一种双歧杆菌V9对阴道上皮细胞粘附性及抑菌能力的应用的制作方法

一种双歧杆菌v9对阴道上皮细胞粘附性及抑菌能力的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种双歧杆菌对阴道上皮细胞粘附性及抑菌能力的应用。


背景技术：

[0002]
人类健康从根本上受到机体微生物生态系统的巨大影响，妇女生殖道的微生态系统特点是相对比例不同的细菌群落変化标志着健康状态変化。妇女生殖道是一个非常复杂的微生态系统，乳酸菌作为其中的优势微生物，对维持阴道微生态环境平衡发挥主要作用。当阴道中益生菌减少或消失时，就会造成其他病原微生物的迅速生长，从而导致细菌性阴道炎、真菌性阴道炎及性传播疾病发生。
[0003]
细菌性阴道炎是妇科生殖系统的主要感染性疾病，其发病率为10％～ 41％，目前主要采用抗生素疗法对其进行治疗，结果导致生殖系统的微生态环境失调，从而引起继发念珠菌性阴道病，从而导致治疗效果不佳、复发率高等问题。人体的健康状态与肠道菌群密切相关，研究将为开发治疗阴道炎症的新型微生态制剂意义深远。


技术实现要素：

[0004]
根据本发明的一个方面，提供了一种双歧杆菌v9对阴道上皮细胞粘附性及抑菌能力的应用。该双歧杆菌v9为本申请人自产菌粉，双歧杆菌v9 已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，分类命名：动物双歧杆菌bifidobacterium animalis，保藏号为cgmcc no.4473，保藏日期为2010.12.14，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物研究所，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心。
[0005]
双歧杆菌v9的抗菌机理涉及其产生的各种代谢产物，包括脂磷壁酸、肽聚糖、酸性物质、乳酸菌素、二氧化碳和过氧化氢等。其中脂磷壁酸、肽聚糖对上皮细胞具有粘附作用，酸性物质可以消耗大量细胞能量并影响细胞膜的稳定性；乳酸菌素可作用于细胞膜，造成膜内物质和能量的泄漏。
[0006]
本申请在细胞炎症因子il-1β、tnf-α、il-4的平均水平进行了检测，研究双歧杆菌v9在细胞炎症因子表达中的作用，研究双歧杆菌v9在阴道抑菌中的作用机制，为开发微生态制剂提供依据。
[0007]
本发明双歧杆菌v9具有活菌数高，粘附性强，有大量实验数据支持和临床试验证明，已做毒理性实验和安全性评价。且动物实验数据明显。较市售益生菌性价比高，更实惠，且治疗阴道炎效果明显。
[0008]
本研究通过与肠杆菌、葡萄球菌、白色念珠菌对阴道上皮细胞的粘附力作比较，结果显示，双歧杆菌v9显著高于肠杆菌、葡萄球菌、白色念珠菌的粘附力；双歧杆菌v9能较强地抑制肠杆菌、葡萄球菌、白色念珠菌对阴道上皮细胞的粘附。双歧杆菌v9粘附形成的空间占位是防止其他菌对阴道组织附着的一个重要的保护性机制。
[0009]
人造大鼠阴道炎模型，通过甲硝唑作为对照，利用双歧杆菌v9干预治疗后，结果显示，双歧杆菌v9组的转阴率为70％，对大鼠混合菌阴道炎的治愈率为62.1，子宫的炎症反应得到了明显的改善，降低了组织充血和水肿现象。双歧杆菌v9降低了大鼠血清中炎症因子il-1β、tnf-α的表达，且提高了抗炎因子il-4的表达。表明双歧杆菌v9对大鼠阴道炎康复有积极作用。
附图说明
[0010]
图1为本发明双歧杆菌v9对阴道上皮细胞的粘附图；
[0011]
图2为大鼠子宫及切片；
[0012]
图3为大鼠血清中细胞炎症因子il-4表达；
[0013]
图4为大鼠血清中细胞炎症因子il-1β表达；
[0014]
图5为大鼠血清中细胞炎症因子tnf-α表达。
具体实施方式
[0015]
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
[0016]
实验1双歧杆菌v9对阴道上皮细胞的粘附
[0017]
阴道上皮细胞：
[0018]
取自17位健康妇女阴道，对象为19～40岁，妇科体检正常，3天内无性生活史。刮取的粘膜上皮细胞立即悬浮于10ml rpmi-1640中，旋涡混合器震荡洗涤细胞3次，g:玻璃滤器抽滤除去内源性细菌。革兰氏染色，镜检确定内源性细菌是否全部去除。血球计数板计数，调整细胞浓度为1x 105/ml。
[0019]
细菌：
[0020]
双歧杆菌v9菌株由内蒙古普泽生物制品有限责任公司分离、保存；肠杆菌、葡萄球菌、白色念珠菌均自阴道炎患者阴道分离。将细菌分别接种于lbs、emb.sp、sb固体培养基，37℃，18h培养；粘附分析前刮取菌苔， rpmi
