石斛提取物在制备调节胆固醇代谢药物中的应用的制作方法

本发明涉及制药技术领域，尤其涉及石斛提取物在制备调节胆固醇代谢药物中的应用。

背景技术：

胆固醇属于一种固醇类化合物，是机体代谢所不可缺少的，尤其在细胞膜的组成及激素的合成中发挥重要作用。胆固醇主要来自机体自身的合成，部分来自于食物。人体可以在肝脏中合成胆固醇，也可以通过饮食摄食外源性胆固醇。在冠心病和动脉粥样硬化症中，粥样斑块是由胆固醇等脂质沉积而成。在机体内，胆固醇与蛋白质结合，主要以脂蛋白的形式存在，主要以高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)和低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)两种形式在体内进行转运。其中，高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)被称为好胆固醇，这是由于现有研究表明，血清中hdl-c水平升高具有清洁动脉粥样硬化的功效，对心血管具有保护作用。与之相反，若血液中ldl-c水平升高，则易造成动脉粥样硬化，对心血管造成危害，导致冠心病以及其他一系列并发症的发病率增加，因此，相对于hdl-c，ldl-c被称为坏胆固醇。

近年来，已有众多研究侧重于通过饮食调控改善机体胆固醇水平，从而有效预防由胆固醇升高引起的一系列并发症。目前，已研究发现，植物性成分具有调控体脂水平，降低机体血浆及肝脏胆固醇水平的作用效果，并指出与动物性蛋白相比，植物性蛋白具有显著地降低调节实验动物的血清和肝脏中胆固醇水平的功效。

石斛是常用名贵中药材，性味甘淡微咸，寒，归胃、肾，肺经。始载《神农本草经》，品种众多，其中霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛和马鞭石斛是石斛中的上品。又名林兰(《神农本草经》)、千年润(《本草纲目》)等，其具有较高的观赏价值和药用功能，在李时珍《本草纲目》中记载，石斛有″补五脏、劳贏瘦、滋阴益精、久服厚肠胃、平胃气、长肌肉、定志除惊、轻身延年″等功效。根据我们的文献调研，尚未发现石斛或者石斛提取物可以应用于肥胖疾病的治疗。根据我们的文献调研，尚未发现石斛或者石斛提取物具有调节胆固醇代谢作用的应用和报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种石斛提取物在制备调节胆固醇代谢药物中的应用，是石斛提取物的一种新用途。目前没有任何报道表明石斛提取物可以用于胆固醇代谢的调节。

石斛提取物在制备调节胆固醇代谢药物中的应用，所述石斛提取物由石斛药材经提取得到，所述石斛提取物为石斛水提取物或石斛醇提取物。

进一步的，所述石斛为霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛、流苏石斛和鼓槌石斛中的一种或者两种以上的组合。

进一步的，所述石斛水提取物包括干石斛水提取物和鲜石斛水提取物。

进一步的，所述干石斛水提取物的制备步骤为：将石斛干粉用18-20倍重量份的蒸馏水于55-65℃水浴中进行提取，过滤并收集滤液，重复提取，合并提取液，然后减压浓缩至原总体积的1/6-1/8后，冷冻干燥至恒重。

进一步的，所述鲜石斛水提取物的制备步骤为：将新鲜石斛去根、叶后保留茎部，粉碎后，加入5-8倍重量份的蒸馏水浸没，于75-85℃水浴中进行提取，过滤并收集滤液，重复提取，合并提取液，然后减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，冷冻干燥至恒重。

进一步的，所述石斛醇提取物的制备步骤为：将石斛干粉用18-20倍重量份的75％乙醇于55-60℃下进行提取，重复提取，合并提取液，然后减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，冷冻干燥至恒重。

进一步的，所述石斛提取物可制成一切药学可接受口服和非口服制剂形式，例如可以为颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、膏剂、口服液剂中的一种。

本发明的有益效果是：

本发明制备的石斛提取物可以增加huh7细胞中动脉粥样硬化清道夫受体b类i型、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型、低密度脂蛋白受体及卵磷脂胆固醇脂酰转移酶的基因表达，从而可以得到石斛提取物可以作为药物应用于调节胆固醇代谢。

附图说明

图1为干石斛水提取物提高huh7细胞中动脉粥样硬化清道夫受体b类i型、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型、低密度脂蛋白受体及卵磷脂胆固醇脂酰转移酶的基因表达；其中，数据以means±sd表示，sr-bi：动脉粥样硬化清道夫受体b类i型，＊p＜0.05；pcsk9：前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型，＊＊p＜0.01；ldlr：低密度脂蛋白受体，＊＊＊p＜0.05；lcat：卵磷脂胆固醇脂酰转移酶；给药组vs对照组；dwe：drydendrobiumwaterextraction干石斛水提取物；fold：倍数。

