人参黄连有效组分速崩片及其有效成分比例筛选方法与流程

[0001]
本发明属于中药学研究技术领域，特别是涉及到人参黄连有效组分速崩片及其有效成分比例筛选方法。


背景技术：

[0002]
人参为五加科植物人参(panax ginseng c.a.mey.)的干燥根和根茎，是我国的传统名贵中药。其性微温，味甘、微苦，入脾、肺、心经。可大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智。久服轻身延年。
[0003]
人参中含有多种化学成分，现代药理研究表明人参具有调节免疫力、改善微循环、调节血糖、抑制血小板聚集、提高组织抗缺氧能力等作用。其中人参皂苷在治疗和改善糖尿病及其并发症方面具有显著效果。
[0004]
黄连为毛莨科植物黄连(coptis chinensis franch.)、三角叶黄连(coptis dletoidea c.y.chenget et hsiao)或云连(coptis.teeta wall.)的干燥根茎。性寒、味苦，入心、脾、胃、肝经，可清热燥湿，泻火解毒
[22]
。现代药理学研究证明黄连具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗原虫、抗炎、抗癌、抗心律失常、保护胃黏膜、正性肌力及降压与降糖的作用。
[0005]
临床研究和动物实验显示,黄连中的生物碱类对于治疗和改善糖尿病及其并发症均有显著的效果。目前，黄连已经分离出来的生物碱主要有小檗碱(berberine)，又称黄连素、巴马汀(palmatine)、药根碱(jatrorrhizine)、表小檗碱(epiberberine)、黄连碱(coptisine)等。其中小檗碱的含量最高，而且其降糖作用也最好。


技术实现要素：

[0006]
本发明所要解决的技术问题是：提供人参黄连有效组分速崩片及其有效成分比例筛选方法，对人参黄连有效组分速崩片中人参皂苷含量和黄连总生物碱的质量标准含量进行分析，为获得最佳治疗效果的组分提供依据。
[0007]
人参黄连有效组分速崩片，其特征是：每片按照质量份数包括黄连总碱12％～20％、人参总皂苷3％～5％、甘露醇32％～37％以及微晶纤维素32％～37％，且人参总皂苷：黄连总生物碱配比为1:4。
[0008]
每片人参黄连有效组分速崩片的制备方法为，取黄连总碱12％～20％、人参总皂苷3％～5％、甘露醇32％～37％以及微晶纤维素32％～37％混合，共过80目筛，以70％乙醇作为粘合剂制成软材，过16目筛制粒后放入60℃烘箱内干燥30分钟；采用20目筛及100目筛整粒，取20目～100目之间的颗粒加入10％～20％低羟丙基纤维素及1％硬脂酸镁混合均匀后用压片机压片。
[0009]
人参黄连有效组分速崩片有效成分比例筛选方法，其特征是：人参黄连有效组分速崩片的比例筛选包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，
[0010]
步骤一、人肾小球系膜hmc细胞的复苏、传代及培养
[0011]
由液氮罐中取出冻存hmc细胞，放入37℃水浴锅中融化，在1000rpm/min条件下离
心5min，弃去上清，加入1ml含10％胎牛血清fbs的dmem低糖培养液重悬细胞，转入培养瓶，加入培养液，混匀后放入37℃，5％co2培养箱中培养；
[0012]
显微镜下观察细胞生长至90％左右融合时，进行传代，弃去培养液，用pbs洗涤细胞2次～3次，弃去pbs，加入0.25％胰蛋白酶-edta消化液，37℃下消化3min；加入含10％fbs的培养液终止消化，将消化后细胞吹匀打散；用滴管取5滴～10滴细胞置新培养瓶中，加入200ml～500ml含10％fbs的dmem低糖培养液，混匀后放入37℃，5％co2培养箱中培养；
[0013]
步骤二、人参总皂苷对hmc细胞高糖状态下增殖的影响
[0014]
