一种橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂及其制备方法与应用与流程

[0001]
本发明涉及一种抗腹泻制剂及其制备方法与应用，更具体地，涉及一种橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂及其制备方法与应用。


背景技术：

[0002]
仔猪因肠道内尚未建立稳定的微生态系统，自身抵抗力较低，对外界刺激敏感，易受各种病原微生物的侵袭和各种应激因素的影响，哺乳仔猪以传染性腹泻较为常见，而保育仔猪以日粮抗原过敏、断奶、饲料突然更换、寒冷、环境应激等非传染性因素引起的腹泻为主，病猪和带毒猪是主要传染源，病毒从粪便排出污染环境而散播传染，在秋末初冬湿度较大、温度低及高密度饲养的猪群更易感染本病，几天之内使全场的猪发病，带来巨大的经济损失，目前常见的治疗方法为抗生素治疗，但抗生素容易引起不良反应，例如过敏性休克、溶血性贫血、血清病、药物热等，同时容易引起毒性反应，导致机体功能或者组织结构发生改变，使得机体生理和功能改变，使用过多还会产生抗药性。


技术实现要素：

[0003]
发明目的：本发明的目的是提供一种副作用小、不会引起机体产生不良反应、不产生抗药性的橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂，本发明的另一目的是提供该制剂的制备方法，本发明的另一目的是提供该制剂的应用。
[0004]
技术方案：本发明所述的橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂，包括浓度比为10～20：1的橙皮苷制剂和迷迭香酸制剂。
[0005]
其中，橙皮苷制剂和迷迭香酸制剂浓度比为10～20：1。
[0006]
本发明所述的橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0007]
(1)利用陈皮通过热溶剂法提取、配制橙皮苷制剂；
[0008]
(2)利用迷迭香叶片通过溶剂提取法提取、配制迷迭香酸制剂；
[0009]
(3)将两种制剂混合后涡旋30～60s，然后置于摇床中2～3h，制得橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂。
[0010]
其中，步骤1包括以下步骤：
[0011]
(11)将陈皮粉碎、过筛，放入反应釜中；
[0012]
(12)在反应釜中加入乙醇溶液；
[0013]
(13)将反应釜中置于100℃～150℃下进行热溶剂提取，并旋转蒸发，得到橙皮苷；
[0014]
(14)将橙皮苷溶于二甲基亚砜，得到橙皮苷制剂。
[0015]
其中，步骤11中陈皮粉碎后过200～250目筛，所述步骤12中乙醇溶液浓度为60％～75％，加入的乙醇溶液体积与陈皮粉末的质量比为70～80ml：1g；所述步骤14中将橙皮苷溶于二甲基亚砜后利用0.22～0.28μm滤膜过滤。
[0016]
其中，步骤2包括以下步骤：
[0017]
(21)将迷迭香叶片粉碎、过筛；
[0018]
(22)在过筛后的迷迭香粉末中加入乙醇溶液浸提得到提取液，浸取时间为6～8h；
[0019]
(23)利用滤膜过滤提取液，并加入正丁醇进行萃取，然后回收正丁醇；
[0020]
(24)将回收的正丁醇调整ph至2～2.5，加入乙酸乙酯进行萃取，然后利用乙醇溶液洗脱萃取液，利用x-5大孔树脂收集滤液，低温结晶、过滤、干燥得到迷迭香酸；
[0021]
(25)将迷迭香酸溶于二甲基亚砜，得到迷迭香酸制剂。
[0022]
其中，步骤21中迷迭香叶片粉碎后过20～30目筛，所述步骤22中乙醇溶液浓度为50％～60％，加入的乙醇溶液体积与迷迭香粉末质量比为15～20ml：1g，浸提次数为2～3次；步骤23中加入正丁醇萃取前将提取液ph调整至2～3，加入的正丁醇溶液为提取液体积的1.5～2倍，萃取时间为20～30min，萃取次数为2～4次；步骤24中乙酸乙酯萃取时间为20～30min，萃取次数为3～5次，乙酸乙酯使用量为回收的正丁醇体积的1.5～2倍，步骤25中将迷迭香酸溶于二甲基亚砜后利用0.22～0.28μm滤膜过滤。
[0023]
其中，步骤3中摇床转速150～200rpm，温度30～40℃。
[0024]
本发明所述的橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂作为饲料添加剂的应用在饲料中。
[0025]
工作原理：橙皮苷具有双氧黄酮氧苷结构，所含的酚羟基结构使其具有较高的抗氧化性能。橙皮苷发挥抑菌作用主要靠其酚类和萜类衍生物对细菌细胞膜通透性的改变，并且其衍生物与还具有弱酸性，能使细菌蛋白质变性或凝固。研究发现橙皮苷具有抗菌、抗炎、抗氧化等作用。其在低ph条件下对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等具有显著抑制作用。迷迭香酸是一种水溶性多酚的羟基酸，其具有较强的抗氧化和清除自由基的作用可能与其邻二酚羟基有关。其弱酸性和酚类衍生物能够破坏细菌细胞膜，改变细胞膜通透性。两者配合使用能够增加其对细菌生长的抑制作用，并且橙皮苷和迷迭香酸的衍生物均具有弱酸性，能进一步增强低ph对细菌细胞膜和蛋白质的损伤，抑菌作用更强。此外，橙皮苷具有极强的抗氧化能力，其对自由基清除率仅次于维生素c，迷迭香酸的自由基清除率弱于橙皮苷，两者配合使用还能增强配伍制剂的抗氧化水平。我们的研究发现橙皮苷在较高比例(10～20:1)作用较好，这还能降低组合制剂的价格，具有较好的经济优势。后续试验结果也表明两者配合能够增强抑制致病菌的能力，还能够提高机体抗氧化能力和抑制炎症等作用，促进动物生长发育，提高大鼠的平均日增重，改善肠道微生物菌群结构的作用。此外，还能提高体外发酵参数，提高或显著提高发酵体系中短链脂肪酸(scfas)的含量，具有促进微生物发酵的作用。
