干石斛水提物在制备治疗肥胖药物中的应用的制作方法

本发明涉及制药技术领域，尤其涉及干石斛水提物在制备治疗肥胖药物中的应用。

背景技术：

肥胖及其相关性代谢性疾病正逐渐成为影响全球人类健康的重要威胁之一。并且,随着生活环境的变化现代人的内脏脂肪型肥胖会增加，并且伴随糖尿病、高血压、脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗性等的代谢综合征(metabolicsyndrome)的发病剧增，这些疾病增加相互间的发生危险,是与老化、应激及免疫功能降低等多元化的生体代谢变化相关的共同疾病。就作为以往的代表性肥胖治疗剂而言,将奥利斯他(orlistat)作为主原料的赛尼可具有脂肪泻、胃肠气胀、涨肚等副作用，诺美婷具有头疼、口渴、食欲不振、失眠、便秘等副作用。并且，奥利斯他抑制维生素e和维生素d的吸收,苯丁胺(phentermine)和西布曲明(sibutramine)具有造成心率增加/心悸、晕眩的副作用。因此,随着西方医学在克服合成医药品的副作用和慢性疾病时受到局限,正要开发出新的天然物新药。

石斛是常用名贵中药材，性味甘淡微咸，寒，归胃、肾，肺经。始载《神农本草经》，品种众多，其中霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛和马鞭石斛是石斛中的上品。又名林兰(《神农本草经》)、千年润(《本草纲目》)等，其具有较高的观赏价值和药用功能，在李时珍《本草纲目》中记载，石斛有“补五脏、劳贏瘦、滋阴益精、久服厚肠胃、平胃气、长肌肉、定志除惊、轻身延年”等功效。根据我们的文献调研，尚未发现石斛或者石斛提取物可以应用于肥胖疾病的治疗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种干石斛水提物在制备治疗肥胖药物中的应用，是石斛提取物的一种新用途。目前没有任何报道表明干石斛水提取物可以应用于肥胖疾病的治疗。

干石斛水提物在制备治疗肥胖药物中的应用，所述干石斛水提取物由石斛药材经提取得到。

进一步的，所述石斛为霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛、流苏石斛和鼓槌石斛中的一种或者两种以上的组合。

进一步的，所述干石斛水提物的制备步骤为：将石斛干粉用18-20倍重量份的蒸馏水于55-65℃水浴中进行提取,过滤并收集滤液，重复提取，合并提取液，然后减压浓缩至原总体积的1/6-1/8后，冷冻干燥至恒重。

进一步的，所述干石斛水提物可制成一切药学可接受口服和非口服制剂形式，例如可以为颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、膏剂、口服液剂中的一种。

本发明的有益效果是：

（1）本发明制备的干石斛水提物能够明显抑制脂肪酸结合蛋白的基因表达，对脂肪酸代谢产生有益效应，进而抑制肥胖疾病的发生；

（2）本发明制备的干石斛水提物能够明显抑制huh7细胞中二酰基甘油酰基转移酶的基因表达，抑制甘油三酯的合成，增加葡萄糖摄取率和能量消耗,进而抵抗高脂饮食导致的肥胖。

因此，本发明制备的干石斛水提物能够制备治疗肥胖的药物，在治疗肥胖疾病方面具有良好的发展前景。

附图说明

图1为干石斛水提物抑制脂肪酸结合蛋白的基因表达；

其中，数据以means±sd表示，fabp4：脂肪酸结合蛋白4，^**p＜0.01，^***p<0.05；给药组vs空白对照组；dwe：drydendrobiumwaterextraction干石斛水提物；fold：倍数。

图2为干石斛水提物抑制huh7细胞中二酰基甘油酰基转移酶的基因表达；

其中，数据以means±sd表示，dgat1：二酰基甘油酰基转移酶1，^**p＜0.01，^***p<0.05；给药组vs空白对照组；dwe：drydendrobiumwaterextraction干石斛水提物；fold：倍数，

