一种羧甲基几丁质溶液的湿热灭菌方法与流程

1.本发明涉及生物医药材料技术领域，一种羧甲基几丁质溶液的湿热灭菌灭菌方法。


背景技术：

2.羧甲基几丁质是一种天然的高分子多糖，具有良好的生物相容性和其他生物特性，包括止血、抗菌、防粘连等，已被广泛应用于生物医用制剂的制备中。对于羧甲基几丁质制剂的灭菌方法，未经交联处理的羧甲基几丁质及其衍生物缺乏三维立体网络结构，采用最终灭菌工艺(包括湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌等) 易于造成聚合物链的降解，对制剂的基本性质造成很大影响，所以常采用无菌生产工艺控制羧甲基几丁质制剂的无菌保证水平。但是无菌生产工艺对质量控制水平要求更加严格，也增加了残存微生物污染的风险。利用化合物进行灭菌，常用的化合物如氧化剂、醛类化合物可能残留在制剂中，具有一定的毒性。因此，目前羧甲基几丁质无菌制剂的灭菌方法仍有待进一步改善。
3.近年来，很多学者对天然高分子的灭菌和提高热稳定性的新型方法进行了深入的研究。cn106963958b公开了一种多糖水溶液的灭菌方法，将β-内酯添加到多糖水溶液中，混合物在4℃至40℃的温度下储存至少24小时。其中，β-内酯可将多糖水溶液中的耐受性iii级的内生孢子灭活，与伽玛辐射灭菌相比，未引起多糖的显著降解。此外，很多文献报道了提高多糖热稳定性的方法。 cn108610518a公开了一种基于聚乙烯醇与环聚多糖的超分子组装体的制备方法，以聚乙烯醇为客体分子，环聚多糖为主体分子，采用相扩散法，利用高低温驱动分子运动的机理制备超分子组装体，显著提高了热稳定性。
4.从无菌保证水平来说，湿热灭菌是决策树中首先考虑的灭菌工艺，如何保证羧甲基几丁质制剂的耐湿热灭菌性质成为了一大难题。到目前为止，仍未出现未交联的羧甲基几丁质制剂的湿热灭菌方法。羧甲基几丁质为甲壳素脱乙酰后的产物，分子结构中包含大量的氨基基团，可与羧基、羟基等基团之间形成氢键，提高分子结构的稳定性。多元醇如甘露醇、山梨糖醇等，其分子结构中含有高密度的羟基，易溶于水，毒性小，常作为食品添加剂使用。因此，以多元醇作为羧甲基几丁质制剂的湿热灭菌稳定剂，通过两者之间形成的氢键作用，可稳定羧甲基几丁质的分子结构，保护分子链的完整性使其耐受高温降解。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种羧甲基几丁质溶液的湿热灭菌方法。通过添加多元醇灭菌稳定剂，使羧甲基几丁质和多元醇分子间形成可逆的氢键，减少高温高压对羧甲基几丁质分子链的破坏，提高羧甲基几丁质的灭菌稳定性，保证了羧甲基几丁质制剂的无菌水平。
6.本发明所述的一种羧甲基几丁质溶液的湿热灭菌方法，其特征在于包括以下步骤：
7.(1)将多元醇以一定比例添加入一定浓度的羧甲基几丁质溶液中并溶解均匀；
8.(2)将步骤(1)中溶解均匀的羧甲基几丁质-多元醇混合溶液置于压力蒸汽灭菌器
中，在一定温度下灭菌处理一定时间。
9.步骤(1)中所述的多元醇为分子中含有三个或三个以上羟基的醇类，其通式为c
nh2n+2-x
(oh)
x
(x≥3)，如甘露醇、山梨糖醇等。
10.步骤(1)中，多元醇与羧甲基几丁质的摩尔比为1:1～2:1。
11.步骤(1)中，羧甲基几丁质的质量浓度为1％～5％。
12.步骤(1)中，溶液为磷酸盐缓冲溶液，ph值为6.5～7.5，渗透压为 280～350mosm/kg。
13.步骤(2)中，所述的灭菌温度为120～122℃。
14.步骤(2)中，所述的灭菌时间为12～18分钟。
15.本发明的优点：
16.(1)通过添加多元醇灭菌稳定剂，使羧甲基几丁质和多元醇分子间形成可逆的氢键，增强羧甲基几丁质分子结构的稳定性，减少高温高压对羧甲基几丁质分子链的破坏，提高羧甲基几丁质的灭菌稳定性。
17.(2)目前未交联的羧甲基几丁质制剂的湿热灭菌方法未见报道。本发明提供的羧甲基几丁质溶液的湿热灭菌方法，可替代常规的无菌生产工艺，提高了制剂的无菌保证水平，步骤简单，利于产业化应用。
附图说明：
18.图1为实施例一中灭菌前2％羧甲基几丁质溶液(甘露醇：羧甲基几丁质摩尔比为1.5:1)的动力粘度。
19.图2为实施例一中灭菌后2％羧甲基几丁质溶液(甘露醇：羧甲基几丁质摩尔比为1.5:1)的动力粘度。
20.图3为实施例一中灭菌前羧甲基几丁质(甘露醇：羧甲基几丁质摩尔比为1.5:1) 的多角激光散射图谱。
21.图4为实施例一中灭菌后羧甲基几丁质(甘露醇：羧甲基几丁质摩尔比为1.5:1) 的多角激光散射图谱。
22.图5为对比例一中未添加多元醇的2％羧甲基几丁质溶液的灭菌前的动力粘度。