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有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点是：1、无毒、无耐药性，减少畜禽粪便对环境的污染；2、具有较强的杀菌能力，抑菌能力更强、体外自由基清除能力显著增强、提高体外发酵参数，促进微生物发酵；3、能够改善肠道微生态平衡，提高机体抵抗力，因此能够作为添加剂应用在饲料中。
附图说明
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图1是大鼠体重的变化图：(a)大鼠体重变化百分比曲线；(b)大鼠体重日增重柱状图；
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图2是大鼠体重腹泻率对比图；
[0029]
图3是对照组、橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对lps攻毒大鼠肠道炎症因子含量的影响图：(a)回肠、盲肠和结肠的mpo含量；(b)回肠il-6、il-10和
tnf-α的含量；(c)盲肠il-6、il-10和tnf-α的含量；(d)结肠il-6、il-10和tnf-α的含量。
具体实施方式
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制备橙皮苷制剂：
[0031]
将陈皮粉碎、过250目筛，称量0.2g过筛后的陈皮粉末于25ml聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，按照70:1(ml：g)的料液比加入的浓度为60％的乙醇溶液，在120℃条件下进行热溶剂提取，提取时间为45min，提取结束后4000r/min离心5min，立即旋转蒸发除去乙醇，即得橙皮苷，称取4.00g的橙皮苷于离心管中，加入10ml的二甲基亚砜溶解混匀，置于37℃，150rpm的摇床2h，每隔30min取出混匀30s，取出后用无菌水定容至10ml，后通过0.22μm滤膜过滤，制成400mg/ml的橙皮苷制剂，于4℃冰箱保存备用。
[0032]
制备迷迭香酸制剂：
[0033]
将迷迭香叶片粉碎、过20目筛，称量100.0g过筛后的迷迭香叶粉密封于聚乙烯袋中，加入比例为15倍体积浓度为50％的乙醇溶液，浸提两次，浸取时间为6h，收集浸提液，先使用微滤膜对提取液进行预处理，过滤三次，除去提取液中的悬浮颗粒，将滤液用盐酸调整ph至3，以1.5倍体积正丁醇进行萃取，萃取条件为：萃取两次，每次时间20min，回收正丁醇，将回收的正丁醇中加高纯水，记录体积，用盐酸调整ph至2.0～2.5，用体积比为10:6的乙酸乙酯萃取3次，每次萃取20min，使用75％的乙醇溶液洗脱萃取液，然后通过x-5大孔树脂，收集滤液，低温结晶、过滤、干燥，即得迷迭香酸。称取4.00g的迷迭香酸于离心管中，分别加入10ml的二甲基亚砜溶解混匀，置于37℃，150rpm的摇床2h，每隔30min取出混匀30s，取出后用无菌水定容至10ml，后通过0.22μm滤膜过滤，制成400mg/ml的迷迭香酸制剂，于4℃冰箱保存备用。
[0034]
制备橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂：
[0035]
将迷迭香酸制剂和橙皮苷制剂稀释成40mg/ml，将两种组合制剂按浓度1:15混合后涡旋30s，置于37℃，150rpm的摇床2h，每隔30min取出混匀30s，制成百里香-迷迭香抗腹泻制剂。
[0036]
分别对橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂进行体外抑菌实验，结果如表1所示，从表1中可知橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对产肠毒素大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌具有较强的杀伤能力；mic法试验测得的最小抑菌浓度分别为0.5mg/ml；0.5mg/ml；0.5mg/ml。：
[0037]
表1橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对致病菌的抑制效果(mg/ml)
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注：“_”表示在0-400mg/ml范围内未检出抑菌