取对数生长期的hmc细胞，以5000个/孔的密度接种于96孔板中，5％co2、37℃条件下培养24h后给药，分为7组，每组设6个复孔，包括高糖组，高糖人参总皂苷25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml；培养48h后，取出培养板，每孔加入50μl预冷的三氯醋酸tca固定，终浓度为10％，静置5min，然后转入4℃冰箱中静置1h，取出并用去离子水清洗3遍，空气中干燥；待培养板干燥完全后，每孔加入100μl由1％乙酸配制的0.4％的srb染液，室温下染色20min，弃去srb染液，用1％乙酸溶液冲洗5遍，去除未结合的染料，空气中干燥；干燥后的培养板每孔加入150μll10mmol/l的tris-hc缓冲液，在水平振荡器上振荡5min，而后置于微孔扫描仪，测定570nm波长下各孔的光密度od值，计算细胞的存活率；
[0015]
步骤三、黄连总生物碱对hmc细胞高糖状态下增殖的影响
[0016]
取对数生长期的hmc细胞，以5000个/孔的密度接种于96孔板中，5％co2、37℃培养24h后给药，分为9组，包括高糖组，每组设6个复孔，高糖黄连总生物碱0.25μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，8μg/ml，16μg/ml，32μg/ml；培养48h后，取出培养板，每孔加入50μl预冷的三氯醋酸tca固定，终浓度为10％，静置5min，然后转入4℃冰箱中静置1h，取出并用去离子水清洗3遍，空气中干燥；待培养板干燥完全后，每孔加入100μl由1％乙酸配制的0.4％的srb染液，室温下染色20min；弃去srb染液，用1％乙酸溶液冲洗5遍，去除未结合的染料，空气中干燥；干燥后的培养板每孔加入150μll10mmol/l的tris-hc缓冲液，在水平振荡器上振荡5min，而后置于微孔扫描仪，测定570nm波长下各孔的光密度od值，计算细胞的存活率；
[0017]
步骤四、人参总皂苷和黄连总生物碱不同配比对hmc细胞高糖状态下增殖的影响
[0018]
取对数生长期的hmc细胞，以5000个/孔的密度接种于96孔板中，5％co2、37℃培养24h后给药，分为7组，每组设6个复孔，包括高糖组，高糖人参总皂苷：黄连总生物碱的比例分别为(50:0.5)μg/ml组，(50:1)μg/ml组，(50:2)μg/ml组，(100:0.5)μg/ml组，(100:1)μg/ml组，(100:2)μg/ml组；培养48h后，取出培养板，每孔加入50μl预冷的三氯醋酸tca固定，终浓度为10％，静置5min，然后转入4℃冰箱中静置1h，取出并用去离子水清洗3遍，空气中干燥；待培养板干燥完全后，每孔加入100μl由1％乙酸配制的0.4％的srb染液，室温下染色20min；弃去srb染液，用1％乙酸溶液冲洗5遍，去除未结合的染料，空气中干燥；干燥后的培养板每孔加入150μll10mmol/l的tris-hc缓冲液，在水平振荡器上振荡5min，而后置于微孔扫描仪，测定570nm波长下各孔的光密度od值，计算细胞的存活率；
[0019]
步骤五、结果研究
[0020]
根据步骤二～步骤四获得的光密度od值，通过公式
[0021]
细胞存活率％＝(加药细胞od值-本底od值)/(对照细胞od值-本底od值)
×
100％，计算各组试验细胞存活率，筛选出人参总皂苷和黄连总生物碱比例值在(100:1)μg/ml时为
最佳给药配比。
[0022]
所述步骤一中的培养液为dmem低糖培养基、10％fbs胎牛血清以及p/s(pb180120)培养基。
[0023]
通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：人参黄连有效组分速崩片及其有效成分比例筛选方法，对人参黄连有效组分速崩片中人参皂苷含量和黄连总生物碱的质量标准含量进行分析，为获得最佳治疗效果的组分提供依据。
具体实施方式
[0024]
实施例1
[0025]
每片人参黄连有效组分速崩片的制备方法为，取黄连总碱12％、人参总皂苷3％、甘露醇37％以及微晶纤维素37％混合，共过80目筛，以70％乙醇作为粘合剂制成软材，过16目筛制粒后放入60℃烘箱内干燥30分钟；采用20目筛及100目筛整粒，取20目～100目之间的颗粒加入10％低羟丙基纤维素及1％硬脂酸镁混合均匀后用压片机压片。
