一种马兰提取物及其制备方法和应用与流程

[0001]
本发明涉及植物提取研究领域，具体涉及一种马兰提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]
马兰是菊科马兰属多年生草本植物，性凉，味辛，归肺经、肝经、胃经、大肠经。马兰活性成分位于叶、茎、根，主要含黄酮类物质、多酚、多糖、挥发油、生物碱等。文献（邓曦, 王林, 杨海涛. 马兰中总黄酮提取及其抗氧化活性的研究[j]. 湖北农业科学, 2016, 55(16): 4241-4245+4249.）公开了马兰黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、延缓衰老、抗癌防癌、抗病毒等功效；同时，文献（朱晓琳, 刘跃钧, 陆敏,吕丽爽. 不同品种马兰的活性组分及抑制蛋白糖基化功能[j].食品科学, 2014, 35(09): 90-95.）记载了马兰多酚和黄酮也可抑制由甲基乙二醛和乙二醛引发的蛋白质的非酶糖基化反应。
[0003]
目前，有诸多关于马兰黄酮提取工艺的相关报道，如：文献（张灿, 张海晖, 武妍, 段玉清, 张瑞, 邵婷婷, 陈杰华. 马兰黄酮类化合物的提取及其抗氧化活性[j]. 农业工程学报, 2011, 27(s2): 307-311.）公开了一种马兰黄酮提取方法，脱脂马兰粉2.0 g
→
加入60 ml体积分数70%乙醇
→
70℃回流提取90 min
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过滤
→
滤液定容至100 ml
→
测定黄酮质量，马兰黄酮提取率为2.83%；文献（邓曦, 王林, 杨海涛. 马兰中总黄酮提取及其抗氧化活性的研究[j].湖北农业科学, 2016, 55(16): 4241-4245+4249.）公开了一种超声波辅助乙醇提取法提取马兰黄酮的方法，称取1.000 0 g脱脂干燥的马兰叶，按一定的料液比加入不同体积分数的乙醇溶液，在超声波清洗器中(400 w)超声波辅助提取一定时间，用真空泵抽提过滤，滤液即为马兰提取液，马兰黄酮提取率为3.57%；文献（姜显光, 侯冬岩, 回瑞华, 刁全平. 马兰叶中总黄酮的提取[j]. 天然产物研究与开发, 2011, 23(05): 967-969.）公开了一种纤维素酶辅助热浸提法提取马兰黄酮的方法，将马兰叶晒干，粉碎，过筛，称取10.0g 马兰叶，置于索氏提取器中，用石油醚脱色1.5 h，过滤后将滤渣置于锥形瓶中，加入纯净水150 ml和纤维素酶，调ph 在4~6之间，55℃水浴1.5 h，过滤，收集滤液，将滤渣置于锥形瓶中，浸提3 次，每次用200 ml 60%乙醇在60℃条件下浸提1 h，合并四次滤液，蒸发溶剂，得黄酮浸膏，用60 ml 石油醚分三次洗涤，弃掉石油醚，用800 ml 60%乙醇定容，测定马兰黄酮含量为17.14 mg/ml。上述提取方法存在黄酮提取率低、有机溶剂残留、提取液稳定性难以保障等问题，所得提取物不适宜应用于护肤品中。
[0004]
目前，马兰提取物在护肤品中尚未得到广泛应用，开发一种马兰活性成分提取率高、稳定性好的制备方法，并将所得马兰提取物应用于护肤品领域，对马兰的深度开发及广泛应用具有重要意义。


技术实现要素：

[0005]
基于现有技术存在的问题，本发明目的是提供一种马兰提取物及其制备方法和应用，本发明所述马兰提取物黄酮含量高、稳定性好，马兰提取物可得以充分利用。同时，本发明马兰提取物可显著降低乳酸引起的皮肤刺激反应，具有紧致肌肤、补水、保湿的功效，可
广泛应用于护肤品或化妆品中。
[0006]
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案实现的：本发明一方面提供了一种马兰提取物，所述马兰提取物中黄酮含量为 2.60-5.42 mg/ml。
[0007]
根据本发明的一些具体实施方案，所述马兰提取物中黄酮含量为3.31-5.42 mg/ml。
[0008]
根据本发明，所述马兰提取物通过超声辅助复合酶解工艺制备得到。
[0009]
根据本发明的一些具体实施方式，所述马兰提取物通过包括下述步骤的方法制备得到：（1）马兰干燥、粉碎、过筛，加入一定量水；（2）将步骤（1）所得马兰溶液进行超声处理，得马兰超声混悬液；（3）调节步骤（2）马兰超声混悬液的ph值，加入胃蛋白酶进行初次酶解，得马兰酶解液-；（4）调节步骤（3）马兰酶解液-的ph值，加入纤维素酶进行二次酶解，得马兰提取物。
[0010]
根据本发明，所述超声提取步骤在kq500de数控超声波清洗器进行。
[0011]
根据本发明，所述酶解步骤在dht型搅拌调温电热套进行。
