环黄芪醇的医药用途的制作方法

1.本发明属于医药领域，涉及环黄芪醇的医药用途，具体涉及环黄芪醇在制备预防或治疗慢性阻塞性肺病药物中的用途。


背景技术：

2.慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，copd)是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和(或)肺气肿，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。该疾病与有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关，致残率和病死率很高，全球40岁以上发病率已高达9％～10％。慢性阻塞性肺病的确切病因不清楚，一般认为与慢性支气管炎和阻塞性肺气肿发生有关的因素都可能引起慢性阻塞性肺病的发病。已经发现的危险因素大致可以分为外因(即环境因素)与内因(即个体易患因素)两类。外因包括吸烟、粉尘和化学物质的吸入、空气污染、呼吸道感染及其他因素。内因包括遗传因素、气道反应性增高、在怀孕期、新生儿期、婴儿期或儿童期由各种原因导致肺发育或生长不良的个体。
3.慢性阻塞性肺病发病中，稳定期与急性加重期交替出现。慢性阻塞性肺病急性加重期是指在疾病的过程中，短期内咳嗽，咳痰，气短和/或喘息加重，痰量增多，呈脓性或黏液脓性，可伴发热等症状。
4.目前临床上用于治疗慢性阻塞性肺病的药物有支气管舒张药，常用的短效β2肾上腺素受体激动剂为沙丁胺醇和特布他林，常用的长效β2肾上腺素受体激动剂有沙美特罗和福莫特罗，另外还有抗胆碱类药物和茶碱类药物。支气管扩张药可以改善慢性阻塞性肺病的症状，稳定肺功能，但对肺部的炎性症状无治疗作用。针对慢性阻塞性肺病病因的药物有抗炎类，如糖皮质激素，目前临床常用的有布地奈德、二丙酸倍氯米松、曲安奈德、丙酸氟替卡松、氟尼缩松、糠酸莫米松和环索奈德等，联合支气管扩张药，吸入治疗慢性阻塞性肺病和支气管哮喘，但效果不及治疗哮喘理想。因此开发新的治疗药物成为发展的必然。
5.黄芪为豆科植物蒙古黄芪astragalus membranaceus(fisch.)bge.var.mongholicus(bge.)hsiao或膜荚黄芪a.membranaceus(fisch.)bge.的干燥根。黄芪作为一味传统的扶正中药，具有补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水消肿等功效，一直以来被用来增强机体免疫。黄芪化学成分主要有皂苷类、黄酮类、多糖类等，近年来对其药理作用的研究取得了较大进展，特别是在免疫调节、保护心脏、降血糖、保肝等方面。
6.环黄芪醇(cycloastragenol，cag)为从黄芪中分离得到的一种三萜皂苷类化合物，其化学结构式如下：
[0007][0008]
中国专利cn103880910a公开了一种环黄芪醇的制备方法及其在制备抗癌辅助治疗药物中的应用。中国专利cn101116667a公开了环黄芪醇可有效治疗和预防免疫异常性疾病。有文献报道环黄芪醇具有抗衰老的作用(曹艳玲，李文兰，韦灵玉等，环黄芪醇对d-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用，中国实验方剂学杂志，2012，18(19)：208-211)。魏宝红等研究了环黄芪醇连续灌胃对大鼠肝脏p450酶活性的影响，结果表明环黄芪醇对cyp3a4亚酶具有明显的抑制作用，对cyp2e1亚酶显示出显著的诱导作用(魏宝红，叶静，薛宝娟等，环黄芪醇连续灌胃对大鼠肝脏p450酶活性的影响，中国新药杂志，2014，23(4)：476-479)。
[0009]
但迄今为止，未见有关环黄芪醇抗慢性阻塞性肺病活性的报道。


技术实现要素：

[0010]
本发明人申请人长期致力于环黄芪醇的药理活性的研究，本发明人经过大量的药理学实验研究意外地发现，环黄芪醇在制备预防或治疗慢性阻塞性肺病药物方面具有显著的活性。