[0026]
实施例2
[0027]
每片人参黄连有效组分速崩片的制备方法为，取黄连总碱20％、人参总皂苷5％、甘露醇32％以及微晶纤维素32％混合，共过80目筛，以70％乙醇作为粘合剂制成软材，过16目筛制粒后放入60℃烘箱内干燥30分钟；采用20目筛及100目筛整粒，取20目～100目之间的颗粒加入10％低羟丙基纤维素及1％硬脂酸镁混合均匀后用压片机压片。
[0028]
实施例3
[0029]
每片人参黄连有效组分速崩片的制备方法为，取黄连总碱16％、人参总皂苷4％、甘露醇35％以及微晶纤维素35％混合，共过80目筛，以70％乙醇作为粘合剂制成软材，过16目筛制粒后放入60℃烘箱内干燥30分钟；采用20目筛及100目筛整粒，取20目～100目之间的颗粒加入9％低羟丙基纤维素及1％硬脂酸镁混合均匀后用压片机压片。
[0030]
实施例4
[0031]
上述人参黄连有效组分速崩片质量配比的控制通过以下方法实现，首先对人参进行定性鉴别，
[0032]
取人参黄连有效组分速崩片10片，研细，精密称取1g，加甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液至水浴锅蒸干，残渣加10ml水使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次30ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。分别取人参皂苷re、rgl、rb1对照品，加甲醇lml制成每lml各含2mg的溶液作为对照品溶液。另取人参对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述溶液5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水的比例为15：40：22：10，10℃以下放置的下层溶液为展开剂展开，取出晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品与对照品、对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。
[0033]
对黄连进行定性鉴别，
[0034]
取人参黄连有效组分速崩片10片，研细，精密称取1g，加无水乙醇10ml，超声处理30分钟，滤过，作为供试品溶液。另取黄连总碱0.06g,处理方法同供试品溶液。取盐酸小檗碱对照品加无水乙醇制成1
㎎
/ml的溶液。取黄连对照药材0.6g，加10ml无水乙醇，超声处理
30分钟，放冷，滤过，滤液作为对照药材溶液。阴性供试品同样品供试品溶液制备方法。照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液及黄连总碱液，阴性溶液各5μl，对照药材溶液1μl，对照品2μl分别点于同一硅胶g薄层板上，以正丁醇-水-冰醋酸的比例为7:2:1为展开剂，预平衡30分钟展开后取出，晾干，置365nm紫外灯下检视，样品色谱与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
[0035]
一、人参黄连有效组分速崩片人参皂苷的含量的质量标准研究控制依据，采用色谱法，色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱型号：agilent eclipse plus-c18 4.6
×
250mm十八烷基硅烷键合柱)；以柱温：30℃；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按下表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长203nm.流速为1.0ml/min。