图2为鲜石斛水提取物提高huh7细胞中动脉粥样硬化清道夫受体b类i型、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型、低密度脂蛋白受体及卵磷脂胆固醇脂酰转移酶的基因表达；其中，数据以means±sd表示，sr-bi：动脉粥样硬化清道夫受体b类i型，＊＊p＜0.01；pcsk9：前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型，＊p＜0.05；ldlr：低密度脂蛋白受体，＊＊＊p＜0.05；lcat：卵磷脂胆固醇脂酰转移酶，##p＜0.01；给药组vs对照组；fwe：reshdendrobiumwaterextraction鲜石斛水提取物；fold：倍数。

图3为石斛醇提取物提高huh7细胞中动脉粥样硬化清道夫受体b类i型、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型、低密度脂蛋白受体及卵磷脂胆固醇脂酰转移酶的基因表达；其中，数据以means±sd表示，sr-bi：动脉粥样硬化清道夫受体b类i型，＊＊＊p＜0.05；pcsk9：前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型，＊＊p＜0.01；ldlr：低密度脂蛋白受体，＊＊＊p＜0.05；lcat：卵磷脂胆固醇脂酰转移酶，＊＊＊p＜0.05；给药组vs对照组；dee：drydendrobiumethanolextraction石斛醇提取物；fold：倍数。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

作为胆固醇代谢的重要器官，肝脏中胆固醇相关的代谢基因mrna的表达水平对机体胆固醇水平起着关键作用。本发明通过对以下胆固醇代谢相关基因的表达式水平进行检测，来研究石斛提取物作为药物对调节胆固醇代谢的影响。

高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein，hdl)具有将胆固醇逆转运回肝脏的作用。这一过程中，卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(lecithin-cholesterolacyltransferase，lcat)对hdl的合成及胆固醇的逆转运发挥至关重要作用，lcat是由肝脏合成释放进入血液循环的，是一种在血浆中发挥其催化作用的酶，lcat的作用是将hdl的卵磷脂的c2位不饱和脂肪酸转移给游离胆固醇，生成溶血卵磷脂和胆固醇酯，血浆胆固醇几乎70％-80％是胆固醇酯，均是lcat催化生成所致。

低密度脂蛋白受体(lowdensitylipoproteinreceptor，ldlr)作为低密度脂蛋白受体家族中的主要成员之一，能够与低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，ldl)结合，对体内胆固醇的代谢起到重要的作用。ldlr几乎在所有的细胞中都有表达，但以肝脏中的数量最多。ldl与细胞膜表面的ldlr结合，被吞入细胞，ldlb被溶酶体酶水解释放出游离胆固醇和脂肪酸供细胞利用。胆固醇可以通过一个负反馈调控机制来调控ldlr的转录，当细胞内胆固醇水平升高时，ldlr的转录就下降；当细胞内胆固醇被消耗时，ldlr的转录就被激活。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型(pcsk9)，也称神经细胞凋亡调节转化酶(neuralapoptosis-regulatedconvertase1，narc-1))，其抑制剂已获监管机构批准，用于治疗ldl-c下降不充分的患者。pcsk9是由pcsk9基因编码的丝氨酸蛋白酶，主要由肝脏产生，pcsk9与肝细胞表面的ldl受体(ldl-r)结合，能够使ldl-r降解，血液中ldl-c水平升高。pcsk9的抗体能干扰其与ldl-r的结合，使肝脏表达更多的ldl-r，降低血液ldl-c水平。动脉粥样硬化清道夫受体b类i型(scavengerreceptorclasstypei，sr-bi)对高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein，hdl)介导的胆固醇和胆固醇酯的摄取起着重要的调节作用，它可促进″胆固醇的逆向转运″，清除血及组织中过多的胆固醇，保护血管，防止动脉粥样硬化的形成或改善已形成的动脉粥样硬化。srb1是公认的hdl的受体，是介导胆固醇逆转运的关键受体，能够引起胆固醇的双向转运。一方面，sr-bi可以介导外周细胞内过剩的游离胆固醇流出，防止游离胆固醇过多堆积造成动脉粥样硬化；另一方面，sr-bi可以与hdl结合，促进肝细胞摄取hdl中的胆固醇，使过剩的胆固醇回到肝脏进一步代谢。

由于现有药用石斛的种类很多，这里本发明实施例以霍山石斛为例，研究石斛提取物作为药物应用于调节胆固醇治疗的效果。但本发明中的石斛并不仅限于霍山石斛，也可以是其他同属的药用石斛，例如铁皮石斛、金钗石斛、流苏石斛或者鼓槌石斛等。

霍山石斛，原产于我国安徽霍山等地，是国家现代中药重大专项200多个濒危稀缺品种中首位保护品种，是药用石斛中的极品，也是霍山县独有的、拥有原产地地理标志的名贵中药材，历史上被誉为″中华九大仙草之首″、″健康软黄金″，《神农本草》、《本草纲目》均有记载。霍山石斛所含有的多糖能大幅度提高人体内sod(延缓衰老的主要物质)，在增强免疫力、抗疲劳、延缓衰老和促进癌细胞凋亡等方面有明显作用，从而达到保健益寿的功效。