[0012]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（3）中胃蛋白酶添加量为原料马兰质量的0.05%-0.5%，例如可以是0.05wt%、0.06wt%、0.07wt%、0.08wt%、0.09wt%、0.1wt%、0.11wt%、0.12wt%、0.13wt%、0.14wt%、0.15wt%、0.16wt%、0.17wt%、0.18wt%、0.19wt%、0.2wt%、0.21wt%、0.22wt%、0.23wt%、0.24wt%、0.25wt%、0.26wt%、0.27wt%、0.28wt%、0.29wt%、0.3wt%、0.31wt%、 0.32wt%、0.33wt%、0.34wt%、0.35wt%、0.36wt%、0.37wt%、0.38wt%、0.39wt%、0.4wt%、0.41wt%、 0.42wt%、0.43wt%、0.44wt%、0.45wt%、0.46wt%、0.47wt%、0.48wt%、0.49wt%、0.5wt%，以及上述数值之间的点值。
[0013]
根据本发明的一些具体实施方案，所述制备步骤（3）中胃蛋白酶添加量为原料马兰质量的0.1-0.3wt%。
[0014]
根据本发明的又一些具体实施方案，所述制备步骤（3）中胃蛋白酶添加量为原料马兰质量的0.3wt%。
[0015]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（4）纤维素酶添加量为原料马兰质量的0.05%-0.5%，例如可以是0.05wt%、0.06wt%、0.07wt%、0.08wt%、0.09wt%、0.1wt%、0.11wt%、0.12wt%、0.13wt%、0.14wt%、0.15wt%、0.16wt%、0.17wt%、0.18wt%、0.19wt%、0.2wt%、0.21wt%、0.22wt%、0.23wt%、0.24wt%、0.25wt%、0.26wt%、0.27wt%、0.28wt%、0.29wt%、0.3wt%、0.31wt%、 0.32wt%、0.33wt%、0.34wt%、0.35wt%、0.36wt%、0.37wt%、0.38wt%、0.39wt%、0.4wt%、0.41wt%、 0.42wt%、0.43wt%、0.44wt%、0.45wt%、0.46wt%、0.47wt%、0.48wt%、0.49wt%、0.5wt%，以及上述数值之间的点值。
[0016]
根据本发明的一些具体实施方案，所述制备步骤（4）中纤维素酶添加量为原料马兰质量的0.1-0.3wt%。
[0017]
根据本发明的又一些具体实施方案，所述制备步骤（4）中纤维素酶添加量为原料马兰质量的0.3wt%。
[0018]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（3）中马兰超声混悬液的ph值为
1.0-2.5。
[0019]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（3）中初次酶解温度为35-40℃。
[0020]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（3）中初次酶解时间为15-30 min。
[0021]
根据本发明的又一些具体实施方式，所述制备步骤（3）中马兰超声混悬液的ph值为1. 5。
[0022]
根据本发明的又一些具体实施方式，所述制备步骤（3）中初次酶解温度为36.5℃。
[0023]
根据本发明的又一些具体实施方式，所述制备步骤（3）中初次酶解时间为20 min。
[0024]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（4）中马兰酶解液的-的ph值为4.5-6.0。
[0025]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（4）中二次酶解温度为40-50℃。
[0026]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（4）中二次酶解时间为30-90 min。
[0027]
根据本发明的又一些具体实施方式，所述制备步骤（4）中马兰酶解液-的ph值为5.0。
[0028]
根据本发明的又一些具体实施方式，所述制备步骤（4）中二次酶解温度为45℃。
[0029]
根据本发明的又一些具体实施方式，所述制备步骤（4）中二次酶解时间为60 min。
[0030]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（2）中超声功率为200-400 w。
[0031]
根据本发明又一些具体的实施方案，所述步骤（2）中超声功率为300-400 w。
[0032]
根据本发明进一步具体的实施方案，所述步骤（2）中超声功率为300 w。
[0033]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（2）中超声提取时间为20-50 min。
[0034]
根据本发明又一些具体的实施方案，所述步骤（2）中超声提取时间为30-50 min。
[0035]
根据本发明进一步具体的实施方案，所述步骤（2）中超声提取时间为30 min。
[0036]
根据本发明进一步具体的实施方案，所述步骤（2）中超声提取温度为50-70℃。
[0037]
根据本发明进一步具体的实施方案，所述步骤（2）中超声提取温度为60℃。