[0011]
慢性阻塞性肺病发病中，稳定期与急性加重期交替出现。慢性阻塞性肺病稳定期治疗主要依靠吸入性激素控制炎症反应，但吸入性激素在抑制机体免疫，增加感染风险方面存在不可避免的缺陷。急性加重期时患者在原有症状的基础上出现呼吸困难、咳嗽和/或咯痰明显加重，加速肺功能恶化，引发严重的并发症，甚至死亡。因此，预防急性加重，加强稳定期有效干预是改善慢性阻塞性肺病患者预后的关键。
[0012]
慢性阻塞性肺病的治疗并非固定的，主要根据患者病情的严重程度来进行分级治疗。迄今，慢性阻塞性肺病没有特效根治方法。并且慢性阻塞性肺病需要进行长期治疗，因此，治疗药物的安全性尤为重要。
[0013]
本申请的目的之一在于提供一种环黄芪醇的新用途，即环黄芪醇在制备预防或治疗慢性阻塞性肺病药物中的应用。
[0014]
本发明人研究发现环黄芪醇对于慢性阻塞性肺病具有显著的治疗效果。
[0015]
进一步地，环黄芪醇可用于慢性阻塞性肺病稳定期的治疗。
[0016]
进一步地，环黄芪醇可用于慢性阻塞性肺病急性加重期的治疗。
[0017]
本发明实施例10实验表明本发明的环黄芪醇能够能够改善慢性阻塞性肺疾病大鼠一般状态，增加其体重，改善大鼠肺功能。
[0018]
本发明实施例11实验表明，环黄芪醇的生物利用度高，表明在成药性方面环黄芪醇具有明显的技术优势。
[0019]
此外，本发明所述环黄芪醇是从传统中药黄芪中提取得到的天然中药单体，其对
人体毒副作用低，可以显著提高患者的用药安全性和用药依从性，适合慢性阻塞性肺病患者的长期治疗用药，意义重大。
[0020]
本发明所述的医药用途中，环黄芪醇可以制备成合适的药物剂型口服给药或注射给药，其适用对象可以为人或其他恒温动物。优选地，环黄芪醇可以制备成合适的药物剂型皮下注射或肌肉注射。当适用对象为人时，环黄芪醇的用量优选为0.001mg/kg
·
d～50mg/kg
·
d，进一步优选为0.01mg/kg
·
d～10mg/kg
·
d。对于本发明预防或治疗慢性阻塞性肺病的药物的给药时间和给药次数需要根据病情的具体诊断结果而定，这在本领域技术人员掌握的技术范围之内。例如，将对大鼠预防或治疗慢性阻塞性肺病的治疗方案应用于人身上，所用药物对人的有效剂量可以通过该药物对大鼠的有效剂量进行换算，这对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
[0021]
上述所述的医药用途中，根据动物病情以及用药部位可以将环黄芪醇制备成合适的药物制剂以方便用药，如环黄芪醇可以开发成口服制剂、舌下含服制剂或注射制剂方便患者的使用，其中所述口服制剂可以为片剂、胶囊剂或微乳制剂，优选为片剂；所述舌下含服制剂为含有环黄芪醇并适用舌下给药的药物制剂，优选为其舌下片；所述注射制剂可以为其注射液、注射微球等，优选为注射液。当环黄芪醇制备成注射液时，药物可接受的载体可以为注射用水、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸、甘油、乙醇、丙二醇等。上述所述环黄芪醇注射液还可以根据药物的性质加入适宜的附加剂，如渗透压调节剂、ph值调节剂、增溶剂、治疗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂等，其中所述增溶剂为聚乙二醇400、吐温-80中的任意一种或两种。
[0022]
上述药物制剂的制备方法均可采用本领域技术人员制备该种剂型常规使用制备方法制得。上述药物制剂中，每一制剂单位中含有环黄芪醇的含量为0.001mg～50mg。
[0023]
与现有技术相比，本发明的优势在于：
[0024]
1、本发明所述的环黄芪醇具有显著的预防或治疗慢性阻塞性肺病的作用。本发明实施例10实验表明本发明的环黄芪醇能够能够改善慢性阻塞性肺疾病大鼠一般状态，增加其体重，改善大鼠肺功能。本发明实施例11实验表明，环黄芪醇的生物利用度明显高于黄芪甲苷，这表明环黄芪醇在成药性方面具有明显的技术优势。