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利用体外发酵的方法模拟橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对猪结肠微生物体外发酵水平的影响，结果如表2所示：
[0041]
表2橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂模拟发酵实验结果
[0042][0043][0044]
从表2可以看出试验证明植物提取物橙皮苷、迷迭香酸和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对体外发酵参数均具有较大的提高，并且该组合制剂对体外发酵参数的提高均优于或显著优于单一植物提取物制剂。
[0045]
对橙皮苷制剂、迷迭香酸制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂进行动物试验，动物试验于南京农业大学动物实验中心进行，时间为2019年12月～2020年1月。试验以21日龄、体重约为50
±
2.0g的断奶sd大鼠40只，共分为4个处理，对照组(con)、橙皮苷组(hes)、迷迭香酸+橙皮苷组(ros-a+hes)、迷迭香酸组(ros-a)，每个处理10只体重日龄相近的大鼠，公母各半。每只大鼠灌胃量见表3，每天称重后灌胃一次。试验期间自由采食和饮水，预试期7天，正式试验14天，共21天，试验过程中均自由采食和饮水。于试验第21天，对全部大鼠腹腔注射1mg/kg的lps，注射脂多糖8小时后，用断头法处死全部大鼠并取样。
[0046]
表3迷迭香酸制剂、橙皮苷制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂的添加量
[0047][0048]
试验期间，每天记录采食量，并分别于试验第1、4、7、10、11、12、13、14天早上8点称
重记录；大鼠屠宰后，先将小肠(包括十二指肠、空肠、回肠及其食糜)称重，后取各组空肠中段、回肠中段、盲肠，进行he染色，并量取绒毛高度，隐窝深度，计算绒毛高度/隐窝深度比值，用于评价橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对lps攻毒后对肠道形态学的保护功效；采用试剂盒测定各组大鼠血清中sod，mda，t-aoc和gsh-px的含量，用于评价橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂和对lps攻毒后对肠道形态学机体抗氧化系统的保护功效；采用试剂盒测定各组大鼠肠道黏膜中il-6、il-8、il-10和tnf-α的含量，用以评价橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对lps攻毒后机体炎症系统的保护效果。
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对照组、迷迭香酸制剂、橙皮苷制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对大鼠增重的影响如图1(a)、图1(b)所示，从图中可以看出大鼠灌胃橙皮苷、迷迭香酸和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂均能提高大鼠的生长性能。灌胃5天后，橙皮苷-迷迭香酸抗腹泻制剂组大鼠体重与对照组、橙皮苷制剂组和迷迭香酸制剂组明显分离，并且橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组大鼠的平均日增重显著高于对照组和单一植物提取物组(p<0.05)。对照组、迷迭香酸制剂、橙皮苷制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对大鼠腹泻率的影响如图2所示，从图中可以看出，与对照组相比，灌胃植物提取物的断奶大鼠腹泻率均有所降低，其中橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组大鼠的腹泻率显著低于对照组(p<0.05)。并且，橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组大鼠的腹泻率也低于单一植物提取物组，但未达到显著水平(p>0.05)。对照组、迷迭香酸制剂、橙皮苷制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对lps攻毒大鼠肠道形态结构的影响如表4所示：与对照组相比，灌胃植物提取物能够显著改善大鼠空肠、回肠、盲肠的形态结构。其中，橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂灌胃能够显著提高大鼠空肠的绒毛高度、显著降低隐窝深度(p<0.05)，并且，橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组大鼠的空肠的绒隐比也显著高于对照组和单一植物提取物组(p<0.05)。灌胃橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组大鼠的回肠绒毛高度也显著高于对照组(p<0.05)，但与单一植物提取物相比未达到显著水平；隐窝深度也略高于对照组，未达到显著水平；但橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组大鼠绒隐比显著高于对照组和橙皮苷制剂组(p<0.05)。此外，橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组大鼠的盲肠绒毛高度和黏膜厚度也显著高于对照组(p<0.05)，但与单一植物提取物组相比差异不显著(p>0.05)。