[0036]
表1、流动相洗脱表
[0037][0038]
对照品溶液按照下表2制备，表中所示分别精密称取人参皂苷rg1、re、rb1、rd、s-rg3标准品，加入适量甲醇配成下表所示浓度的人参总皂苷混合标准品溶液。
[0039]
表2、人参皂苷混合标品统计表
[0040][0041]
供试品溶液的制备:取人参黄连有效组分速崩片10片，研磨，精密称取1g，加甲醇30ml超声30min，过滤，取续滤液，水浴蒸干，加30ml水使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次30ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次30ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇10ml使溶解，大孔吸附树脂上样，待样品液面与大孔树脂相水平后，100ml70％乙醇洗脱，续滤液蒸干，30ml甲醇溶解，作为供试品溶液。
[0042]
1、线性关系试验
[0043]
分别以进样量为2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl的混合标准品溶液注入液相色谱仪中，以质量(mg)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制人参皂苷rg1、re、rb1、rd、s-rg3的标
准曲线，分别绘制人参皂苷rg1、re、rb1、rd、s-rg3各标品的标准曲线得到各标准品成分的回归方程及线性范围为：
[0044]
rg1：y＝203.09x+13.234(1.08μg～6.48μg)；
[0045]
re：y＝135.76x+62.095(1.09μg～6.54μg)；
[0046]
rb1：y＝72.308x+5.6685(1.14μg～6.84μg)；
[0047]
rd：y＝162.28x+10.071(1.28μg～7.68μg)；
[0048]
s-rg3：y＝197.36x+19.989(1.06μg～6.36μg)。
[0049]
数据见表3，
[0050]
表3、线性关系试验
[0051][0052]
2、精密度试验
[0053]
精密吸取人参皂苷rg1、re、rb1、rd、s-rg3的混标对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积积分值，计算，考察精密度，结果如表4所示，表4、精密度试验实验结果
[0054]
[0055][0056]
精密度考察结果显示：对照品溶液连续测定人参皂苷rg1、re、rb1、rd、s-rg3的混标对照品的峰面积结果的rsd均小于2％，表明仪器、方法的精密度良好。
[0057]
3、稳定性试验
[0058]
精密吸取同一人参总皂苷供试品溶液5μl，按一定的时间分别注入液相色谱仪，以人参皂苷rg1、re、rb1、rd、s-rg3的峰面积测定结果为指标，测定其在24h内检测的稳定性，结果如表5所示，
[0059]
表5、稳定性试验结果
[0060][0061]
稳定性考察结果显示：在24小时内测定供试品溶液中人参皂苷rg1、re、rb1、rd、s-rg3的各标准品的峰面积的rsd均小于2％，表明人参皂苷rg1、re、rb1、rd、s-rg3五个基准物的稳定性良好，即24小时内测定结果可靠。
[0062]
4、重现性试验
[0063]
精密量取同一人参总皂苷供试品共5份，按供试品溶液项下制备方法制备，精密吸取5μl，计算样品含量，以考察本法的重现性，结果见表6。
[0064]
表6、重现性试验
[0065][0066]
以人参皂苷rg1、re、rb1、rd、s-rg3为含量测定指标，考察本法的重现性，结果rsd均小于2％，表明该方法重现性良好。
[0067]
5、加样回收率试验
[0068]