[0025]
2、本发明所述环黄芪醇是从传统中药黄芪中提取得到的天然中药单体，其对人体毒副作用低，可以显著提高患者的用药安全性和用药依从性，进而大幅度改善了慢性阻塞性肺病患者的治疗效果和生活质量。
具体实施方式
[0026]
以下通过具体实施方法进一步描述本发明，但本发明的应用范围不仅仅限于下列实施例。在本发明的内容、精神和/或范围内，对本发明技术特征的替换和/或组合，对本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明之中。
[0027]
实施例1环黄芪醇注射液
[0028][0029]
制备工艺：将处方量的丙二醇和乙醇混合均匀，加入环黄芪醇，搅拌溶解，加入处方量的0.9％氯化钠溶液，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。
[0030]
实施例2环黄芪醇注射液
[0031][0032]
制备工艺：向处方量的peg-400加入环黄芪醇，搅拌溶解，加入0.9％氯化钠溶液至10l，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。
[0033]
实施例3环黄芪醇注射液
[0034][0035]
制备工艺：将处方量的乙醇和吐温-80混合均匀，加入环黄芪醇，搅拌溶解，加入注射用水至10l，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。
[0036]
实施例4环黄芪醇注射液
[0037]
环黄芪醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.01g
[0038]
乙醇
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3.3l
[0039]
注射用水
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加至10l
[0040]
制备工艺：将处方量的乙醇加入环黄芪醇，搅拌溶解，加入注射用水至10l，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。
[0041]
实施例5环黄芪醇片剂
[0042][0043]
制备工艺:将环黄芪醇和辅料微晶纤维素、羧甲基淀粉钠混合均匀，加入适量的淀粉浆制软材，然后过16目筛制粒。湿颗粒在60℃干燥，干颗粒过20目筛整粒，筛出干粒中的
细粉，与硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混匀，压片，每片约200mg，即得。
[0044]
实施例6环黄芪醇片剂
[0045][0046][0047]
制备工艺：上述组分烘干、粉碎过筛预处理后混匀直接压片制得。
[0048]
实施例7环黄芪醇片剂
[0049][0050]
制备工艺：将主药及各辅料成分烘干、粉碎过筛预处理，将主药、乳糖、羧甲基纤维素钠混匀，以纯水作为粘合剂将混匀的物料制备软材，过20目筛制粒并于60℃下干燥制备干颗粒，将硬脂酸镁加入到上述干颗粒总混，压片即得。
[0051]
实施例8环黄芪醇微乳浓缩物
[0052][0053]
制备工艺：称取处方量中链脂肪酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油el-40、1，2-丙二醇、无水乙醇，混合后搅拌均匀，然后加入环黄芪醇溶解，也可以超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，即为环黄芪醇微乳浓缩物。上述微乳浓缩物可进一步稀释用于注射或口服。
[0054]
实施例9环黄芪醇微乳浓缩物
[0055][0056]