--
1640洗涤细菌3次(2000rpm*10min),调整细菌浓度为1x 108/m1。
[0021]
粘附分析：
[0022]
取阴道上皮细胞悬液及菌悬液各1ml混合，37℃,2h温育后用rpmi
--ꢀ
1640洗涤细胞3次，g:玻璃滤器抽滤除去未粘附细菌。涂片、室温干燥、甲醇固定10min、革兰氏染色、镜下观察。
[0023]
1.4双歧杆菌v9对肠杆菌、葡萄球菌、白色念珠菌粘附能力的影响
[0024]
将双歧杆菌v9菌悬液1m1与阴道上皮细胞悬液1m1混合，37℃， 30min温育后离心(1500rpmx 5min)，弃上清1ml,再分别加入肠杆菌、葡萄球菌、白色念珠菌液各1ml，混匀，37c，2h温育。ph4.5。
[0025]
实验2动物实验阴道炎模型建立及治疗
[0026]
大鼠阴道炎模型的建立：
[0027]
实验分组为阴性对照组、模型组、甲硝唑治疗、双歧杆菌v9组，每组 20只；
[0028]
抗生素处理，将医用吸收性明胶海绵剪成0.5cmx0.5cm大小，吸取50 μl浓度为100mg/ml的抗生素；待明胶充分吸收抗生素饱和后,戴防咬手套，左手抓大鼠背部皮肤并固
定头部，右手持大鼠鼠尾，将其倒立；另一人夹含抗生素的明胶海绵，塞至阴道及宫腔内；抗生素处理6次，连续处理三天恢复一次；
[0029]
抗生素处理后将乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠按1:1:2 比例，配制成浓度为3x1010cfu/ml的混合细菌溶液；将医用吸收性明胶海绵剪成0.5cmx0.5cm大小，吸取50μl使明胶海绵充分吸收；待明胶充分吸收混合细菌溶液饱和后，戴防咬手套，左手抓大鼠背部皮肤并固定头部，右手持大鼠鼠尾，将其倒立；另一人夹含混合细菌溶液的明胶海绵，塞至阴道及宫腔内，保持鼠倒立1-2min；空白组为pbs处理；造模处理7次，造模处理三天后停药一天，造模后停药一天。
[0030]
大鼠阴道炎模型的治疗：
[0031]
造模成功后进行7次给药治疗。甲硝唑治疗组给药剂量，根据所购买甲硝唑药品说明以及经过等效剂量换算后得出，大鼠给药剂量16.2mg/200g；将81mg甲硝唑溶于250μl无菌pbs中配制0.32g/ml浓度溶液，使每只大鼠给药剂量为16.2mg/200g。将医用吸收性明胶海绵剪成0.5cmx0.5cm大小，吸取50μl药物使明胶海绵充分吸收药物后，放入大鼠阴道内；经过冻干粉活菌数评价后,称取菌粉0.3g,用无菌pbs配制1x1011cfu/ml的混合菌液；将医用吸收性明胶海绵剪成0.5cmx0.5cm大小，吸取50μl菌液，使明胶海绵充分吸收菌液后，放入大鼠阴道内，每只实验大鼠5x109cfu；
[0032]
颈椎脱臼处死实验大鼠。解剖取大鼠取子宫组织，部分放置于4％多聚甲醛溶液保存，部分做elisa、he染色检测，部分直接放置-80冰箱保存备用。
[0033]
实验3动物实验阴道炎模型治疗后各项指标检测
[0034]
(1)混合细菌感染的转阴率
[0035]
停药后第1d、2d、5d取大鼠阴道分泌物进行鉴定，3次鉴定大鼠阴道灌洗液中无菌丝生成及菌落计数≤10定为转阴。
[0036]
(2)阴道病变炎症程度及治愈率
[0037]
于停药第7天处死大鼠解剖,取阴道标本进行病理组织学检查。阴道标本按充血、水肿、出血、浸润4项基本指标进行评分，每项指标炎症评分值的总和为炎症总分值，以模型组的分值为炎症程度100％，给药组与模型组比较,可得出给药组的炎症程度，100％减去药物组的炎症程度即为对阴道炎的治愈程度(100％-药物组炎症程度％)。
[0038]
表1大鼠阴道粘膜炎性刺激评分标准
[0039][0040]
(3)大鼠子宫组织he染色
[0041]
脱水：将已经固定好的子宫取出，用pbs充分冲洗，然后乙醇脱水，分别用70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇，95％乙醇，95％乙醇脱水15min；然后用无水乙醇脱水两次，分别为60min；.
[0042]
包埋：二甲苯处理脱水后的组织30min，石蜡进行包埋；
[0043]
切片和封片：轮转机切出平整平面，设置切面厚度为55μm，小心挑起切好的蜡片，放置于水温为45℃的展片机水槽中，将有褶皱的蜡片展评；将蜡片置于载玻片上，放置在60℃烤片机上，烘烤4h。
[0044]
