CpG寡脱氧核苷酸、包含其的免疫组合物及制备组合物并通过其刺激免疫反应的方法与流程

cpg寡脱氧核苷酸、包含其的免疫组合物及制备组合物并通过其刺激免疫反应的方法
[0001]
本申请是申请号为201480041044.7(pct申请号为pct/us2014/047271)、申请日为2014年07月18日、发明名称为“cpg寡脱氧核苷酸、包含其的免疫组合物及组合物用于制备治疗以刺激免疫反应的药物的应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002]
相关申请的交互参照
[0003]
本申请主张于2013年7月19日申请的美国临时申请no.61/856268的效益，其公开在这里完全并入以作为参考。
[0004]
本发明一般关于cpg寡脱氧核苷酸、包括cpg寡脱氧核苷酸的免疫组合物、用于制备免疫组合物的方法以及用于刺激免疫反应的方法，特别是包括gacgtt或 aacgtt基序的cpg寡脱氧核苷酸、包括cpg寡脱氧核苷酸的免疫组合物、用于制备免疫组合物的方法以及用于刺激tlr9活化免疫反应的方法。


背景技术：

[0005]
cpg寡脱氧核苷酸(cpg-odn)是有效的免疫刺激，且类铎受体9(tlr9)为其细胞受体(1-5)。由于cpg-odn的tlr9活化而可能导致若干免疫作用，包含增加t辅助 (th)1极化细胞激素生成、调升主要组织兼容性复体(mhc)共同刺激分子，以及活化及增加b细胞增生以增加抗体生成。因为这些有效的免疫刺激作用，因此cpg-odns 在人类的过敏、癌症及传染病免疫治疗的广泛应用范围内被研究，以作为不同物种的佐剂(adjuvant)(6-11)。
[0006]
一般而言，cpg-odn包含18-24个硫代磷酸酯脱氧核苷酸(phosphorothioateddeoxynucleotides)的长度，具包含六聚体基序(cpg基序)的一或多份(copies)cpg脱氧核苷酸，且其免疫刺激活性是根据cpg基序的数目，以及cpg基序的位置、间距及周边碱基而定。cpg-odn的免疫刺激活性在不同物种中可能相异。目前所知为该物种相异性是通过cpg-odn中的cpg基序的核苷酸内容(context)来决定。例如，含 gtcgtt基序的cpg-odn相比具有gacgtt基序的，会在人体及不同家畜中产生较高的免疫反应；相反地，后者在鼠类细胞(3,4)中活化较为有效。cpg-odn物种相异活性是由于不同物种(12,13)的tlr9活化的不同程度。
[0007]
现有研究显示，相比人类(h)tlr9及小鼠(m)tlr9，兔子(rab)tlr9对于具有 gtcgtt基序或gacgtt基序的cpg-odn具有更广的配体识别模式(ligandrecognition profile)；然而，目前开发用于活化人类或小鼠细胞的cpg-odn对rabtlr9 (14)具有低活性。这些结果与由rankin等人报告的观察相符。其中观察显示具有 gtcgtt或gacgtt基序的cpg-odn在活化兔子细胞(15)上并无偏好性。因此，开发对rabtlr9具有高活性以产生兔子抗体反应的cpg-odn而作为tlr9活化佐剂，进而增加兔子的抗体生成为不可或缺的。
[0008]
参考文献
[0009]
下列参考文献的公开是通过引用而完全并入本文。
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技术实现要素：

[0027]
因此，本发明的主要目的是提供包括gacgtt或aacgtt基序的cpg寡脱氧核苷酸、包括cpg寡脱氧核苷酸的免疫组合物、用于制备免疫组合物的方法以及组合物用于制备治疗以刺激tlr9活化免疫反应的药物的应用，因而使在宿主中提升抗体可更为有效。
[0028]
为达成上述目的，本发明提供cpg寡脱氧核苷酸(cpg-odn)用于在宿主中引发 tlr9活化免疫反应，cpg寡脱氧核苷酸包括11-14个核苷酸的gacgtt或aacgtt 基序。
[0029]
优选地，cpg-odn可由11-12个核苷酸组成。