制备工艺：称取处方量peg-2-硬脂酸酯、吐温-20、1-己醇、peg3350混合后搅拌均匀，然后加入环黄芪醇溶解，也可以超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，即为环黄芪醇微乳浓缩物。上述微乳浓缩物可以根据用药需要进行进一步稀释用于患者注射给药或口服给药。
[0057]
实施例10环黄芪醇对慢性阻塞性肺病大鼠的药效实验研究
[0058]
1.1慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立
[0059]
烟熏箱
[0060]
自制，由纸箱密封而成，容积为48l(60cm
×
40cm
×
20cm)，箱体分为上下两层，中间以小孔径铁网相隔，上层放置大鼠，下层放置点燃香烟，同时上层箱体前后两侧各有一直径为3cm的通风孔，下层箱体前侧有一直径为6cm的放烟孔。
[0061]
造模
[0062]
将40只wistar雄鼠随机均分为5组：正常对照组、模型对照组、环黄芪醇低剂量组、环黄芪醇高剂量组、黄芪甲苷组。第1及14天，除对照组外，其余组大鼠均采用10％水合氯醛溶液(3-4ml/kg)腹腔注射麻醉，待麻醉后暴露气管，并使用1ml注射器向气管中快速注入200ul lps(脂多糖)(1mg/ml)，完成后迅速将大鼠直立旋转10-20s，使lps溶液均匀分布于两肺中，为避免感染，在切口处涂抹少量青霉素钠并缝合；进行第2-13天和第15-28天，除正常对照组外，其余组大鼠均置于自制烟熏箱中持续熏香烟烟雾，香烟12支/次、30min/次、2次/d，中间间隔2h，为减少香烟燃烧所产生的水蒸气对大鼠的影响，在箱底放置适量变色硅胶干燥剂。
[0063]
1.2给药方式
[0064]
环黄芪醇1g，研磨、用0.5％的cmc-na(羧甲基纤维素钠)配制成10mg/ml的混悬溶液，从第1天开始，每天灌胃给药1次，连续给药28天。
[0065]
各组动物给药剂量如下：
[0066]
环黄芪醇低剂量组：1mg/kg环黄芪醇；
[0067]
环黄芪醇高剂量组：10mg/kg环黄芪醇；
[0068]
黄芪甲苷组：10mg/kg黄芪甲苷；
[0069]
以上药物均0.5％羧甲基纤维素钠混悬。
[0070]
正常对照组：等体积的羧甲基纤维素钠；
[0071]
模型对照组：等体积的羧甲基纤维素钠。
[0072]
1.3大鼠肺功能相关指标检测
[0073]
第29天，采用10％水合氯醛溶液腹腔麻醉大鼠，然后暴露气管，将一y形管插入气管中，并将肺功能测定仪的微气压传感器连接在y形管一端，流量传感器则连接在另一端，
同时将压力传感器插入大鼠食道中，当食道压显示为负值时即可测定大鼠的每分钟通气量(ve)、呼气峰值流速(pef)、肺动态顺应性(c
l
)、气道阻力(r
l
)。
[0074]
2.1实验结果
[0075]
2.1.1一般状态及体重变化
[0076]
正常对照组大鼠活泼好动，状态良好；模型对照组大鼠活动量明显减少，精神懈怠，且出现明显气喘；环黄芪醇低、高剂量组活动量有所增加，精神状态好转，且气喘程度减轻。
[0077]
第0d，各组大鼠体重无显著性差异；第4周，环黄芪醇低剂组、高剂组体重均大于模型对照组，且两给药组与模型对照组间均具有显著性差异。上述观察结果表明，环黄芪醇组能够改善慢性阻塞性肺病大鼠一般状态，增加其体重。
[0078]
与黄芪甲苷组相比，环黄芪醇高剂量组、环黄芪醇低剂量组大鼠体重改善效果更好。
[0079]
各组大鼠体重变化情况如表1所示。
[0080]
表1各组大鼠体重变化情况(g)
[0081][0082]
与模型对照组相比，
#
p<0.05，
##
p<0.01；
[0083]
与黄芪甲苷组相比，
&
p<0.05。
[0084]
2.1.2肺功能相关指标
[0085]
模型对照组每分钟通气量(ve)、呼气峰值流速(pef)、肺动态顺应性(c
l
)均低于对照组，气道阻力(r
l
)则高于对照组，且两给组间具有显著性差异，表明模型对照组通气量减小，气道阻力增大，肺功能出现明显降低。
[0086]
环黄芪醇低、高剂量组ve、pef、c
l