[0038]
根据本发明一些具体实施方案，步骤（1）中所述的马兰与水的料液比为1:20-1:50（m/m），例如可以是1：20（m/m）、1：21（m/m）、1：22（m/m）、1：23（m/m）、1：24（m/m）、1：25（m/m）、1：26（m/m）、1：27（m/m）、1：28（m/m）、1：29（m/m）、1：30（m/m）、1：31（m/m）、1：32（m/m）、1：33（m/m）、1：34（m/m）、1：35（m/m）、1：36（m/m）、1：37（m/m）、1：38（m/m）、1：39（m/m）、1：40（m/m）、1：41（m/m）、1：42（m/m）、1：43（m/m）、1：44（m/m）、1：45（m/m）、1：46（m/m）、1：47（m/m）、1：48（m/m）、1：49（m/m）、1：50（m/m），以及上述数值之间的点值。
[0039]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（1）中马兰与水的料液比为1:20-1:40（m/m）。
[0040]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（1）中马兰与水的料液比为1:30（m/m）。
[0041]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（1）中所述原料预处理为马兰干燥、粉碎、过40-60目筛，取40目筛下及60目筛上部分备用。
[0042]
根据本发明又一些具体实施方案，所述步骤（1）中马兰干燥方式为本领域常规干燥方式，如烘箱干燥、真空低温干燥。
[0043]
根据本发明，所述步骤（1）中马兰干燥方式为55-65℃烘箱干燥至恒重。
[0044]
根据本发明一些具体实施方案，所述一种马兰提取物的制备方法还包括步骤（5）灭酶、过滤。
[0045]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（5）中灭酶方法为高温灭菌。
[0046]
根据本发明又一些具体实施方案，所述步骤（5）中灭酶温度为90-95℃。
[0047]
根据本发明又一些具体实施方案，所述步骤（5）中灭酶时间为30 min。
[0048]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（5）中过滤方式为本领域常规过滤方式。
[0049]
根据本发明，所用的水优选为去离子水。
[0050]
根据本发明，所用的马兰优选为马兰全草。
[0051]
根据本发明，所述马兰提取物具有抗刺激、紧致肌肤、补水、保湿的功效。
[0052]
本发明再一方面提供了上述马兰提取物在护肤品或化妆品中的应用。
[0053]
本发明再一方面提供了上述马兰提取物在具有抗刺激、紧致肌肤、补水、保湿功效护肤品或化妆品中的应用。
[0054]
本发明另一方面，提供了一种马兰提取物的制备方法，包括下述步骤：（1）马兰干燥、粉碎、过筛，加入一定量水；（2）将步骤（1）所得马兰溶液进行超声处理，得马兰超声混悬液；（3）调节步骤（2）马兰超声混悬液的ph值，加入胃蛋白酶进行初次酶解，得马兰酶解液-；（4）调节步骤（3）马兰酶解液-的ph值，加入纤维素酶进行二次酶解，得马兰提取物。
[0055]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（3）中胃蛋白酶添加量为原料马兰质量的0.05%-0.5%，例如可以是0.05wt%、0.06wt%、0.07wt%、0.08wt%、0.09wt%、0.1wt%、0.11wt%、0.12wt%、0.13wt%、0.14wt%、0.15wt%、0.16wt%、0.17wt%、0.18wt%、0.19wt%、0.2wt%、0.21wt%、0.22wt%、0.23wt%、0.24wt%、0.25wt%、0.26wt%、0.27wt%、0.28wt%、0.29wt%、0.3wt%、0.31wt%、 0.32wt%、0.33wt%、0.34wt%、0.35wt%、0.36wt%、0.37wt%、0.38wt%、0.39wt%、0.4wt%、0.41wt%、 0.42wt%、0.43wt%、0.44wt%、0.45wt%、0.46wt%、0.47wt%、0.48wt%、0.49wt%、0.5wt%，以及上述数值之间的点值。
[0056]
根据本发明的一些具体实施方案，所述制备步骤（3）中胃蛋白酶添加量为原料马兰质量的0.1-0.3wt%。
[0057]
根据本发明的又一些具体实施方案，所述制备步骤（3）中胃蛋白酶添加量为原料马兰质量的0.3wt%。