[0030]
优选地，cpg-odn可选自于由seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、 seq id no:5及seq id no:6的核苷酸序列所组成的群组。
[0031]
优选地，cpg-odn可为seq id no:1的核苷酸序列。
[0032]
优选地，宿主可为小鼠或兔子。
[0033]
优选地，gacgtt或aacgtt基序可不位在cpg-odn的5
’
端或3
’
端。
及安全性的示意图。针对各周期的免疫作用及血清收集是采取如所示的3周间隔时间表(图3a)。10μg的ova以pbs的50μg的cpg-odn或cfa/ifa配制(图3b)，3μg 的ova以pbs的50μg的cpg-odn或cfa/ifa配制，以测定追加免疫的抗体生成中作为佐剂的cpg-c4609的效力及安全性(图3c)。抗ova抗体效价以elisa测定。上图表(upper panels)：如所示，在注射不同抗原与佐剂的组合物后的第2天，检验注射部位的皮下组织(图3d)。下图表：从这些组织取出的切片的he染色。上图表：出现在注射cfa/ifa兔子的肉芽肿的示例(图3e)。下图表：从此肉芽肿取出的切片的 he染色。
[0054]
图4是通过源自cpg-2007及cpg-1826的cpg-odn作rabtlr9活化的示意图。分别开发于活化人类及小鼠细胞的cpg-2007及cpg-1826显示为对rabtlr9具有低活性。这两个cpg-odn如右边列表所示修饰(modified)成在其序列中包含不同 gacgtt及gtcgtt基序的组合。293细胞以针对rabtlr9及nf-κb控制的荧光素酶报导基因的表现载体转染，且接着以2μm的这些cpg-odns进行处理。测定这些细胞中诱导的荧光素酶活性。显示的数据表示为平均值
±
标准偏差(n＝3)。这些结果指出cpg-1826c在rabtlr9的活化上具有较好的活性。
[0055]
图5是通过源自cpg-1826c的cpg-odn作rabtlr9活化的示意图。cpg-1826c 如右边列表所示进一步修饰成具有不同序列的cpg-odn，以探讨其对rabtlr9活性的分子决定因素(molecular determinant)。以rabtlr9及nf-κb控制荧光素酶报导基因的表现载体所转染的293细胞是以这些cpg-odn进行处理。测定相对荧光素酶活性。显示的数据表示为平均值
±
标准偏差(n＝3)。结果指出具14个寡脱氧核苷酸长度的cpg-c4对rabtlr9具有较好的活性。
[0056]
图6是通过源自cpg-c4的cpg-odn作rabtlr9活化的示意图。cpg-c4如右边列表所示进一步修饰成具有不同序列的cpg-odn。以rabtlr9及nf-κb控制荧光素酶报导基因的表现载体所转染的293细胞是以这些cpg-odn处理。测定相对荧光素酶活性。显示的数据表示为平均值
±
标准偏差(n＝3)。结果指出具12个脱氧核苷酸长度的cpg-c43对rabtlr9具有较好的活性。
[0057]
图7是通过源自cpg-c43的cpg-odn作rabtlr9活化的示意图。cpg-c43如右边列表所示进一步修饰成具不同长度的8-12个脱氧核苷酸的不同cpg-odn，以测定用于rabtlr9活化的最佳长度。以rabtlr9及nf-κb控制荧光素酶报导基因的表现载体所转染的293细胞以这些cpg-odn进行处理。测定相对荧光素酶活性。显示的数据表示为平均值
±
标准偏差(n＝3)。结果指出具12个脱氧核苷酸长度的cpg-c43 对rabtlr9具有最强的活性，且具11个脱氧核苷酸长度的cpg-c4302对rabtlr9 保持具有不错的活性。
[0058]
图8是通过开发于兔子的cpg-odn作鼠脾细胞活化的示意图。鼠脾细胞以2μm 针对人类(cpg-2006及cpg-2007)、小鼠(cpg-1826)及开发于兔子(cpg-46及 cpg-4609)优化的不同cpg-odn刺激。(a)il-6、(b)ifn-γ的诱导以及(c)igm的生成是通过elisa测定。显示的数据表示为平均值