取已知含量的三批人参黄连有效组分速崩片10片，研磨后精密称取0.5g，分别精密加入人参皂苷rg1、re、rb1、rd、s-rg3混合标准品溶液适量，制备供试品溶液，每批样品平行进样3次，每组按照这五种人参皂苷的含量80％、100％、120％的比例分别加入一定量的各人参皂苷标准品溶液，测定并计算各成分的加样回收率及rsd值。人参皂苷rg1、re、rb1、rd、s-rg3的加样回收率分别为101.5％、100.03％、99.02％、101.5％、100.02％，rsd值分别为1.2％、1.02％、1.30％、0.86％、1.20％表明该方法的准确度良好，结果可信。
[0069]
6、样片含量测定
[0070]
根据外标公式计人参总皂苷rg1、re、rb1、rd、s-rg3的含量。
[0071][0072]
取人参黄连有效组分速崩片3个不同批次，每个批次检测3个平行样品，取平均值后暂定人参皂苷rg1的含量为2.92mg/片、人参皂苷的含量为re的含量为7.69mg/片、人参皂苷rb1的含量为1.06mg/片、人参皂苷rd的含量为4.42mg/片、人参皂苷s-rg3的含量为0.56mg/片。
[0073]
二、人参黄连有效组分速崩片黄连总生物碱含量的质量标准研究控制依据，
[0074]
采用色谱法，色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱型号：xcharge-c18 5μm 100a 4.6
×
250mm十八烷基硅烷键合柱)；柱温为30℃以乙腈为流动相a，以万分之一三氟乙酸水为流动相b，按下表7中的规定进行等度洗脱；检测波长345nm.流速为0.6ml/min。理论板数按盐酸小檗碱及盐酸药根碱的峰计算应不低于4000。
[0075]
表7、流动相洗脱表
[0076][0077]
对照品溶液的制备:精密称取盐酸小檗碱1.88mg、盐酸药根碱1.18mg加适量甲醇溶解，摇匀，得到浓度分别为0.47mg/ml，0.295mg/ml的盐酸小檗碱及盐酸药根碱混合标准品溶液。
[0078]
黄连供试品溶液制备:取人参黄连有效组分速崩片10片，研磨，精密称取1g，加甲醇25ml超声30min，0.45μm滤膜过滤，备用。
[0079]
1、紫外检测波长确定试验
[0080]
称取盐酸小檗碱对照品适量，以相应试剂作空白,照紫外分光光度计进行全波长扫描(200～500nm)，检测结果在345nm处有最大吸收峰，故确定345nm为检测波长。
[0081]
2、线性关系试验
[0082]
制备浓度分别为0.47mg/ml，0.295mg/ml盐酸小檗碱及药根碱的混合标准品溶液。分别以进样量为1μl、3μl、5μl、7μl、9μl、12μl注入液相色谱仪中，以质量(mg)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，分别绘制盐酸小檗碱及药根碱的标准曲线，曲线数据如表8所示，
[0083]
表8、盐酸小檗碱及药根碱标准曲线数据
[0084][0085][0086]
3、精密度试验
[0087]
精密吸取盐酸小檗碱及药根碱的混合标准品溶液3μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积积分值，计算考察精密度，结果如表9所示，
[0088]
表9、精密度实验数据
[0089][0090]
精密度考察结果显示：对照品溶液连续测定盐酸小檗碱及药根碱的混标对照品的峰面积结果的rsd均小于2％，表明仪器、方法的精密度良好。
[0091]
4、稳定性试验
[0092]
精密吸取同一黄连总生物碱供试品溶液10μl，按一定的时间分别注入液相色谱仪，以盐酸小檗碱及药根碱的混标对照品各成分的峰面积测定结果为指标，测定其在24h内检测的稳定性，结果如表10所示，
[0093]
表10、稳定性实验结果
[0094][0095][0096]
5、重现性试验
[0097]
精密称取同一黄连总生物碱供试品共5份，按供试品溶液项下制备方法制备，精密吸取10μl，计算样品含量，以考察本法的重现性，结果如表11所示，
[0098]
表11、重现性实验结果
[0099][0100]
6、加样回收率实验
[0101]