[0058]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（4）中纤维素酶添加量为原料马兰质量的0.05%-0.5%，例如可以是0.05wt%、0.06wt%、0.07wt%、0.08wt%、0.09wt%、0.1wt%、0.11wt%、0.12wt%、0.13wt%、0.14wt%、0.15wt%、0.16wt%、0.17wt%、0.18wt%、0.19wt%、0.2wt%、0.21wt%、0.22wt%、0.23wt%、0.24wt%、0.25wt%、0.26wt%、0.27wt%、0.28wt%、0.29wt%、0.3wt%、0.31wt%、 0.32wt%、0.33wt%、0.34wt%、0.35wt%、0.36wt%、0.37wt%、0.38wt%、0.39wt%、0.4wt%、0.41wt%、 0.42wt%、0.43wt%、0.44wt%、0.45wt%、0.46wt%、0.47wt%、0.48wt%、0.49wt%、0.5wt%，以及上述数值之间的点值。
[0059]
根据本发明的一些具体实施方案，所述制备步骤（4）中纤维素酶添加量为原料马兰质量的0.1-0.3wt%。
[0060]
根据本发明的又一些具体实施方案，所述制备步骤（4）中纤维素酶添加量为原料
马兰质量的0.3wt%。
[0061]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（3）中马兰超声混悬液的ph值为1.0-2.5。
[0062]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（3）中初次酶解温度为35-40℃。
[0063]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（3）中初次酶解时间为15-30 min。
[0064]
根据本发明的又一些具体实施方式，所述制备步骤（3）中马兰超声混悬液的ph值为1.5。
[0065]
根据本发明的又一些具体实施方式，所述制备步骤（3）中初次酶解温度为36.5℃。
[0066]
根据本发明的又一些具体实施方式，所述制备步骤（3）中初次酶解时间为20 min。
[0067]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（4）中马兰酶解液-的ph值为4.5-6.0。
[0068]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（4）中二次酶解温度为40-50℃。
[0069]
根据本发明的一些具体实施方式，所述制备步骤（4）中二次酶解时间为30-90 min。
[0070]
根据本发明的又一些具体实施方式，所述制备步骤（4）中马兰酶解液-的ph值为5.0。
[0071]
根据本发明的又一些具体实施方式，所述制备步骤（4）中二次酶解温度为45℃。
[0072]
根据本发明的又一些具体实施方式，所述制备步骤（4）中二次酶解时间为60 min。
[0073]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（2）中超声功率为200-400 w。
[0074]
根据本发明又一些具体的实施方案，所述步骤（2）中超声功率为300-400 w。
[0075]
根据本发明进一步具体的实施方案，所述步骤（2）中超声功率为300 w。
[0076]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（2）中超声提取时间为20-50 min。
[0077]
根据本发明又一些具体的实施方案，所述步骤（2）中超声提取时间为30-50 min。
[0078]
根据本发明进一步具体的实施方案，所述步骤（2）中超声提取时间为30 min。
[0079]
根据本发明进一步具体的实施方案，所述步骤（2）中超声提取温度为50-70℃。
[0080]
根据本发明进一步具体的实施方案，所述步骤（2）中超声提取温度为60℃。
[0081]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（1）中马兰与水的料液比为1:20-1:50（m/m），例如可以是1：20（m/m）、1：21（m/m）、1：22（m/m）、1：23（m/m）、1：24（m/m）、1：25（m/m）、1：26（m/m）、1：27（m/m）、1：28（m/m）、1：29（m/m）、1：30（m/m）、1：31（m/m）、1：32（m/m）、1：33（m/m）、1：34（m/m）、1：35（m/m）、1：36（m/m）、1：37（m/m）、1：38（m/m）、1：39（m/m）、1：40（m/m）、1：41（m/m）、1：42（m/m）、1：43（m/m）、1：44（m/m）、1：45（m/m）、1：46（m/m）、1：47（m/m）、1：48（m/m）、1：49（m/m）、1：50（m/m），以及上述数值之间的点值。
[0082]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（1）中马兰与水的料液比为1:20-1:40（m/m）。
[0083]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（1）中马兰与水的料液比为1:30（m/m）。