±
标准偏差(n＝3)。
[0059]
图9a至图9b是小鼠追加免疫抗体生成中所开发的cpg-odn的有效性的示意图。c57/b6j小鼠的各周期免疫作用及血清收集是采取如所示的10天间隔时间表(图 9a)。针对各小鼠将1μg的ova以/不以pbs的5μg的cpg-odn作配制。抗ova 抗体效价以elisa测定(图9b)。
具体实施方式
[0060]
本发明技术内容将通过下列实施例的详细描述及相关附图绘示而变得显而易见。
[0061]
定义
[0062]“大约”或“大概”，当结合可测量的数值变量使用时，是指变量的指示值以及在指示值的实验误差内(例如，平均值的95％信赖区间(confidence interval))或在指示值的 10％内的变量的所有值，从中取最大值。
[0063]“佐剂”是指增强对抗原的体液或细胞免疫反应的任何物质。佐剂一般用于达成两个目的：延缓抗原从注射部位的释放，以及免疫系统的刺激。
[0064]“抗体”是指能结合特异性抗原的免疫球蛋白分子，作为对该抗原的免疫反应的结果。免疫球蛋白是由具有“恒定区”及“变异区”的“轻”及“重”多肽链所组成的血清蛋白，且根据恒定区的组成而分类(例如，iga、igd、ige、igg及igm)。
[0065]“抗原”或“免疫原”是指刺激免疫反应的任何物质。该项目包含杀死、灭活、弱化或修饰的活菌、病毒或寄生虫。抗原项目也包含多核苷酸、多肽类、重组蛋白质、合成肽、蛋白质萃取物、细胞(包含肿瘤细胞)、组织、多醣类或脂质，或者其片段，单独或以其任何组合。抗原项目也包含抗体，如抗独特型(anti-idiotype)抗体或其片段，且合成可模拟抗原或抗原决定位(表位)的肽拟抗原决定部位(mimotopes)。
[0066]“缓冲剂”是指防止另一化学物质浓度变化的化学系统，例如质子给予及接受系统作用为防止氢离子浓度(ph)显著变化的缓冲剂。缓冲剂进一步的示例为包含弱酸及其盐类(共轭碱)或弱碱及其盐类(共轭酸)的混合物的溶液。
[0067]“细胞免疫反应”或“细胞介导的免疫反应”是通过t淋巴细胞或其他白血球或两者所介导的，且包含细胞激素、趋化因子及通过活化t细胞、白血球或两者所产生的类似分子生成。
[0068]“剂量”是指供给宿主的疫苗或免疫组合物。“第一剂量”或“初始疫苗(primingvaccine)”是指在第0天供给此类组合物的剂量。“第二剂量”或“第三剂量”是指第一剂量后续供给的组合物量，其可与或可不与第一剂量为相同疫苗或免疫组合物。
[0069]“赋形剂”是指非抗原的疫苗任何成分。
[0070]
宿主的“免疫反应”是指对抗原的体液免疫反应、细胞免疫反应或体液及细胞免疫反应的发展。免疫反应通常可使用标准免疫分析法(standard immunoassays)及中和分析法(neutralization assays)测定，其在所属领域中为众所皆知的。
[0071]
抗原的“免疫有效量”或“产生免疫反应的有效量”是指足以具毒性在受体(recipient) 中诱导免疫反应的量。免疫反应可足够用于诊断目的或其他测试，或可适当防止疾病的症候(signs)或症状(symptoms)，包含通过病原体感染所导致的不良健康影响或其并发症。体液免疫或细胞介导免疫或两者可被诱导。动物对免疫组合物的免疫反应可被评估，例如间接通过抗体效价、淋巴细胞增生测试的测量、或在以野生型菌株挑战后直接监测症候或症状的测量。免疫反应可包括，但不限于，诱导细胞及/或体液免疫。如以下将指出的，所需确切量将根据宿主物种、年龄及全身状况、被处理情形的严重性及感兴趣的特定大分子、给药模式等，而在不同宿主之间有所差异。在任何独立情况下，适当的“有效”量可由所属技术领域普通技术者使用常规实验而测定。
[0072]“免疫性”指激起免疫或抗原反应。因此，免疫组合物将为诱导免疫反应的任何组
合物。
[0073]“给药”指物质的引入，如免疫组合物通过至少皮下、肌内、经皮性的、皮内、腹膜内、眼内及静脉内给法至宿主。