均高于模型组，r
l
则低于模型对照组，且两给药组与模型对照组间均具有显著性差异，表明环黄芪醇给药组均能改善大鼠肺功能。
[0087]
与黄芪甲苷组相比，环黄芪醇高剂量组、环黄芪醇低剂量组指标改善效果更好。
[0088]
各组大鼠肺功能相关指标结果如表2所示。
[0089]
表2各组大鼠肺功能相关指标
[0090][0091]
与模型对照组相比，
#
p<0.05，
##
p<0.01；
[0092]
与黄芪甲苷组相比，
&
p<0.05。
[0093]
综上所述，环黄芪醇具有预防和/或治疗慢性阻塞性肺病疾病的功效。
[0094]
实施例11环黄芪醇生物利用度的测定
[0095]
1.动物分组及给药
[0096]
60只wistar大鼠(220
±
30)g，雌雄各半，由山东新时代药业有限公司实验动物中心提供，生产许可证号：scxk(鲁)20060019。在温度20～22℃，相对湿度45％～65％，光照/黑暗12h/12h条件下饲养，自由饮食、饮水。
[0097]
灌胃给药组：将已禁食12小时自由饮水的健康wistar大鼠30只，雌雄各半，分为5组，黄芪甲苷组(灌胃给予黄芪甲苷)，环黄芪醇组(灌胃给予环黄芪醇)。各组单次灌胃给药，给药剂量为20mg/kg。给药前12h禁食，自由饮水。分别于给药前(0h)、给药后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12和24h眼眶后静脉丛取血300μl左右，肝素抗凝，4℃12000rpm条件下离心5min，分离血浆，保存于-20℃低温冰箱中。实验期间自由饮水，灌胃后2h进食。
[0098]
静脉给药组：将已禁食12小时自由饮水的健康wistar大鼠30只，雌雄各半，分为5组，黄芪甲苷组(注射给予黄芪甲苷)，环黄芪醇组(注射给予环黄芪醇)。各组尾静脉注射给药，给药剂量为3mg/kg。分别于给药前(0h)、给药后0.033、0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12和24h眼眶后静脉丛取血300μl左右，肝素抗凝，4℃12000rpm条件下离心5min，分离血浆，保存于-20℃低温冰箱中。实验期间自由进食与饮水。
[0099]
2.血浆样品测定
[0100]
将所有经处理过的血浆样品，进行uplc-ms/ms定量分析，测定血浆药物浓度。
[0101]
3.生物利用度的计算
[0102]
将测定的血药浓度－时间数据用das软件(drug and statistics，中国数学药理学会，孙瑞元等编制)计算药动学参数。根据公式计算环黄芪醇的绝对生物利用度，t为最后可实测药物浓度的采样时间。
[0103][0104]
4.环黄芪醇的绝对生物利用度
[0105]
表3环黄芪醇生物利用度
[0106][0107]
由上表可以看出，环黄芪醇的生物利用度明显高于黄芪甲苷，这表明在成药性方面环黄芪醇具有明显的技术优势。
[0108]
本发明人进行了环黄芪醇的重复给药毒性实验和生殖发育毒性实验，结果表明环黄芪醇经口给药70天对sd大鼠无明显毒性。
[0109]
实施例12环黄芪醇大鼠重复给药毒性实验
[0110]
环黄芪醇为已知的端粒体酶激活剂，而文献报道端粒体酶激活剂可能有潜在的致癌风险，本试验旨在考察环黄芪醇的重复给药毒性。
[0111]
试验结果发现，在本试验条件下，sd大鼠在妊娠第0-20天连续静脉注射环黄芪醇10mg/kg/d，环黄芪醇未引起大鼠母体毒性。
[0112]
1.动物分组及给药
[0113]
检疫期结束后，全部检疫合格动物进入试验。称量动物体重，按照体重进行随机分组，动物分为溶媒对照组和受试物组，每组至少50只，雌雄各半。
[0114]
每只动物给予唯一编号，以识别个体。组间标识，采用动物笼卡，其中受试物组采用红色笼卡，溶媒对照组采用蓝色笼卡。
[0115]
根据前期的毒代动力学预实验结果，设置剂量为最大暴露剂量的最低剂量，即10mg/kg/d。溶媒对照组给予同等体积的溶媒对照。