[0084]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（1）中原料预处理为马兰干燥、粉碎、过40-60目筛，取40目筛下及60目筛上部分备用。
[0085]
根据本发明又一些具体实施方案，所述步骤（1）中马兰干燥方式为本领域常规干
燥方式，如烘箱干燥、真空低温干燥。
[0086]
根据本发明，所述步骤（1）中马兰干燥方式为55-65℃烘箱干燥至恒重。
[0087]
根据本发明一些具体实施方案，所述一种马兰提取物的制备方法还包括步骤（5）灭酶、过滤。
[0088]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（5）中灭酶方法为高温灭菌。
[0089]
根据本发明又一些具体实施方案，所述步骤（5）中灭酶温度为90-95℃。
[0090]
根据本发明又一些具体实施方案，所述步骤（5）中灭酶时间为30 min。
[0091]
根据本发明一些具体实施方案，所述步骤（5）中过滤方式为本领域常规过滤方式。
[0092]
根据本发明，所用的水优选为去离子水。
[0093]
根据本发明，所用的马兰优选为马兰全草。
[0094]
根据本发明一些具体实施方案，上述制备方法制备得到马兰提取物的黄酮得率为10.83%-15.26%。
[0095]
根据本发明一些具体实施方案，上述制备方法制备得到马兰提取物的黄酮得率为13.25%-15.26%。
[0096]
本发明再一方面提供了上述马兰提取物制备方法制备得到的马兰提取物在护肤品或化妆品中的应用。
[0097]
本发明再一方面提供了所述马兰提取物制备方法制备得到的马兰提取物在具有抗氧化、紧致肌肤、补水保湿功效护肤品或化妆品中的应用。
[0098]
根据本发明，所述护肤品或化妆品例如可以是面霜、护肤水、面膜等，不做具体限制。
[0099]
本发明对于超声提取及酶解反应设备无特殊要求。
[0100]
根据本发明，所述超声提取步骤在kq500de数控超声波清洗器进行。
[0101]
根据本发明，所述酶解步骤在dht型搅拌调温电热套进行。
[0102]
本发明有益效果：本发明采用复合酶解结合超声提取工艺制备马兰提取物，所得马兰提取物黄酮含量高、稳定性好，保障了马兰提取物的充分利用。同时，本发明马兰提取物可显著降低乳酸引起的皮肤刺激反应，具有抗刺激、紧致肌肤、补水、保湿的功效，可广泛应用于护肤品或化妆品中。
附图说明
[0103]
图1 为实验组及对照组1、对照组2水分含量均值变化率测试结果；图2 为实验组及对照组1、对照组2水分散失均值变化率测试结果。
具体实施方式
[0104]
下面结合具体实例对本发明进行进一步阐述，但本发明并不局限于此。
[0105]
本领域的普通技术人员应当认识到，本发明并不限于所述实施例，任何对本发明的变换、变型都落入本发明的保护范围。
[0106]
下面实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述的实验材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0107]
下列实施例中，原料：马兰（市售）；产地：亳州；供应商：亳州市大西北药业有限责任公司。
[0108]
本发明中使用的试验原辅料信息如表1所示：表1试验原辅料信息名称酶活（u/g）供应商纤维素酶50000-60000诺维信（中国）生物技术有限公司胃蛋白酶3000-3500北京金泰宏达生物科技有限公司胰蛋白酶20000-40000夏盛（北京）生物科技开发有限公司木聚糖酶20000-110000夏盛（北京）生物科技开发有限公司总黄酮含量测定：采用nano
2-al(no
3
)
3
比色法测试马兰提取物中的黄酮得率，参考《gb/t 20574-2006蜂胶中总黄酮含量的测定方法分光光度比色法》。
[0109]
实施例1（1）将马兰全草烘干至恒重、粉碎、过40~60目筛（取40目筛下及60目筛上部分备用），加一定量水；（2）将步骤（1）所得马兰溶液在温度为60℃时进行超声处理，得马兰超声混悬液；（3）调节步骤（2）马兰超声混悬液的ph值，加入胃蛋白酶进行初次酶解，得马兰酶解液-；（4）调节步骤（3）马兰酶解液-的ph值，加入纤维素酶进行二次酶解，得马兰提取物；（5）90～95℃灭酶30 min，过滤得马兰提取物。
[0110]
样品1-4超声辅助复合酶解工艺具体料液比（m/m）、酶添加量（%）、酶解温度（℃）、酶解时间（min）、超声功率（w）、超声提取时间（min）如表2所示。
[0111]
表2超声辅助复合酶解工艺料液比参数优化
序号料液比(m/m)胃蛋白酶添加量（%）初次酶解ph初次酶解温度（℃）初次酶解时间(min)纤维素酶添加量（%）二次酶解ph二次酶解温度（℃）二次酶解时间(min)超声功率（w）超声提取时间(min)样品11：200.21.536.5200.55.0456030030样品21：300.21.536.5200.55.0456030030样品31：400.21.536.5200.55.0456030030样品41：500.21.536.5200.55.0456030030