图3为甘油三酯合成的路径图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

甘油三酯(缩写为tg）生物能量储存的主要形式，当人体摄入的能量超过其消耗的能量时，过剩的能量便以tg的形式储存在脂肪组织，同时过多的tg他会在胰岛β细胞、肝脏等组织沉积，最终导致肥胖和糖尿病等疾病。在体内以甘油三酯(tg）为主要生物能量储存，甘油tg主要在肝脏、脂肪组织以及小肠中合成，tg的合成有两条路径（见图3）：3-磷酸甘油途径（主要途径）和单酰甘油途径（次要途径）。首先3-磷酸甘油与脂酰coa生成磷脂酸，后者在磷酸酶作用下脱磷酸形成二酰甘油（dag），dag也可经次要途径单酰甘油和脂酰coa生成。dag催化tg合成最后一步：脂酰辅酶a酰基转移到dag形成tg，是合成tg的限速酶。当人体摄入的能量超过其消耗的能量时，过剩的能量便以tg的形式储存在脂肪组织，同时过多的tg他会在肝脏组织内沉积，最终导致肥胖疾病。因此，抑制上述组织内tg的合成可作为治疗肥胖的一种策略。

二酰基甘油酰基转移酶(diacylgycerolacyltransferase,dgat)是催化tg合成途径的关键酶，其表达水平的高低直接影响着最终tg的含量。dgat是一种内质网膜整合蛋白，有两种亚型：dgat1和dgat2两种类型,研究表明,抑制dgat1的活性可以降低tg的合成,改善机体对胰岛素和瘦素敏感性,增加葡萄糖摄取率和能量消耗,抵抗高脂饮食导致的肥胖等,可作为治疗肥胖疾病的靶标。

肥胖是以脂肪细胞增生肥大，同时伴巨噬细胞在脂肪组织中浸润和聚集为特征，脂肪细胞现在被认为分泌大量与全身胰岛索敏感性及能量代谢有关的生物活性物质。脂肪酸结合蛋白(fattyacid-bindingprotein4,fabp4)是从脂肪细胞分泌出来并大量存在于人血清中。fabp4是一族多源性低分子量胞内蛋白,广泛分布于哺乳动物的小肠、肝、脂肪、心、脑和骨骼肌等多种细胞中,具有组织特异性。fabp4在长链脂肪酸的摄取、转运及代谢调节中发挥着重要作用。fabp4基因缺陷小鼠的研究结果表明，减少fabp4的表达可改善外周的胰岛素抵抗,保护胰岛β细胞功能，对于脂肪酸代谢产生有益的效应，从而抑制肥胖疾病的发生，因此，可以作为治疗肥胖疾病的靶向药物。

本发明通过对上述tg合成以及脂代谢相关基因的mrna表达水平进行检测，来研究干石斛水提物作为药物应用于肥胖治疗的效果。

由于现有药用石斛的种类很多，这里本发明实施例以霍山石斛为例，研究干石斛水提物作为药物应用于肥胖治疗的效果。但本发明中的石斛并不仅限于霍山石斛，也可以是其他同属的药用石斛，例如铁皮石斛、金钗石斛、流苏石斛或者鼓槌石斛等。

霍山石斛，原产于我国安徽霍山等地，是国家现代中药重大专项200多个濒危稀缺品种中首位保护品种，是药用石斛中的极品，也是霍山县独有的、拥有原产地地理标志的名贵中药材，历史上被誉为“中华九大仙草之首”、“健康软黄金”，《神农本草》、《本草纲目》均有记载。霍山石斛所含有的多糖能大幅度提高人体内sod(延缓衰老的主要物质)，在增强免疫力、抗疲劳、延缓衰老和促进癌细胞凋亡等方面有明显作用，从而达到保健益寿的功效。

实施例1

制备干石斛水提物，具体步骤如下：

干石斛水提物的制备：称取20g霍山石斛干粉，用400ml蒸馏水在55℃水浴中进行提取,过滤并收集滤液，重复提取3次,每次提取1h,合并3次提取液。将合并后的提取液在55℃下减压浓缩至原液体体积的1/6-1/8后，进行冷冻干燥至恒重，得到质量体积浓度为100mg/ml的干石斛水提物。