[0116]
给药途径：注射给药，每天1次。雄性大鼠分组后开始给药，连续给药70天；雌性大鼠分组2周后开始给药，连续给药70天。
[0117]
每周称量1次体重，按照最新体重注射给药。
[0118]
2.观察与检查
[0119]
2.1一般观察
[0120]
每天至少观察1次，观察内容包括但不限于动物被毛、精神状态、活动、分泌物等。
[0121]
2.2体重
[0122]
存活动物每周至少称量1次。
[0123]
2.3解剖检查
[0124]
2.3.1雄鼠解剖检查
[0125]
随机抽取10只大鼠，进行血常规、血生化、骨髓涂片检查，摘取全套脏器进行组织病理学检查。
[0126]
2.3.2雌鼠解剖
[0127]
随机抽取10只大鼠，进行血常规、血生化、骨髓涂片检查，摘取全套脏器进行组织
病理学检查。
[0128]
3.试验结果
[0129]
3.1动物死亡及濒死
[0130]
给药期间，溶媒对照组和环黄芪醇组分别有3只和5只动物死亡或濒死，部分上述动物剖检可见下述症状中的部分或全部：鼻腔有白色泡沫、食管破损、气管出血、胸腔积液、肺脏肿大；镜检发现肺泡腔内充满均质白色浆液，和/或肺泡细胞变性坏死等异常形态；结合动物体征观察，胸部有肿块或者化脓症状。
[0131]
3.2一般状态
[0132]
环黄芪醇未引起动物一般状态的异常改变。
[0133]
试验期间，除死亡和濒死动物外，其它动物一般状态良好，自主活动正常，精神状态良好，未见供试品相关的毒性症状。
[0134]
表4环黄芪醇重复注射给药对雄性大鼠一般体征的影响
[0135][0136]
表5环黄芪醇重复注射给药对雌性大鼠一般体征的影响
[0137][0138]
3.3体重
[0139]
环黄芪醇未引起大鼠体重的异常改变。
[0140]
给药期间，环黄芪醇组雄性大鼠体重稳步增长，与溶媒对照组相比没有差异(p>0.05)；环黄芪醇组雌性大鼠体重稳步增长，其中给药第26天和给药第47天的体重与溶媒对照组相比有显著性差异(p≤0.05)，给药期间其他时间点体重与溶媒对照组相比均无差异(p>0.05)。上述体重增重差异虽有统计学意义，但不具有量效关系和时效关系，认为是数据的正常波动，不具有毒理学意义。
[0141]
表6环黄芪醇重复注射给药对雄性大鼠体重的影响
[0142][0143][0144]
表7环黄芪醇重复注射给药对雌性大鼠体重的影响
[0145][0146]
注：*与溶媒对照组比较有统计学意义(p≤0.05)。
[0147]
3.4血液学
[0148]
与溶媒对照组相比，环黄芪醇组血液学有以下改变：
[0149]
环黄芪醇组：雄鼠pdw、mpv、p-lcr降低；孕鼠rdw-sd、rdw-cv升高，pdw、mpv降低，以上差异均有统计学差异(p≤0.05)。
[0150]
环黄芪醇组雄鼠pdw、mpv、p-lcr，孕鼠rdw-sd、rdw-cv、pdw、mpv指标差异虽有统计学意义，但变化幅度多小于10％，且个体动物的上述指标变化没有明显的内在关联，认为是数据的正常波动。
[0151]
表8环黄芪醇注射给药对雄鼠血液学的影响
[0152][0153]
[0154][0155]
注：*与溶媒对照组比较有统计学意义(p≤0.05)。
[0156]
表9环黄芪醇注射给药对妊娠雌鼠血液学的影响
[0157][0158]
注：*与溶媒对照组比较有统计学意义(p≤0.05)。
[0159]
3.5血液生化学
[0160]
与溶媒对照组相比，环黄芪醇组血液生化学有以下改变：
[0161]
环黄芪醇组：雄鼠ast、ck-mb、ck、ldh降低，γ-gt升高；孕鼠t-bil-v降低，ldl-c、hdl-c、tc、urea、glu-g升高，以上差异均有统计学差异(p≤0.05)。
[0162]
环黄芪醇组雄鼠ast、ck-mb、ck、ldh、γ-gt，孕鼠-bil-v、ldl-c、hdl-c、tc、urea、glu-g指标差异虽有统计学意义，但个体动物的上述指标变化没有明显的内在关联，认为是数据的正常波动，不是供试品的毒性作用。
