清热散结片在制备防治白血病药物中的应用

本发明属于医药学技术领域，具体涉及一种清热散结片在制备防治白血病药物中的应用。

背景技术：

白血病是一种异质性血液肿瘤，克隆性白血病细胞由于增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖积累，扩散到全身各种组织与器官，导致正常造血功能受到抑制，造成免疫塌陷。随着环境污染等因素导致新诊断为白血病患者的数量迅速增加，特别是儿童白血病。目前白血病的发病率在肿瘤发病率中排第6位，在儿童和青少年恶性肿瘤的发病率和死亡率中均占首位。白血病恶性程度高，发展进程快，与实体瘤相比，白血病由于其特殊性导致其治疗仍以化疗联合骨髓移植为主。目前靶向白血病肿瘤细胞分裂的药物在治疗初期虽然有效，但是病人在临床的治疗过程中存在复发、药物抗性以及其他副作用，因此白血病仍然是最致命的疾病之一。为了满足持续不断的治疗需求，充足的抗癌药物供应必不可少。目前，临床上常用的白血病化疗药物主要分为三类：传统广谱抗肿瘤药、核苷酸类似物、分子靶向药物。但是随着临床用药的增加，相关白血病治疗药物的耐药性已成为现有肿瘤治疗成功的限定因素。因此，寻找新的抗白血病药物具有十分重要的现实意义。

清热散结片，丸剂，其现有作用：清热解毒、散结止痛，用于急性结膜炎、急性咽喉炎、急性扁桃腺炎、急性肠炎、急性菌痢、上呼吸道炎、急性支气管炎、淋巴结炎、疮疖疼痛、中耳炎、皮炎湿疹，主要成份为千里光，性状：薄膜衣片，除去薄膜衣后显深棕色，味微咸，略苦酸。

技术实现要素：

本发明的目的是针对白血病治疗困难，寻找出新的治疗白血病效果显著的药物。

针对上述目的，本发明提供了一种清热散结片作为制备防治白血病药物中的应用。

本发明在体外运用不同人白血病细胞株hel、k562、daudi、jurkat和小鼠白血病细胞株cb3检测发现，清热散结片具有显著抑制白血病细胞增殖的作用，72h半数抑制浓度ic50值分别为cb3：0.134±0.012mg/ml；jurkat：0.792±0.296mg/ml；daudi：0.775±0.052mg/ml；hel：1.027±0.625mg/ml；k562：1.756±0.406mg/ml；7702：7.153±1.073mg/ml。同时能阻断pi3k-akt、mapk、mtor和nf-kb等多个信号通路而诱导人急性淋巴细胞白血病细胞jurkat发生细胞凋亡，可作为防治白血病药物。

本发明将清热散结片直接制备成防治白血病的制剂或者与其他防治白血病的药物复配制备成防治白血病的复方制剂，其中所述的制剂可以采用药剂学上允许的口服液、注射剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂中任意一种。

本发明的有益效果如下：

与清热散结片的现有用途相比，发明人发现了清热散结片对白血病具有良好的体外抑制作用，发现了此药的新用途。而清热散结片是已上市的药物，能直接应用于人体而不再需要进行临床安全评估，具有很好的应用前景，可快速提高此产品的市场占有率。

附图说明

图1是不同浓度清热散结片对人白血病细胞hel、k562、jurkat、daudi的生长抑制率。

图2是不同浓度清热散结片对小鼠白血病细胞cb3的生长抑制率。

图3是不同浓度清热散结片对人白血病细胞jurkat生长抑制曲线图。

图4是不同浓度清热散结片对人白血病细胞jurkat凋亡的影响：图a为生理盐水对照组，图b是1mg/ml清热散结片作用jurkat细胞的凋亡结果，图c是2mg/ml清热散结片作用jurkat细胞的凋亡结果，图d是48h时清热散结片作用jurkat细胞凋亡的统计图。

图5是不同浓度清热散结片对人白血病细胞jurkat生长形态的影响。

图6是不同浓度清热散结片对人白血病细胞jurkat蛋白表达的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。

实施例1

清热散结片在制备防治白血病药物中的应用

1、体外抗白血病细胞的活性测试

(1)实验材料

样品溶液的配制：将清热散结片用生理盐水配制成浓度为200mg/ml的样品溶液，用0.45μm无菌滤器过滤后，-20℃储存备用。

5％mtt溶液的配制：称取mtt粉末0.5g，加入灭菌的pbs缓冲溶液100ml，60℃加热溶解后，用0.22μm无菌滤器过滤除菌，4℃避光保存。

细胞系：白血病细胞jurkat、k562、hel、daudi、cb3为贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室保存，人正常肝细胞7702为贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室保存。白血病细胞jurkat、k562、hel、daudi、cb3和人正常肝细胞7702于37℃5％co2培养箱中用含5％fbs的rpmi-1640培养基培养。

rpmi-1640培养基购于gibco公司，胎牛血清(fbs)购于上海启动元生物科技有限公司；四甲基偶氮哩盐(mtt)、二甲基亚飒(dmso)、bca蛋白浓度测定试剂盒、彩虹245广谱蛋白marker(pr1920)、牛血清白蛋白bsa(a8020)购于北京索莱宝科技有限公司；western及ip细胞裂解液(p0013)、sds-page蛋白上样缓冲液(5x)(p0015l)、western转膜液(p0021b)、sds-page凝胶快速配制试剂盒(p0012ac)购于上海碧云天公司；0.22μm无菌滤器、0.45μm无菌滤器、pvdf膜购于默克millipore(iseq00010)；annexinv-fitc凋亡试剂盒购于bd公司；gapdh(ab181603)、bim(ab32158)、mtor(ab32028)、erk(ab17942)、p-erk(ab201015)、parp1(ab191217)、ras(ab52939)、nf-κb(ab32536)、c-myc(ab32072)抗体购于abcam公司；pi3k(4249)、caspase8(9746)、mek1/2(8727)、p-mek1/2(9154)、akt(4685)、jnk(9252)购于cst公司；p-akt(340705)、bcl-2(380687)购于正能抗体公司。