样品5-8超声辅助复合酶解工艺具体料液比（m/m）、酶添加量（%）、酶解温度（℃）、酶解时间（min）、超声功率（w）、超声提取时间（min）如表3所示。
[0112]
表3超声辅助复合酶解工艺胃蛋白酶添加量参数优化
序号料液比(m/m)胃蛋白酶添加量（%）初次酶解ph初次酶解温度（℃）初次酶解时间(min)纤维素酶添加量（%）二次酶解ph二次酶解温度（℃）二次酶解时间(min)超声功率（w）超声提取时间(min)样品51：300.051.536.5200.55.0456030030样品61：300.11.536.5200.55.0456030030样品71：300.31.536.5200.55.0456030030样品81：300.51.536.5200.55.0456030030
样品9-12超声辅助复合酶解工艺具体料液比（m/m）、酶添加量（%）、酶解温度（℃）、酶解时间（min）、超声功率（w）、超声提取时间（min）如表4所示。
[0113]
表4超声辅助复合酶解工艺纤维素酶添加量参数优化
序号料液比(m/m)胃蛋白酶添加量（%）初次酶解ph初次酶解温度（℃）初次酶解时间(min)纤维素酶添加量（%）二次酶解ph二次酶解温度（℃）二次酶解时间(min)超声功率（w）超声提取时间(min)
样品91：300.31.536.5200.055.0456030030样品101：300.31.536.5200.15.0456030030样品111：300.31.536.5200.35.0456030030样品121：300.31.536.5200.45.0456030030
样品13-16超声辅助复合酶解工艺具体料液比（m/m）、酶添加量（%）、酶解温度（℃）、酶解时间（min）、超声功率（w）、超声提取时间（min）如表5所示。
[0114]
表5超声辅助复合酶解工艺超声功率参数优化
序号料液比(m/m)胃蛋白酶添加量（%）初次酶解ph初次酶解温度（℃）初次酶解时间(min)纤维素酶添加量（%）二次酶解ph二次酶解温度（℃）二次酶解时间(min)超声功率（w）超声提取时间(min)样品131：300.31.536.5200.35.0456020030样品141：300.31.536.5200.35.0456035030样品151：300.31.536.5200.35.0456040030
样品16-19超声辅助复合酶解工艺具体料液比（m/m）、酶添加量（%）、酶解温度（℃）、酶解时间（min）、超声功率（w）、超声提取时间（min）如表6所示。
[0115]
表6超声辅助复合酶解工艺超声提取时间参数优化
序号料液比(m/m)胃蛋白酶添加量（%）初次酶解ph初次酶解温度（℃）初次酶解时间(min)纤维素酶添加量（%）二次酶解ph二次酶解温度（℃）二次酶解时间(min)超声功率（w）超声提取时间(min)样品161：300.31.536.5200.35.0456030020样品171：300.31.536.5200.35.0456030040样品181：300.31.536.5200.35.0456030045样品191：300.31.536.5200.35.0456030050
对比例1（1）将马兰全草烘干至恒重、粉碎、过40-60目筛（取40目筛下及60目筛上部分备用），按料液比1：30（m/m）加水；（2）将步骤（1）所得马兰溶液在温度为60℃时进行超声处理，超声功率为300 w，超声时间为30 min，得马兰超声混悬液；（3）调节步骤（2）马兰超声混悬液ph 5.0、温度45℃，加入0.3%纤维素酶进行酶解60 min，得马兰酶解液；（4）对上述马兰酶解液90-95℃灭酶30 min，过滤得马兰提取物。
[0116]
对比例2（1）将马兰全草烘干至恒重、粉碎、过40-60目筛（取40目筛下及60目筛上部分备用），按料液比1：30（m/m）加水；（2）将步骤（1）所得马兰溶液在温度为60℃时进行超声处理，超声功率为300 w，超声时间为30 min，得马兰超声混悬液；（3）调节步骤（2）马兰超声混悬液ph 1.5、温度36.5℃，加入0.3%胃蛋白酶进行酶解20 min，得马兰酶解液；（4）对上述马兰酶解液90-95℃灭酶30 min，过滤得马兰提取物。
[0117]
对比例3（1）将马兰全草烘干至恒重、粉碎、过40-60目筛（取40目筛下及60目筛上部分备用），按料液比1：30（m/m）加水；（2）调节步骤（1）所得马兰溶液ph 1.5、温度36.5℃，加入0.3%胃蛋白酶进行初次酶解20 min，得马兰酶解液-；（3）调节步骤（2）马兰酶解液-的ph 5.0、温度45℃，加入0.3%纤维素酶进行二次酶解60 min，得马兰提取物。；
（4）对上述马兰提取物90-95℃灭酶30 min，过滤得马兰提取物。
[0118]
对比例4（1）将马兰全草烘干至恒重、粉碎、过40-60目筛（取40目筛下及60目筛上部分备用），按料液比1：30（m/m）加水；（2）将步骤（1）所得马兰溶液调整至ph 4.5、温度55℃，然后加入0.3%纤维素酶和0.3%果胶酶混匀，酶解时间90min，得马兰酶解液；（3）对上述马兰酶解液90-95℃灭酶30 min，过滤得马兰提取物。