[0163]
表10环黄芪醇注射给药对雄鼠血液生化学的影响
[0164][0165][0166]
注：*与溶媒对照组比较有统计学意义(p≤0.05)。
[0167]
表11环黄芪醇注射给药对雌鼠血液生化学的影响
[0168][0169]
注：*与溶媒对照组比较有统计学意义(p≤0.05)。
[0170]
在本实验条件下，sd大鼠70天重复注射给予环黄芪醇未发现动物的异常改变，其最大无作用剂量(noel)高于10mg/kg/d。
[0171]
实施例13环黄芪醇大鼠生殖发育毒性实验
[0172]
试验结果发现，在本试验条件下，sd大鼠在妊娠第0-20天连续注射给予环黄芪醇10mg/kg/d，环黄芪醇未引起大鼠胚胎-胎仔发育毒性，黄芪甲苷静脉注射剂量1.0mg/kg有一定的胚胎毒性。本发明的环黄芪醇较黄芪甲苷具有更高的安全性。
[0173]
1.动物分组及给药
[0174]
检疫期结束后，全部检疫合格动物进入试验。称量动物体重，按照体重进行随机分组，动物分为溶媒对照组和受试物组，每组至少50只，雌雄各半。
[0175]
每只动物给予唯一编号，以识别个体。组间标识，采用动物笼卡，其中受试物组采用红色笼卡，溶媒对照组采用蓝色笼卡。
[0176]
根据前期的毒代动力学预实验结果，设置剂量为最大暴露剂量的最低剂量，环黄
芪醇静脉注射10mg/kg/d。溶媒对照组给予同等体积的溶媒对照。黄芪甲苷剂量为1.0mg/kg/d。
[0177]
溶媒对照组(0.85％生理盐水1/4稀释的1：1丙二醇一乙醇)。
[0178]
给药途径：尾静脉注射给药，每天1次。雄性大鼠分组后开始给药，连续给药10周后继续给药至交配结束解剖；雌性大鼠分组2周后开始给药，连续给药至妊娠第15天。
[0179]
每周称量1次体重，按照最新体重注射给药。
[0180]
2.观察与检查
[0181]
2.1试验方法：大鼠标准致畸试验(中华人民共和国药政局.新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学，药理，毒理学)[s].1993.印木泉，陈耀富，蔡东联，等.胎鼠骨骼的快速染色法[j].中华劳动卫生职业病杂志，1985，3(1)：130—132.)。
[0182]
2.2观察指标：分娩前一天剖杀动物(gd20)，观察母体孕期体重变化，黄体数、活胎率、死胎率、吸收胎率，胎儿身长、体重和胎盘重，胎儿外观和内脏畸形、以及骨骼的发育情况。
[0183]
3.试验结果
[0184]
3.1试验中，观察了活胎率、死胎率和吸收胎率的情况，发现黄芪甲苷在1.0mg/kg剂量时sd大鼠的活胎率和死胎率与对照组比较差异具有统计学意义，表现为活胎率降低和死胎率升高，表明在1.0mg/kg剂量时对sd大鼠有一定胚胎毒性。
[0185]
环黄芪醇组与黄芪甲苷组相比，活胎率升高和死胎率降低。环黄芪醇组与对照组相比没差异具有统计学意义。环黄芪醇即使剂量为10mg/kg，并未呈现出胚胎毒性。
[0186]
表12黄芪甲苷和环黄芪醇对孕鼠和胎鼠的影响
[0187][0188]
与溶媒对照组相比，*p≤0.05；与黄芪甲苷组相比，
&
p≤0.05。
[0189]
3.2黄芪甲苷在1.0mg/kg剂量下对胎鼠无胎儿毒性。环黄芪醇在10mg/kg剂量下对胎鼠无胎儿毒性。
[0190]
表13黄芪甲苷和环黄芪醇对胎数生长发育的影响(x
±
s)
[0191][0192]
与黄芪甲苷组相比，
&
p≤0.05。
[0193]
3.3黄芪甲苷在1.0mg/kg剂量下对胎鼠的发育无明显影响。。环黄芪醇在10mg/kg剂量下对胎鼠的发育无明显影响。
[0194]
表14黄芪甲苷和环黄芪醇对胎鼠骨骼发育的影响
[0195][0196]
4.讨论
[0197]
在本实验条件下，sd大鼠在妊娠第0-20天连续注射给予环黄芪醇10mg/kg/d，环黄芪醇未引起大鼠母体毒性和胚胎-胎仔发育毒性，而黄芪甲苷静脉注射剂量1.0mg/kg/d表现出一定的胚胎毒性。