种的病毒为1000万个半数鸡胚感染量(按照添加抗体之前测定的病毒含量计算)；d组接种利用上述疫苗种毒按照常规甲醛灭活方法制备的灭活疫苗，每只鸡接种1万个半数鸡胚感染量(按照病毒灭活之前测定的病毒含量计算)；e组接种利用上述疫苗种毒按照常规甲醛灭活方法制备的灭活疫苗，每只鸡接种1000万个半数鸡胚感染量(按照病毒灭活之前测定的病毒含量计算)；f组不接种病毒或者疫苗，注射同体积的生理盐水；接种后，a组鸡在5日内全部发病，全部死亡，其他5组鸡全部没有表现出临床症状，全部存活。接种后第30日进行攻毒，即对存活的5组鸡，接种疫苗种毒，每只鸡接种100万个半数鸡胚感染量，结果攻毒后5日内d组和f组的鸡全部发病，全部死亡，其他4组的鸡全部没有表现出临床症状，全部存活。该测试结果提示实施例1活疫苗具有很高的安全性，每只鸡接种的活疫苗含有1000万个半数鸡胚感染量的病毒(添加抗体前测定的)，也不发病不死亡；虽然灭活疫苗也具有相同的安全性，但是其免疫效果较差，在接种剂量较小时(每只鸡接种1万个半数鸡胚感染量，按照病毒灭活之前进行测定的)，所有的鸡都没有产生足够的免疫保护作用，在攻毒后都发病都死亡了。相对而言，实施例1活疫苗不仅具有很高的安全性，而且免疫效果很好，在接种剂量较小时(每只鸡接种1万个半数鸡胚感染量，按照添加抗体之前进行测定的)，所有的鸡都产生足够的免疫保护作用，在攻毒后都没有发病，都没有死亡。
表1.5组鸡接种疫苗和攻毒之后的死亡率