[0119]
对比例5（1）将马兰全草烘干至恒重、粉碎、过40-60目筛（取40目筛下及60目筛上部分备用），按料液比1：30（m/m）加水；（2）将步骤（1）所得马兰溶液调整至ph 5.5、温度55℃，然后加入0.3%纤维素酶、0.3%胰蛋白酶和0.3%木聚糖酶混匀，酶解时间90min，得马兰酶解液；（3）对上述马兰酶解液90-95℃灭酶30 min，过滤得马兰提取物。
[0120]
对比例6（1）将马兰全草烘干至恒重、粉碎、过40-60目筛（取40目筛下及60目筛上部分备用），按料液比1：30（m/m）加水；（2）将步骤（1）所得马兰溶液在温度为60℃时进行超声处理，超声功率为300 w，超声时间为30 min，得马兰超声混悬液；（3）对上述马兰超声混悬液90-95℃过滤，得马兰提取物。
[0121]
对比例7（1）将马兰全草烘干至恒重、粉碎、过40-60目筛（取40目筛下及60目筛上部分备用），按料液比1：30（m/m）加水；（2）将步骤（1）所得马兰溶液调整至ph 5.0、温度45℃，然后加入0.3%纤维素酶混匀，酶解时间为60 min，得马兰酶解液；（3）对上述马兰酶解液90-95℃灭酶30 min，过滤得马兰提取物。
[0122]
对比例8（1）将马兰全草烘干至恒重、粉碎、过40-60目筛（取40目筛下及60目筛上部分备用），按料液比1：30（m/m）加水；（2）将步骤（1）所得马兰溶液调整至ph 1.5、温度36.5℃，然后加入0.3%胃蛋白酶混匀，酶解时间为20 min，得马兰酶解液；（3）对上述马兰酶解液90-95℃灭酶30 min，过滤得马兰提取物。
[0123]
实验结果：取马兰全草干燥、粉碎，过40-60目筛（取40目筛下及60目筛上部分备用），以水为提取溶剂，通过实施例1和对比例1-8工艺制备马兰提取物，并检测提取物中马兰提取物黄酮含量，测试结果如表7所示：表7马兰提取物中黄酮得率和含量序号黄酮得率（%）黄酮含量（mg/ml）样品110.835.42样品213.874.62
样品313.253.31样品413.022.60样品512.054.02样品613.984.66样品714.214.74样品814.034.68样品911.563.85样品1013.134.38样品1115.265.09样品1212.944.31样品1314.374.79样品1415.115.04样品1514.954.98样品1613.584.53样品1715.075.02样品1814.934.98样品1914.834.94对比例17.712.57对比例27.642.55对比例37.722.57对比例47.132.38对比例57.012.34对比例67.262.42对比例77.322.44对比例86.72.23以总黄酮含量及提取率为研究目标，采用超声辅助复合酶解工艺制备，考察不同料液比（m/m）、酶解温度（℃）、酶解时间（min）、超声功率（w）、超声提取时间（min）、酶添加量（%）对马兰提取物中黄酮含量及提取率的影响，马兰提取物较优的制备工艺为：料液比1:20-1:50（m/m）、胃蛋白酶添加量为0.05%-0.5%、初次酶解ph 1.0-2.5、初次酶解温度35-40℃、初次酶解时间为15-30 min、纤维素酶添加量为0.05%-0.5%、二次酶解ph 4.5-6.0、二次酶解温度40-50℃、二次酶解时间30-90 min、超声功率200-400 w、超声提取时间20-50 min，此时马兰提取物中黄酮得率为10.83-15.26%、黄酮含量为2.60-5.42 mg/ml。
[0124]
本发明采用超声辅助复合酶解工艺制备马兰提取物，可提高马兰提取物中黄酮含量。
[0125]
马兰提取物稳定性测试将不同制备方法下的马兰提取物装于80 ml塑料瓶中，在温度25
ꢀ±ꢀ
2℃、相对湿度60%
ꢀ±ꢀ
5%的条件下放置，分别于下线当天（0 d）、第2 d、7 d、14 d、30 d考察其外观状态，并将检测结果与初始状态比较。
[0126]
对比不同制备方法下所得马兰提取物的稳定性，结果见表8。
[0127]
表8马兰提取物的稳定性对比如表8所示，本发明马兰提取物在温度25
ꢀ±ꢀ
2℃、相对湿度60%
ꢀ±ꢀ
5%的条件下放置30 d，溶液外观状态澄清透明、无浑浊甚至沉淀现象，而对比例自7d起溶液外观状态逐步出现浑浊、沉淀现象，表明利用本发明超声辅助复合酶解工艺制备马兰提取物，可以提高活性物质得率，改善提取物的稳定性。
[0128]
功效检测1.抗乳酸刺激试验乳酸刺激试验主要是测试人体乳酸刺激评分，判断测试样品的抗刺激效果。
[0129]
本测试为半脸测试试验，测试样品：实验组为10%实施例1-样品11制得马兰提取物+10%乳酸；对照组1为10%对比例3制得马兰提取物+10%乳酸；对照组2为10%乳酸，待测试样品配方详见表9。
[0130]
表9测试样品配方信息表
*表示经100℃煮沸5 min放冷。
[0131]
受试者要求：24名20~60岁对乳酸有刺痛敏感肌肤人群，随机均分2组，每组人数各12人。
[0132]