[0074]“宿主”指为理想给药佐剂组合物的任何动物。包含哺乳动物及非哺乳动物，包含灵长类、家畜、伴侣动物、实验室试验动物、眷养野生动物、鸟纲(包含卵)、爬虫类及鱼。因此，该项目包含但不限于猴子、人类、猪只；牛、绵羊、山羊、马科动物、小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、兔子、猫(felines)、犬(canines)、鸡、火鸡、鸭、其他家禽(poultry)、青蛙及蜥蜴(lizard)。优选地，宿主为小鼠或兔子。
[0075]
材料及方法
[0076]
试剂及抗体
[0077]
cpg-odns从英杰(invitrogen)或基龙米克斯生物科技(genomics biosci and tech) (新北，中国台湾)购买。卵清蛋白(ovalbumin)及氢氧化铝凝胶从invivogen购买。佛朗氏完全佐剂及不完全佐剂从赛默飞世尔(thermo scientific)购买。荧光素酶测试试剂从普洛麦格科技(promega)购买。
[0078]
动物管理
[0079]
纽西兰白兔及c57/b6j小鼠根据实验动物管理规范(guidelines of the institutionalanimal care)及卫生研究院(national health research institutes)的使用委员会(usecommittee)来维护及处理。
[0080]
tlr9活性测试
[0081]
如之前所述产生兔子、人类及小鼠tlr9表现建构(expression constructs)(14)。为实行tlr9活性测试，293细胞生长在补加10％胎牛血清的dulbecco极限必需培养基(dulbecco
’
s minimum essential medium)(dmem)中，置于24孔盘中并使其贴附过夜培养。这些细胞使用具有tlr9表现载体、β-半乳糖苷酶质粒(β-galactosidase plasmid) 以及nf-κb驱动荧光素酶报导质粒(nf-κb driven luciferase reporter plasmid)的polyjet (signagen)共转染，且如所指示般在隔天以2μm各种cpg-odn处理7小时。测定各试样的细胞溶解(lysed)及荧光素酶活性。对照未刺激的控制组计算相对荧光素酶活性作为诱发倍率(fold induction)。数据表示为平均值
±
标准偏差(n＝3)。
[0082]
细胞激素诱导的反转录聚合酶连锁反应(rt-pcr)分析
[0083]
从兔脾制备脾细胞且维持在补加10％胎牛血清的rpmi培养基。为了细胞激素诱导的分析，细胞以2μm的cpg-odn处理4小时。总rna按照制造商的操作手册以rneasy mini试剂盒(rneasy mini kit)(qiagen)从样本分离。然后使用superscript
tm
预扩增试剂盒(superscript
tm preamplification kit)(invitrogen)从所收集的总rna样本来合成第一股cdna基因库，且使用expand hi fid pcr试剂盒(expand hi fid pcrkit)(roche)实行pcr扩增。本发明实施例所使用的引物列于下列表1。pcr产物以溴化乙菲锭(ethidium bromide)染色后在1％琼脂凝胶上通过电泳可视化。
[0084]
表1
[0085][0086]
细胞增生测试
[0087]
脾细胞的增生是根据制造商的说明书(promega，wi，usa)通过celltiter aqueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(mts)(celltiter 96aqueous non-radioactivecell proliferation)测试来测定。简单地说，兔脾细胞(1x105/孔)以2μm的cpg-odn 处理48小时。各孔加入mts/pms溶液至2小时。通过envision放大发光亲近均值分析多功能测读仪(envision alpha multilabel reader)(珀金埃尔默公司(perkinelmer)) 在490nm测量吸收度。