23.图6为对比例一中未添加多元醇的2％羧甲基几丁质溶液的灭菌后的动力粘度。
24.图7为对比例一中未添加多元醇的羧甲基几丁质的灭菌后的多角激光散射图谱。
25.图8为对比例二中19.2mg/ml的甘露醇溶液的灭菌前的动力粘度。
具体实施方式
26.现结合实施例和对比例，对本发明作了详细描述：
27.实施例一
28.称取一定质量的羧甲基几丁质干粉、甘露醇，羧甲基几丁质的质量浓度为2％，甘露醇的质量浓度为19.2mg/ml，甘露醇：羧甲基几丁质的摩尔比为1.5:1，均匀混合，以ph值为7.2、渗透压为320mosm/kg的磷酸盐缓冲液溶解均匀，而后置于压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，灭菌温度为121.3℃，灭菌时间为15分钟。灭菌到达时间后进行排气，待温度自然降至60℃后取出样品，得到灭菌后的羧甲基几丁质溶液。
29.取本实施例中灭菌前后的羧甲基几丁质溶液，采用流变仪测试两种溶液的动力粘度。如图1和2所示，经过湿热灭菌后，10.0hz的剪切速率下羧甲基几丁质溶液的灭菌前后的动力粘度分别为4510和3650mpa
·
s，灭菌后动力粘度比灭菌前仅降低了19.1％。
30.取本实施例中灭菌前后的羧甲基几丁质溶液，采用多角激光散射仪测定灭菌前后羧甲基几丁质的重均分子量。如图3和4所示，灭菌前后羧甲基几丁质的分子量分别为710kda和645kda，灭菌后分子量比灭菌前仅降低了9.15％。
31.实施例二
32.称取一定质量的羧甲基几丁质干粉、甘露醇，羧甲基几丁质的质量浓度为2％，甘露醇的质量浓度为12.8mg/ml，甘露醇：羧甲基几丁质的摩尔比为1:1，均匀混合，以ph值为7.2、渗透压为320mosm/kg的磷酸盐缓冲液溶解均匀，而后置于压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，灭菌温度为121.3℃，灭菌时间为15分钟。灭菌到达时间后进行排气，待温度自然降至60℃后取出样品，得到灭菌后的羧甲基几丁质溶液。
33.对比例一
34.称取一定质量的羧甲基几丁质干粉，以ph值为7.2、渗透压为320mosm/kg 的磷酸盐缓冲液溶解均匀，羧甲基几丁质的质量浓度为2％。而后置于压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，灭菌温度为121.3℃，灭菌时间为15分钟。灭菌到达时间后进行排气，待温度自然降至60℃后取出样品，得到灭菌后的羧甲基几丁质溶液。
35.取本对比例中灭菌前后的羧甲基几丁质溶液，采用流变仪测试两种溶液的动力粘度。如图5和图6所示，经过湿热灭菌后，10.0hz的剪切速率下羧甲基几丁质溶液的灭菌前后的动力粘度分别为3100和1510mpa
·
s，灭菌后动力粘度比灭菌前降低了51.3％。对比实施例一与对比例一，加入多元醇灭菌稳定剂后，羧甲基几丁质溶液的灭菌前后动力粘度降幅明显低于未添加多元醇的羧甲基几丁质溶液。上述结果证明，在未加入多元醇灭菌稳定剂的情况下，高温高压将很大程度地破坏羧甲基几丁质的流变学性质，而加入多元醇灭菌稳定剂后，可保护羧甲基几丁质溶液灭菌后的物理性质。
36.取本对比例中灭菌后的羧甲基几丁质溶液，采用多角激光散射仪测定灭菌后羧甲基几丁质的重均分子量。如图7所示，经过湿热灭菌后，羧甲基几丁质的分子量为600kda，下降幅度为15.5％。对比实施例一与对比例一，加入多元醇灭菌稳定剂后，灭菌后羧甲基几丁质的分子量明显高于未添加多元醇的羧甲基几丁质，进一步证明了多元醇对高温高压条件下羧甲基几丁质分子结构的保护作用，提高羧甲基几丁质的灭菌稳定性。
37.对比例二
38.称取一定质量甘露醇，以ph值为7.2、渗透压为320mosm/kg的磷酸盐缓冲液溶解均匀，甘露醇的质量浓度为19.2mg/ml。采用流变仪测试未灭菌的甘露醇溶液的动力粘度。如图8所示，未灭菌的甘露醇溶液在10.0hz下的动力粘度为 2.04mpa
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s。结合实施例一中图1、对比例一中图5和本对比例中的图8的结果，灭菌前添加多元醇的羧甲基几丁质溶液动力粘度明显高于未添加多元醇的羧甲基几丁质溶液，由于本对比例中证明甘露醇溶液在10.0hz下的动力粘度值极低，所以添加多元醇后羧甲基几丁质溶液动力粘度的提高，并不是由于甘露醇自身的粘性，而是因为甘露醇与羧甲基几丁质之间形成了氢键，故增强了羧甲基几丁质溶液的流变学性质。