(2)实验方法

①mtt法测定不同浓度清热散结片对白血病细胞抑制增殖作用

以1×10⁴/孔的密度，将处于指数增殖期的细胞分别接种于96孔板中，每孔90μl含5％fbs的rpmi-1640培养基，培养4h后，每孔加入10μl含不同浓度清热散结片的样品溶液，每个浓度设5个复孔，另设生理盐水对照组。细胞置于37℃培养箱内继续培养72h后，每孔加入20μl5％mtt溶液，继续培养4h后，3000rpm离心20min，弃去上清，每孔加入160μldmso，置于振荡仪上充分混匀，采用酶标仪，以490nm为测试波长、630nm为参考波长，测量各孔吸光度计算抑制率，结果见图1和表1。

表1不同细胞的半数抑制浓度(50％inhibitionconcentration,ic50)

图1的结果表明，清热散结片对人白血病细胞的生长有显著的抑制作用，且清热散结片对不同白血病细胞的生长抑制具有显著的浓度依赖性，图2的结果表明，清热散结片对小鼠白血病细胞的生长有显著的抑制作用，且同样具有浓度依赖性。由表1中的处理数据得出，72h半数抑制浓度ic50值分别为cb3：0.134±0.012mg/ml；jurkat：0.792±0.296mg/ml；daudi：0.775±0.052mg/ml；hel：1.027±0.625mg/ml；k562：1.756±0.406mg/ml；7702：7.153±1.073mg/ml。图3为清热散结片对jurkat细胞24h、48h和72h的生长抑制曲线图，结果显示，随着时间和浓度的增加，清热散结片对jurkat细胞的生长抑制作用逐渐增强。

②流式细胞仪测定细胞凋亡的变化

将对数生长期白血病细胞jurkat以1×10⁵个/ml细胞数接种于60mm培养皿，每皿3ml，37℃培养4h后，加入不同浓度的清热散结片，对照组加等量的生理盐水，分别于37℃培养48h后，收集细胞，用预冷的pbs缓冲液清洗2次，细胞用100μl预冷的bindingbuffer重悬，加入5μlfitcannexinv和5μlpi混匀，避光室温孵育15min，然后用bindingbuffer清洗一次，加入400μlbindingbuffer，用艾森novocyte流式细胞仪进行检测，每组试验单独重复三次，结果见图4。

图4的流式结果表明：清热散结片对人白血病细胞jurkat凋亡影响显著，并且药物浓度越高，其凋亡越明显。

③细胞生长形态学观察

将对数生长期白血病细胞jutkat以1×10⁵个/ml细胞数接种于60mm培养皿，每皿3ml，37℃培养4h后，加入不同浓度的清热散结片，对照组加等量的生理盐水，分别于37℃培养48h后，显微镜下观察每组细胞的生长形态并进行拍照，结果如图5所示。

图5的细胞形态图片显示，清热散结片在1mg/ml浓度时作用jurkat细胞，表现出比较明显的凋亡。

④蛋白质印迹法测定细胞蛋白的表达

将对数生长期的白血病细胞jurkat以1×10⁵个/ml细胞数接种于60mm培养皿中，每皿3ml，37℃培养4小时后，加入不同浓度的清热散结片，同时设置生理盐水对照组，37℃培养18h后，收集细胞。按照细胞数量每管加入相应体积的western及ip细胞裂解液，冰上裂解30min，4℃14000rpm离心15min，收集上清。用bca蛋白浓度测定试剂盒对上清蛋白浓度进行定量，定量后用sds-page蛋白上样缓冲液进行变性。用sds-page凝胶快速配制试剂盒配制5％浓缩胶和10％的分离胶，取50μg样品上样，进行sds-page电泳，电泳结束将蛋白条带转印至pvdf膜上。3％bsa室温封闭1h，相应单克隆抗体为一抗4℃孵育过夜，二抗孵育2h后成像。gapdh作为内参对照，odyssey红外成像系统记录结果，结果如图6所示。

图6的蛋白质印迹结果显示，清热散结片主要影响pi3k-aktsignaling、mapksignaling、mtorsignaling、apoptosissignaling、nf-kbsignaling等通路途径的蛋白表达。具体结果为：清热散结片使pi3k、mtor、akt、p-akt、p-mek1/2、p-erk、ras、jnk、bcl-2、nf-κb、c-myc蛋白的表达下调，同时使mek1/2、erk、caspase8、bim、parp1蛋白的表达上调。

由以上结果可知，清热散结片在制备防治白血病药物或白血病细胞增殖抑制剂方面具有潜在价值。