脱蜡：分别用二甲苯(i)、(ii)脱蜡15min，然后用二甲苯:无水乙醇1:1 溶液处理5min,分别用浓度递减的乙醇溶液，100％乙醇，95％乙醇，80％乙醇，70％乙醇处理5min。
[0045]
染色：harris苏木素染色5min，分别用浓度递减的乙醇溶液，70％乙醇 5，80％乙醇，95％乙醇，100％乙醇处理5min；0.5％伊红染色1min；依次用100％乙醇(i)、100％乙醇(ii)处理5min；分别加入二甲苯(i)、二甲苯(ii)中透明 10min；中性树胶封片；
[0046]
观察：将封片置于光学显微镜下，分别在200倍与400倍镜下分别拍照观察，并作病理生理学分析。
[0047]
(4)细胞炎症因子il-1β、tnf-α、il-4测定
[0048]
心脏穿刺采全血约3ml处死大鼠，用对应组别的采血管收集血样，在室温下静置1h后，使血液凝固，析出血清，用移液枪移取上层血清，将血清吸至新的离心管中，将含有血清的离心管置于4℃、3000rmp的高速离心机中，离心15min，立即放入-80℃的冰箱中冷冻，备用。严格按照elisa 试剂盒的操作说明书进行操作，检测各组大鼠血清中细胞炎症因子il-1β、 tnf-α、il-4的平均水平。
[0049]
实验4结果与分析
[0050]
(1)双歧杆菌v9对阴道上皮细胞的粘附，如图1所示，双歧杆菌v9 活菌数高，粘附性强。
[0051]
(2)细菌对阴道上皮细胞的粘附能力
[0052]
由表2可见，ph4.5条件下，双歧杆菌v9对阴道上皮细胞的粘附能力明显高于肠杆菌、葡萄球菌、白色念珠菌。
[0053]
表2阴道上皮细胞粘附细菌数
[0054][0055]
(3)混合菌感染的转阴率
[0056]
由表3得:空白对照组动物阴道分泌液镜检均为阴性，与模型对照组比较，差异有统计学意义(p＜0.01),表明混合细菌性阴道炎大鼠模型造模成功，双歧杆菌v9的转阴率为70％，与模型组相比差异性显著，表明双歧杆菌v9对阴道炎大鼠有积极作用。
[0057]
表3混合菌感染的转阴率
[0058][0059][0060]
(4)阴道病变炎症程度及治愈率
[0061]
由表4得:双歧杆菌v9剂量组和甲硝唑组对大鼠混合菌阴道炎的治愈率为62.1、93.1,与模型对照组比较，差异有显著性(p＜0.05)。
[0062]
表4阴道病变炎症程度及治愈率
[0063][0064]
(5)大鼠子宫组织he染色
[0065]
如图2所示，各组大鼠子宫形态，空白组:大鼠子宫形态结构、大小正常，浆膜没有充血及水肿现象；模型组:大鼠子宫浆膜充血严重，子宫壁变薄，管腔.内可见清亮的液体并且多数宫腔迂曲肿胀；甲硝唑组:大鼠子宫炎性充血基本消失，无水肿现象；双歧杆菌v9:子宫腔萎缩变形。
[0066]
如图2所示，空白组大鼠子宫组织he染色显示，恢复期子宫内膜杯状细胞形态结构完整，排列整齐，细胞核居于阴道黏膜杯状细胞里侧，无子宫充血、水肿及淋巴细胞浸润现象；恢复期模型组子宫组织充血严重并伴有炎性细胞浸润现象，阴道黏膜上皮细胞完整性遭到破坏；甲硝唑组子宫壁绒毛膜完整杯状细胞排列整齐，组织充血和水肿完全消失，大鼠子宫的炎症反应得到了明显的改善。双歧杆菌v9组恢复期后仍然有阴道黏膜上皮细胞脱落的现象，且杯状细胞排列不整齐。
[0067]
(6)细胞炎症因子il-1β、tnf-α、il-4表达
[0068]
如图3～5，阴道炎模型组大鼠血清中il-4的含量显著低于空白组(p＜ 0.01)，其中甲硝唑组和双歧杆菌v9组血清中il-4的含量与模型组含量相比均有显著性差异(p＜0.05)；甲硝唑组大鼠血清中il-4的含量略高于双歧杆菌v9组。造模降低模型组大鼠血清中il-4的含量，而通过甲硝唑和双歧杆菌v9治疗后，有效的提高了大鼠血清中抗炎因子il-4的含量。阴道炎模型组大鼠血清中il-1β的含量极其显著高于空白组，其中甲硝唑组和双歧杆菌 v9组血清中il-1β的含量与模型组含量相比均有显著性差异；甲硝唑组大鼠血清中il-1β的含量略低于双歧杆菌v9组。造模升高了模型组大鼠血清中il-1β的含量，而通过甲硝唑和双歧杆菌v9治疗后，有效的降低了大鼠血清中炎性因子il-1β的含量。阴道炎模型组
大鼠血清中tnf-α的含量极其显著高于空白组，其中甲硝唑组和双歧杆菌v9组血清中tnf-α的含量与模型组含量相比均有显著性差异；甲硝唑组大鼠血清中tnf-α的含量略低于双歧杆菌v9 组。造模升高了模型组大鼠血清中tnf-α的含量，而通过甲硝唑和双歧杆菌 v9治疗后，有效的降低了大鼠血清中炎性因子tnf-α的含量。
[0069]
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。