[0050]
表4对照组、迷迭香酸制剂、橙皮苷制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对lps攻毒大鼠肠道形态结构的影响
[0051]
[0052][0053]
对照组、迷迭香酸制剂、橙皮苷制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对lps攻毒大鼠抗氧化指标的影响如表5所示，从表5中可以看出，sd大鼠灌胃植物提取物及其组合能够提高肝脏和肠道的抗氧化水平。与对照组相比，橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组能够显著提高回肠、盲肠和肝脏的t-aoc和gsh-px的水平(p<0.05)，并且显著降低盲肠、结肠、空肠和肝脏的mda含量(p<0.05)。总体分析发现，橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组大鼠肠道和肝脏的抗氧化水平略高于或显著高于单一植物提取物组。
[0054]
表5对照组、迷迭香酸制剂、橙皮苷制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对lps攻毒大鼠抗氧化指标的影响
[0055]
[0056][0057]
从图3(a)、图3(b)、图3(c)、图3(d)中可以看出，与对照组相比，迷迭香酸制剂、橙皮苷制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂均能降低lps攻毒大鼠回肠、盲肠、结肠的mpo含量，其中橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组达到显著水平(p<0.05)。橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组回肠、盲肠、结肠黏膜中il-10的含量显著高于对照组(p<0.05)，并且橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组回肠黏膜中il-10的含量也显著高于迷迭香酸制剂组，也略高于橙皮苷制剂组，但差异
不显著。橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组回肠、盲肠、结肠黏膜中il-6的含量显著低于对照组和单一植物提取物组(p<0.05)。迷迭香酸制剂组、橙皮苷制剂组三个肠段黏膜中il-6的含量略低于对照组，但未达到显著水平。
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肠道总菌数量反应肠道的稳态，总菌数量提高表明肠道为微生物稳态有所提高。本试验中，空、回、盲、结四个肠段中总菌数量都显著高于对照组，高于或显著高于单一植物提取物制剂组，说明橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂能够提高lps攻毒大鼠的肠道菌群的稳态。大肠杆菌是肠道中数量众多的一种条件致病菌，大肠杆菌或肠杆菌属菌群数量提高会造成腹泻等疾病。而乳酸杆菌是肠道中的有益菌，其代谢产生的乳酸不仅能够供机体利用，并且还能降低肠道ph，抑制有害细菌的生长，对照组、迷迭香酸制剂、橙皮苷制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对lps攻毒大鼠肠道菌群数量的影响如表6所示：
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表6对照组、迷迭香酸制剂、橙皮苷制剂和橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂对lps攻毒大鼠肠道菌群数量的影响
[0060][0061]
从表6中可以看出，与对照组相比，橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组能够显著提高各肠段乳酸杆菌的数量，显著降低大肠杆菌的数量(p<0.05)，并且橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂组与单一植物提取物组相比大肠杆菌数量降低或显著降低，乳酸杆菌数量提高或显著提高。表明橙皮苷-迷迭香抗腹泻制剂能够提高肠道中有益菌的数量，降低条件致病菌大肠杆菌的数量，能够调整肠道的菌群结构，提高肠道健康水平。