实施例1

分别制备干石斛水提取物、鲜石斛水提取物以及石斛醇提取物，具体如下：

(1)干石斛水提取物的制备：称取20g霍山石斛干粉，用400ml蒸馏水在55℃水浴中进行提取，过滤并收集滤液，重复提取3次，每次提取1h，合并3次提取液。将合并后的提取液在55℃下减压浓缩至原液体体积的1/6-1/8后，进行冷冻干燥至恒重，得到质量体积浓度为100mg/ml的干石斛水提取物。

(2)鲜石斛水提取物的制备：称取100g新鲜采摘的霍山石斛，去根、叶后保留茎部，粉碎后，加入500ml蒸馏水浸没霍山石斛药材，在80℃水浴中进行提取，过滤并收集滤液，重复提取3次，每次1h，合并3次提取液。将合并后的提取液在55℃下减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，进行冷冻干燥至恒重，得到质量体积浓度为100mg/ml的鲜石斛水提取物。

(3)石斛醇提取物的制备：称取20g霍山石斛干粉，用400ml的75％乙醇于55℃下进行提取，提取2次，每次提取24h，合并2次提取液，将合并后的提取液减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，进行冷冻干燥至恒重，得到质量体积浓度为100mg/ml的石斛醇提取物。

将上述实施例1中制备质量浓度为100mg/ml的干石斛水提取物、鲜石斛水提取物以及石斛醇提取物，在试验前均用0.22μm的滤膜过滤除菌，然后稀释，制备成一系列质量浓度依次为10μg/ml，100μg/ml，1000μg/ml的干石斛水提取物、鲜石斛水提取物以及石斛醇提取物，以作为药物，备用。

(i)检测石斛提取物对体外huh7细胞中胆固醇代谢相关基因mrna的表达分组：huh7细胞复苏后，用含10％fbs的dmem(高糖)培养液转入培养皿中，在37℃、5％co2条件下培养，细胞同步化12h，随机分成2大组，即：①空白对照组：不给药(0μg/ml)；②给药组：(1)干石斛水提取物高剂量组(dwe：1000μg/ml)、干石斛水提取物中剂量组(dwe：100μg/ml)、干石斛水提取物低剂量组(dwe：10μg/ml)；(2)鲜石斛水提取物高剂量组(fwe：1000μg/ml)、鲜石斛水提取物中剂量组(fwe：100μg/ml)、鲜石斛水提取物低剂量组(fwe：10μg/ml)；(3)石斛醇提取物中剂量组(dee：100μg/ml)、石斛醇提取物低剂量组(dee：10μg/ml)，给药作用12h后，荧光定量pcr：使用rnaisoplus提取huh7细胞的总rna，通过oligodt18将1μg总rna逆转录为cdna，通过定量pcr技术，使用toyobo公司thunderbirdsybrqpcrmix试剂按照说明书对引物进行pcr扩增。每组样品3个复孔，以保证实验数据的有效性。使用gapdh为内参，检测目的基因卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(lcat)、清道夫受体b类i型(sr-b1)、低密度脂蛋白受体(ldlr)以及前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(pcsk9)分别相对于内参基因(gapdh)的表达变化来定量。采用graphpad7分析数据(即实验组目的基因相对于空白对照组的表达量的变化倍数)。所用引物为：lcat(hlcat-f：acggggccctactgtaataa；hlcat-r：agatgcagcactggaaggag)、sr-b1(hsrbi-f：ctgtgggtgagatcatgtgg；hsrbi-r：gctcagctgcagtttcacag)、ldlr(hldlr-f-2：aggagacgtgcttgtctgtc；hldlr-r-2：ctgagccgttgtcgcagt)以及pcsk9(hpcsk9-f：agttgccccatgtcgactac；hpcsk9-r：gagatacacctccaccaggc)。结合附图1的实验结果可知，由本发明制备的干石斛水提取物相对空白对照组(给药浓度为0μg/ml)，高剂量石斛水提取物的给药能够增加清道夫受体b类i型(sr-b1)以及低密度脂蛋白受体(ldlr)的mrna表达水平，低剂量石斛水提取物的给药能够增加清道夫受体b类i型(sr-b1)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(pcsk9)、低密度脂蛋白受体(ldlr)以及卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(lcat)的mrna表达水平，由此可知，干石斛水提取物作为药物具有能够明显调节胆固醇代谢的作用。结合附图2的实验结果可知，本发明制备的鲜霍山石斛水提取物相对空白对照组(给药浓度为0μg/ml)，低剂量鲜石斛水提取物的的给药和中剂量鲜石斛水提取物的给药均能够明显增加sr-b1、pcsk9、ldlr以及lcat的mrna表达水平，高剂量鲜石斛水提取物的给药能够增加sr-b1以及ldlr的mrna表达水平，即鲜石斛水提取物作为药物具有能够明显调节胆固醇代谢的作用。

结合附图3的实验结果可知，本发明制备的石斛醇提取物相对空白对照组(给药浓度为0μg/ml)，低剂量石斛醇提取物的的给药和中剂量石斛醇提取物的给药均能够明显增加sr-b1、pcsk9、ldlr以及lcat的mrna表达水平，即石斛醇提取物作为药物具有能够明显调节胆固醇代谢的作用。

综上所述，本发明提供的石斛提取物可以有效调节肝脏中胆固醇代谢。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。