将上述实施例1中制备质量浓度为100mg/ml的干石斛水提物，在试验前用0.22μm的滤膜过滤除菌，然后稀释，制备成质量浓度依次为10μg/ml、100μg/ml、1000μg/ml的一系列干石斛水提物药液，进行冷藏保管来用于实验，备用。

（ⅰ）检测干石斛水提取物对raw264.7细胞中的脂代谢相关基因fabp4的mrna的表达

raw264.7(小鼠单核巨噬细胞)采用dmem完全培养基（之中添加10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素)在37℃、体积分数5％co2的培养箱中培养，细胞同步化12h，随机分成2大组，即：①空白对照组：不给药（0μg/ml）；②给药组：干石斛水提取物高剂量组(dwe：1000μg/ml)、干石斛水提取物中剂量组(dwe：100μg/ml)、干石斛水提取物低剂量组(dwe：10μg/ml)；给药作用12h，荧光定量pcr：使用rnaisoplus提取raw264.7细胞的总rna，通过oligodt18将1μg总rna逆转录为cdna，通过定量pcr技术，使用toyobo公司thunderbirdsybrqpcrmix试剂按照说明书对引物进行pcr扩增。每组样品3个复孔，以保证实验数据的有效性。使用gapdh为内参，检测目的基因fabp4（脂肪酸结合蛋白）mrna相对于内参基因（gapdh）的表达变化来定量。采用graphpad7分析数据(即实验组目的基因相对于空白对照组的表达量的变化倍数)。所用引物为：fabp4（mfabp4-f：aaatcaccgcagacgacagg；mfabp4-r：aactcttgtggaagtcacgcc）。

结合附图1的实验结果可知，由本发明制备的干石斛水提物相对空白对照组（给药浓度为0μg/ml），高剂量和中剂量石斛水提取物的给药均能够明显抑制脂肪酸结合蛋白(fabp4)的mrna表达水平，能够对脂肪酸代谢产生有益效应，进而抑制肥胖疾病的发生。因此，干石斛水提物可以作为治疗肥胖疾病的药物使用。

（2）检测干石斛水提物对体外huh7细胞中tg合成相关基因dgat1的mrna的表达

分组：huh7细胞复苏后，用含40％的hfd（高脂）培养液转入培养皿中，在37℃、5％co2条件下培养，细胞同步化12h，随机分成2大组，即：①空白对照组：不给药（0μg/ml）；②给药组：干石斛水提物高剂量组(dwe：1000μg/ml)、干石斛水提物中剂量组(dwe：100μg/ml)、干石斛水提物低剂量组(dwe：10μg/ml)；给药作用12h后，荧光定量pcr：使用rnaisoplus提取huh7细胞的总rna，通过oligodt18将1μg总rna逆转录为cdna，通过定量pcr技术，使用toyobo公司thunderbirdsybrqpcrmix试剂按照说明书对引物进行pcr扩增。每组样品3个复孔，以保证实验数据的有效性。使用gapdh为内参，检测目的基因二酰基甘油酰基转移酶1(dgat1)相对于内参基因（gapdh）的表达变化来定量。采用graphpad7分析数据(即实验组目的基因相对于空白对照组的表达量的变化倍数)。所用引物为：dgat1（hdgat1-f：ggtgccctgacggagcaggc；hdgat1-r：cagtaagaccacagccgctg）。

结合附图2的实验结果可知，由本发明制备的干石斛水提物相对空白对照组（给药浓度为0μg/ml），高剂量和中剂量石斛水提取物的给药均能够明显抑制二酰基甘油酰基转移酶1(dgat1)的mrna表达水平，由此可知，干石斛水提物能够抑制dgat1的活性，而dgat1的活性的降低可以抑制tg的合成,从而增加葡萄糖摄取率和能量消耗,抵抗高脂饮食导致的肥胖等,因此，干石斛水提物可以作为治疗肥胖疾病的药物使用。

综上所述，本发明提供的干石斛水提物可以明显抑制二酰基甘油酰基转移酶(dgat)和脂肪酸结合蛋白(fabp4)的mrna表达水平，不仅可以抑制tg的合成，而且能够有效调节脂代谢的水平，因此，干石斛水提物可以作为治疗肥胖疾病的药物使用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。