精密称定已知含量的三批黄连总生物碱各2mg，每批样品平行进样3次，分别精密加入盐酸小檗碱和药根碱混合标准品溶液适量，每组按照盐酸小檗碱和药根碱的含量80％、100％、120％的比例分别加入一定量的各盐酸小檗碱和药根碱标准品溶液，测定并计算各成分的加样回收率及rsd值。
[0102][0103]
其中，a
样
样品的峰面积、a
标
标准品的峰面积、c
标
标准品的浓度、c
样
样品的浓度、v
样
样品的体积、v
标
标准品的体积
[0104]
盐酸小檗碱和药根碱的加样回收率分别为102.6％、99.6％、101.6％。rsd值分别为101.3％、100.5％、99.6％。表明该方法的准确度良好，结果可信。
[0105]
7、样品测定及结论
[0106]
取人参黄连有效组分速崩片3个不同批次，每个批次检测3个平行样品，取平均值后盐酸药根碱和盐酸小檗碱的含量分别为2.644mg/片、39.02mg/片。
[0107]
通过上述研究分析进行人参黄连有效组分速崩片质量标准研究，证明本药品片剂稳定，进行合理的质量配比达到对氨基酸代谢，糖代谢，能量代谢以及核苷酸代谢有促进作用。
[0108]
实施例5
[0109]
人参总皂苷：黄连总生物碱最佳配比为1:4，其比例筛选方法，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行：
[0110]
步骤一、人肾小球系膜hmc细胞(以下简称hmc细胞)的复苏、传代及培养
[0111]
由液氮罐中取出冻存细胞，迅速放入37℃水浴锅中使融化，1000rpm/min，离心5min，弃去上清，加入1ml含10％胎牛血清(fbs)的dmem低糖培养液重悬细胞，转入培养瓶，加入适量培养液，培养液包括dmem低糖培养基、10％fbs胎牛血清以及p/s(pb180120)培养基，混匀后放入37℃，5％co2培养箱中培养。
[0112]
显微镜下观察细胞生长至90％左右融合时，进行传代。弃去培养液，用pbs洗涤细
胞2～3次。弃去pbs聚琥珀酸丁二酯(以下简称pbs)，加入0.25％胰蛋白酶-edta消化液，37℃消化3min。加入含10％fbs的培养液终止消化，将消化后细胞吹匀打散。取一定量细胞置新培养瓶中，加入适量含10％fbs的dmem低糖培养液，混匀后放入37℃，5％co2培养箱中培养。
[0113]
步骤二、人参总皂苷对hmc细胞高糖状态下增殖的影响
[0114]
取对数生长期的hmc细胞，以5000个/孔的密度接种于96孔板中，5％co2、37℃培养24h后给药，分为高糖control组，高糖人参总皂苷25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，共7组，每组设6个复孔。培养48h后，取出培养板，每孔加入50μl预冷的三氯醋酸(tca)固定，终浓度为10％，静置5min，然后转入4℃冰箱中静置1h，取出并用去离子水清洗3遍，空气中干燥。待培养板完全干燥后，每孔加入100μl由1％乙酸配制的0.4％的srb溶液，室温下染色20min。弃去srb染液，用1％乙酸溶液冲洗5遍，去除未结合的染料，空气中干燥。干燥后的培养板每孔加入150μl的tris-hcl(10mmol/l)，在水平振荡器上振荡5min，而后置于微孔扫描仪，测定570nm波长下各孔的od值，计算细胞的存活率。
[0115]
步骤三、黄连总生物碱对hmc细胞高糖状态下增殖的影响
[0116]
取对数生长期的hmc细胞，以5000个/孔的密度接种于96孔板中，5％co2、37℃培养24h后给药，分为高糖control组，高糖黄连总生物碱0.25μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，8μg/ml，16μg/ml，32μg/ml，共9组，每组设6个复孔。培养48h后，取出培养板，每孔加入50μl预冷的三氯醋酸(tca)固定，终浓度为10％，静置5min，然后转入4℃冰箱中静置1h，取出并用去离子水清洗3遍，空气中干燥。待培养板完全干燥后，每孔加入100μl由1％乙酸配制的0.4％的srb溶液，室温下染色20min。弃去srb染液，用1％乙酸溶液冲洗5遍，去除未结合的染料，空气中干燥。干燥后的培养板每孔加入150μl的tris-hcl(10mmol/l)，在水平振荡器上振荡5min，而后置于微孔扫描仪，测定570nm波长下各孔的od值，计算细胞的存活率。