[0088]
细胞激素及总igm生成的elisa测试
[0089]
兔脾细胞或鼠脾细胞(1x 106/ml)以2μm的cpg-odn处理2天。收集细胞培养基用于测量细胞激素及igm诱导。根据制造商的说明书，总兔子igm是通过兔子igmelisa试剂盒(rabbit igm elisa kit)(基因纬生物技术(genway biotech)，圣地亚哥，加州)作测量，而小鼠细胞激素及igm以ebiosciences(圣地亚哥，加州)的elisa试剂盒作测量。
[0090]
抗ova抗体测量
[0091]
卵清蛋白是溶解于elisa被覆缓冲液(ebioscience，圣地亚哥，加州)并且被覆 (2μg/孔)在96孔超清晰聚苯乙烯微量滴定盘(96-well ultra-clear polypstyrene microtiterplate)(basic life，台北，中国台湾)在4℃下过夜。孔盘以200μl的清洗溶液(1x pbs及 0.05％吐温20(tween 20))清洗4次并且以1倍测试稀释液(ebioscience)在室温下阻断 1小时。清洗4次后，加入100μl的稀释血清并在4℃培养隔夜。随后，清洗5次后，加入100μl的1/5000稀释的生物素键合亲和力纯化的抗兔子igg (biotin-conjugated affinity purified anti-rabbit igg)(kpl公司，盖瑟斯堡，马里兰州)，并且培养混合物1小时。清洗之后，加入100μl/孔的1/500稀释的抗生物素蛋白
ꢀ-
hrp(avidin-hrp)(ebioscience)并培养30分钟。清洗4次后，加入100μl的 tmb(ebioscience)而显影。经由加入50μl的2n h2so4终止反应。以envision alphamultilabel reader(perkinelmer)在450nm下测定吸收度。
[0092]
组织学分析
[0093]
针对组织学分析，分离的组织浸渍在10％福尔马林中。接着这些试样再包埋在石蜡中，且切片以苏木紫-伊红(he)染色。
[0094]
统计分析
[0095]
数据组是表示为平均值
±
标准偏差。使用司徒顿t检验(student's t-test)实行统计分析。所有组别来自三或多个独立实验。p<0.05是视为具统计差异。
[0096]
结果
[0097]
起初，本发明的发明人好奇如果如同现有技术描述部分所述一样cpg-odn同时包含gtcgtt及gacgtt基序，则cpg-odn对rabtlr9的活性将会如何。对人类及小鼠细胞优化的cpg-2007及cpg-1826分别包含3份gtcgtt基序及2份 gacgtt基序。以这两种不同型cpg基序将同一cpg-odn修饰成不同cpg-odn。这些cpg-odn的活性是基于细胞的rabtlr9活性测试来探讨，其中rabtlr9的活性是通过荧光素酶报导活性作测量。有意思的是，本发明的发明人发现具有一份 gacgtt基序接续具有一份gtcgtt基序的cpg-1826-c，相比其亲本 (parental)cpg-2007、cpg-1826及其他修饰cpg-odn而言具有较好的活性(图4)。根据本发明实施例在图4测试的cpg-odn列在以下表2中。
[0098]
表2
[0099][0100]
在尝试开发用于rabtlr9的有效活化及兔子免疫反应的优化cpg-odn上，本发明的发明人怀疑cpg-odn中的一份gacgtt及一份gtcgtt基序对于加强活性是否确实需要。cpg-1826-c通过在两种不同类型基序中反向(reversed)cpg-脱氧核苷酸，或将5
’
端或3
’
端gacgtt或gtcgtt基序删除来进一步修饰成各种不同 cpg-odn。在这些cpg-odn之间，cpg-c4对rabtlr9产生最佳活性。该cpg-odn 包含14个硫代磷酸酯脱氧核苷酸的长度，且是具有3
’