乳酸刺痛试验方法：选择受试者鼻唇沟左、右测进行试验，第一组：左侧采用10%乳酸水溶液50 μl滴在直径为0.8 cm滤纸片上（对照组2），右侧采用10%乳酸加含有10%本发明实施例1-样品11制得马兰提取物（实验组）50 μl滴在直径为0.8 cm滤纸片上；第二组：左侧采用10%乳酸水溶液50 μl滴在直径为0.8 cm滤纸片上（对照组2），右侧采用10%乳酸加含有10%对比例3制得马兰提取物（对照组1）50 μl滴在直径为0.8 cm滤纸片上；分别在0 min、0.5 min、2.5 min、5.0 min、8.0 min、15 min和30 min询问受试者刺痛感，按3分法进行评分（0分为没有刺痛感，1分为轻度刺痛；2分为中度刺痛，可耐受刺痛感；3分为重度刺痛，难以忍受）。
[0133]
表10 乳酸刺激测试结果注：测试评分结果为12名志愿者算术平均值。
[0134]
由乳酸刺激测试结果（表10）可知，本发明制备的马兰提取物可显著降低乳酸引起的皮肤刺激，且效果显著优于对比例的抗刺激作用。
[0135]
2.紧致提拉
紧致具体表现为肌肤紧实、有弹性。通过评价其肌肤弹性大小评估样品的紧致作用。
[0136]
测试仪器：皮肤弹性测试仪 cutometer（mpa580，courage and khazaka，德国）基于吸力和拉伸原理测试皮肤弹性，测试时在皮肤表面产生一个负压将皮肤吸进探头内，通过非接触式的光学测试系统测量皮肤被吸进去的深度，从而评价皮肤的弹性。
[0137]
本次受试者人数n=36名，随机分为3组，每组12人。测试样品：添加5%实施例1-样品11制得的马兰提取物乳液作为实验组；添加5%对比例3制得的马兰提取物乳液作为对照组1，对照组2使用配方基质（该配方基质除了不加入马兰提取物，其余与实验样品相同），乳液配方如表11所示。
[0138]
表11 紧致提拉效果受试样品配方表使用方式：受试者每天早、晚各涂抹1次，采用皮肤弹性测试仪测定使用前、后（2周、4周、8周）脸部肌肤弹性r2、q1值。
[0139]
r2均值变化率=（使用后r2均值-使用前r2均值）/使用前r2均值
×
100%；q1均值变化率=（使用后q1均值-使用前q1均值）/使用前q1均值
×
100%。
[0140]
各样品测试结果如下表所示：表12 受试者r2、q1测试结果
相较于对照组样品，本发明马兰提取物在提升皮肤弹性方面具有明显的优势，在提升弹性、紧致皮肤等功效护肤品中可以广泛应用。
[0141]
3.补水、保湿（1）角质层水分含量测量测试仪器：corneometer cm825，德国ck公司。
[0142]
测试部位：前臂内侧。
[0143]
测试方法：选择受试者30名（25岁-55岁，男15人，女15人），分为实验组和对照组，其中实验组使用含有10%实施例1-样品11制得马兰提取物乳液（表11）；对照组1使用含10%对比例3制得马兰提取物乳液（表11）；对照组2使用配方基质（该配方基质除了不添加马兰提取物，其余与实验样品相同）乳液（表11），受试样品配方如表13所示。志愿者测试前，清洗手臂于环境湿度为40-60%，温度为20~22℃封闭环境中静坐30min后，在测试区域涂抹样品，对使用前（初始值）、使用后30 min、使用后1 h、使用后2 h和使用后4 h进行角质层水分含量的测量，评价其保湿功效。
[0144]
测试数据结果处理：单个产品的各指标在使用前后的差异性分析，如果数据呈正态分布，采用statistica软件中的dunnett分析方法，如果数据呈非正态分布，则采用spss软件中的秩和检验进行分析，同一时间点两个产品之间的差异性用t检验进行分析。
[0145]
表13角质层水分含量受试样品配方表
结论：由图1测试结果可知，实施例1-样品11制得马兰提取物可有效提高肌肤水分含量，且补水效果显著优于对照组1（对比例3制得马兰提取物）和对照组2，本发明马兰提取物在补水方面表现优异。
[0146]
（2）经皮水分流失量测量皮肤水分散失量（transepidermal water loss, tewl）反映了测试周期内，实验区域水分散失随时间的变化规律，它可以表征测试样品的锁水功能，其值越小，水分散失越少，锁水能力越强；反之，锁水能力越弱。
[0147]
测试仪器：tewameter tm 300型水分散失仪器。
[0148]
测试方法：选择受试者30名，（25岁-55岁，男15人，女15人），分为实验组和对照组，其中实验组使用含有10%实施例1-样品11制得马兰提取物乳液；对照组1使用含10%对比例3制得马兰提取物乳液；对照组2使用配方基质（该配方基质除了不加入制得马兰提取物，其余与实验样品相同），受试样品配方如表11所示。志愿者测试前，清洗手臂于环境湿度为40-60%，温度为20~22℃封闭环境中静坐30min后，测量受试者使用前（初始值）、使用后30 min、使用后1 h、使用后2 h和使用后4 h进行经皮水分流失量。
[0149]
结论：由图2所示，与对照组1（对比例3制得马兰提取物）和对照组2相比，实施例1-样品11制得马兰提取物具有更好的锁水效果。即表明本发明的马兰提取物预期可应用于保
湿补水功效化妆品中，效果优异。