[0117]
步骤四、人参总皂苷和黄连总生物碱不同配比对hmc细胞高糖状态下增殖的影响
[0118]
取对数生长期的hmc细胞，以5000个/孔的密度接种于96孔板中，5％co2、37℃培养24h后给药，分为高糖control组，高糖人参总皂苷：黄连总生物碱(50:0.5)μg/ml，(50:1)μg/ml，(50:2)μg/ml，(100:0.5)μg/ml，(100:1)μg/ml，(100:2)μg/ml，共7组，每组设6个复孔。培养48h后，取出培养板，每孔加入50μl预冷的三氯醋酸(tca)固定，终浓度为10％，静置5min，然后转入4℃冰箱中静置1h，取出并用去离子水清洗3遍，空气中干燥。待培养板完全干燥后，每孔加入100μl由1％乙酸配制的0.4％的srb溶液，室温下染色20min。弃去srb染液，用1％乙酸溶液冲洗5遍，去除未结合的染料，空气中干燥。干燥后的培养板每孔加入150μl的tris-hcl(10mmol/l)，在水平振荡器上振荡5min，而后置于微孔扫描仪，测定570nm波长下各孔的od值，计算细胞的存活率。
[0119]
步骤五、结果研究
[0120]
1、人参总皂苷对hmc细胞高糖状态下增殖的影响结果
[0121]
计算细胞存活率公式:
[0122]
细胞存活率％＝(加药细胞od值-本底od值)/(对照细胞od值-本底od值)
×
100％。结果见表12，
[0123]
表12、人参总皂苷对hmc细胞高糖状态下的细胞存活率
[0124][0125]
由实验结果可知，人参总皂苷不同浓度对hmc细胞高糖刺激下的增殖均有抑制作用。而且随着药物作用浓度的增加，抑制率增强。
[0126]
2、黄连总生物碱对hmc细胞高糖状态下增殖的影响结果
[0127]
结果见表13，
[0128]
表13黄连总生物碱对hmc细胞高糖状态下的细胞存活率
[0129][0130]
由实验结果可知，黄连总生物碱不同浓度对hmc细胞高糖刺激下的增殖均有抑制作用。而且随着药物作用浓度的增加，抑制率增强。
[0131]
3、人参总皂苷和黄连总生物碱不同配比对hmc细胞高糖状态下增殖的影响结果见表14，
[0132]
表14、人参总皂苷和黄连总生物碱不同配比对hmc细胞高糖状态下的细胞存活率
[0133][0134]
由实验结果可知，人参总皂苷：黄连总生物碱(50:0.5)μg/ml，(50:1)μg/ml，(50:2)μg/ml，(100:0.5)μg/ml，(100:1)μg/ml，(100:2)μg/ml浓度对hmc细胞高糖刺激下的增殖均有抑制作用。综合考虑细胞正常状态下(100:2)μg/ml浓度对细胞具有明显的抑制作用，(100:1)μg/ml浓度对细胞则无明显抑制作用，筛选出人参总皂苷和黄连总生物碱在(100:1)μg/ml时为最佳给药配比。
[0135]
本发明采用的srb法即磺基罗丹明b法，做为一种筛选药物对细胞作用的新方法。其原理是：srb是一种粉红色阴离子染料，可在酸性条件下与经tca固定后的细胞内蛋白质的碱性氨基酸结合显色，在570nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，因此可以用来计算细胞的存活率。通过实验可知，人参总皂苷和黄连总生物碱在(100:1)μg/ml对高糖刺激的hmc细胞抑制率最好。根据大鼠灌胃给黄连总生物碱100mg/kg达到的血浆峰浓度为1μg/ml，给人参总皂苷25mg/kg达到的血浆峰浓度为100μg/ml推算，人参总皂苷和黄连总生物碱在(100:1)μg/ml血浆浓度相当于大鼠灌胃给人参总皂苷和黄连总生物碱(25:100)mg/kg，即确定人参总皂苷和黄连总生物碱配伍比例为1:4。