端gtcgtt基序删除的 cpg-1826-c的截断形式。其指出3
’
端gtcgtt基序对于rabtlr9的加强活性而言并不是必要的(图5)。另外，从分别包含20、16至14个硫代磷酸酯脱氧核苷酸的减少长度的cpg-1826c、cpg-c3及cpg-c4的增加活性，引领发明人推测cpg-odn 的长度对于rabtlr9的加强活性而言可能是不可或缺的。根据本发明的实施例，在图5中测试的cpg-odn列在以下表3中。
[0101]
表3
[0102]
[0103][0104]
本发明的发明人进一步减少长度并且改变5
’
及3
’
硫代磷酸酯脱氧核苷酸以修饰 cpg-odn。从基于细胞的活性测试结果指出包含12个硫代磷酸酯脱氧核苷酸的长度具gacgtt基序或aacgtt基序的cpg-odn，如cpg-43、cpg-4309、cpg-46及cpg-4609，是对兔子的tlr9具有强活性，而那些具有gtcgtt基序或atcgtt基序的cpg-odn，如cpg-c4308、cpg-c4310、cpg-c4608及cpg-c4610，则具有弱活性(图6及图1a)。虽然没有cpg-43好，包含11个硫代磷酸酯脱氧核苷酸的 cpg-odn，如cpg-4302，是对rabtlr9仍保持具有优良活性，但对长度的更进一步修剪(trimming)则会显著减少活性(图7)。根据本发明的实施例，在图6、图7及图1a 所测试的cpg-odns是分别列在下列表4、表5及表6中。
[0105]
表4
[0106][0107]
表5
[0108][0109]
表6
2％(v/v)的范围内，优选地在0.2-1.2％(v/v)的范围内，最佳地在0.2-1％(v/v)的范围内。在优选实施例中，当与3μg的ova混合时，通过于1％氢氧化铝凝胶(明矾)中的50μg的 cpg-c4609所诱导的抗体反应比单独通过明矾或通过cfa/ifa所引发的还要好(图 3c)。进一步检验这些佐剂的副作用。在sc注射后的第2天，大规模的病变及发炎反应发生在cfa注射部位的皮下组织。相反地，在明矾或混合cpg-c4609的明矾的注射部位观察到较少的组织损伤或无组织损伤(图3d，上图表)。相似地，以he染色的组织病理分析显示在cfa注射部位上有白血球浸润(leukocytes infiltration)以及皮下组织损伤，而注射明矾以及混合cpg-c4609的明矾的区域则没有(图3d，下图表)。另外，如图3e所示的肉芽肿有时会在cfa/ifa注射部位上观察到，但这不会在明矾或混合cpg-c4609的明矾的注射部位上观察到。这些指出cpg-4609相比cfa/ifa具较少毒性，且对于引发兔子的有效抗体反应而言为较安全的佐剂。
[0113]
总体来说，在本发明的实施例中，本发明的发明人开发了用于有效标靶tlr9以活化兔子免疫反应的cpg-odn类型。这些cpg-odns包括gacgtt基序或 aacgtt基序，其都是有效活化mtlr9(3,4)的cpg-基序。在这方面，一致的是小鼠及兔子都是啮齿动物，且mtlr9及rabtlr9在系统发育(phylogenetically)上与彼此密切关联。该型的cpg-odn是独特的且在长度上不同于当前开发用于人类及小鼠的cpg-odn。11-12个脱氧核苷酸的短长度好于rabtlr9的有效活化。其指出除了 cpg基序外，cpg-odn的长度对于其在不同物种中的不同活性也是关键因素。对于人类及小鼠优化的cpg-odn是对人类的各种治疗应用进行研究探讨，并且用于小鼠的活化免疫反应及提升抗原特异性抗体生成的用剂(agent)，但在家畜上则比较没有效用(6-11)。本发明的结果也表示从个别物种标靶tlr9以优化用于那个物种的 cpg-odn是可能的，且当开发用于不同物种的cpg-odn时，cpg基序及长度两者都是应考虑的重要因素。
[0114]
虽然本发明特定实施例的方法已经通过参考附图描述，然而所属领域中的普通技术人员在不脱离本发明阐述在权利要求中的范围及精神下可对其进行各种修改及变化。修改及变化应位于通过本发明的说明书所限制的范围内。