一种具有引导骨组织生长的纳米纤维膜材料的制备方法与流程

本发明涉及骨组织再生、修复生物材料领域，具体涉及一种具有引导骨组织生长的纳米纤维膜材料的制备方法。

背景技术：

每年我国骨缺损或功能障碍患者超过300万人，骨损伤或骨缺损临床上十分常见，目前临床上主要采用自体骨或异体骨移植方法促进骨的再生和修复。虽然自体骨移植的修复效果明显优于异体骨移植，但是自体骨移植在材料来源有限，不能满足临床需求；异体骨尽管来源丰富，但是存在诸多不足：①易产生免疫排斥反应；②可能携带异源病原体，存在人畜共患病风险；③存在一定的伦理问题。为了克服自体骨和异体骨移植存在的缺陷，组织工程化骨是未来发展和应用的重要方向之一。

理想的骨修复材料应具有：⑴良好的骨诱导性和骨传导性；⑵良好的组织相容性；⑶降解速度与骨再生同步化；⑷骨的血管化；⑸有利于营养物交换的多孔性。基于这一要求，随着组织工程技术的发展和进步，组织工程化骨的研究和应用取得长足进步。

纳米纤维结构的生物材料具有仿生一体化特征，近年来该领域的研究如火如荼，特别是高压静电纺丝技术的兴起和快速发展，大量有机、无机和天然生物材料的电纺材料层出不穷。静电纺丝技术具有设备相对低廉、操作简单和可电纺材料多等优点。但是传统的电纺纳米纤维材料存在的显著问题就是纳米纤维比较致密，孔隙小不利于细胞的迁入和组织的快速形成。如何增加电纺材料的孔隙，是电纺纳米纤维材料发展的必然要求。

材料是组织工程发展的关键和瓶颈问题之一，功能化纳米材料是组织工程发展的方向，也是研究和开发具有“主动修复功能”和“可调控生物响应特性”生物活性材料关键。凹凸棒石(attapulgite，atp)是一种具链层状结构的含硅酸盐天然纳米材料，其结构属2：1型粘土矿物。atp的独特性能表现为：①纳米棒状结构；②粘性高和可塑性强；③吸水性强；④内部多孔道，比表面积大；⑤吸附性强，大部分的阳离子、水分子和一定大小的有机分子均可直接被吸附；⑥富含多种微量元素。目前在石油、化工、农业、建材、塑料等行业领域应用广泛。但atp在医学领域的研究和应用相对较少。

技术实现要素：

要解决的技术问题：本发明的目的是提供一种具有引导骨组织生长的纳米纤维膜材料的制备方法，所制备的骨损伤修复膜材料，具有较好的生物相容性、生物降解性和引导骨生长性能，同时具有较好的生物机械强度，满足骨损伤修复的要求。

技术方案：一种具有引导骨组织生长的纳米纤维膜材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：分别取聚己内酯和凹凸棒石，将聚己内酯和凹凸棒石溶解于10～30ml六氟异丙醇溶液中，将混合液以转速100～500r/min搅拌12～24h，充分混合后，得第一混合液；

步骤2：按质量百分比1～20，取聚氧化乙烯，将聚氧化乙烯溶解于10～30ml六氟异丙醇溶液中，将混合液以转速100～500r/min搅拌12～24h，充分混合后，得第二混合液；

步骤3：分别将第一混合液和第二混合液吸于10ml注射器中，同时置于高压静电纺丝推进泵上，将两种混合液进行电纺；

步骤4：待电纺结束后室温环境下自然挥发12～24h，小心从接收板取下膜后，置于真空环境下室温抽真空48～72h，以完全除去残留六氟异丙醇；

步骤5：将步骤4得到的膜材料置于500ml烧杯中，加入250～400ml去离子水后，置摇床上室温或37℃环境下，以90～120r/min转速摇动24～72h，期间每6～12h更换新鲜去离子水，待膜材料清洗完毕后取出置室温环境下自然干燥。

进一步的，所述步骤中1中聚己内酯和凹凸棒石的质量比为100～20︰60～10。

进一步的，所述步骤中1中聚己内酯和六氟异丙醇的质量体积比为70％，凹凸棒石六氟异丙醇的质量体积比为10～30％。

进一步的，所述步骤3中电纺条件为：电压10～25kv、接收距离10～20cm、推进速度0.5～3ml/h、电纺液10ml、针头大小18～25号和接收板面积20～100cm²。

进一步的，所述步骤3中高压静电纺丝环境条件：环境湿度20～50％，环境温度20～30℃。

有益效果：

1、本发明构建的纳米纤维膜材料具有制备工艺简单、尺寸可控、重复性好，易于根据需要制备具有不同尺寸的复合支架，满足不同的需求。

2、纳米纤维膜材料与传统纳米膜材料比较，明显克服了孔隙小不利于细胞进入和组织形成的缺陷，同时，孔隙的增大利于营养物质的供给和代谢物的排除。

3、纳米纤维膜材料具有一定的力学强度，在骨缺损处起到一定的支撑作用。

4、纳米纤维膜材料具有良好的降解性、生物相容性和无毒副作用，符合组织工程材料的要求。

5、本发明构建的纳米纤维膜材料复合凹凸棒石后显著增强了材料的骨诱导性和成骨性。

附图说明

图1是实施例1构建的纳米纤维膜材料的实物图。

图2是实施例1纳米纤维膜材料水洗前的扫描电镜图。

图3是实施例1纳米纤维膜材料水洗后的扫描电镜图。

图4是实施例1纳米纤维膜材料红外光谱和热失重图。

图5是实施例1纳米纤维膜材料水洗后的荧光图

图6是实施例1纳米纤维膜材料水洗前的原子力显微镜图。

图7是实施例1纳米纤维膜材料水洗后的原子力显微镜图。

图8是实施例1纳米纤维膜材料植入动物骨缺损处3个月后的组织染色图。

具体实施方式

实施例1

一种具有引导骨组织生长的纳米纤维膜材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：按质量比90︰10，分别取聚己内酯和凹凸棒石，将聚己内酯和凹凸棒石溶解于10ml六氟异丙醇溶液中，将混合液以转速100r/min搅拌24h，充分混合后，得第一混合液；

步骤2：按质量百分比6，取聚氧化乙烯，将聚氧化乙烯溶解于10ml六氟异丙醇溶液中，将混合液以转速500r/min搅拌24h，充分混合后，得第二混合液；

步骤3：分别将第一混合液和第二混合液吸于10ml注射器中，同时置于高压静电纺丝推进泵上。将两种混合液在电压20kv、接收距离15cm、推进速度2.5ml/h、电纺液10ml、针头大小22号和接收板面积80cm²条件下进行电纺，高压静电纺丝环境条件：环境湿度40％，环境温度25℃；

步骤4：待电纺结束后室温环境下自然挥发24h，小心从接收板取下膜后，置于真空环境下室温抽真空72h，以完全除去残留六氟异丙醇；得到的膜材料置于500ml烧杯中，加入400l去离子水后，置摇床上室温或37℃环境下，以120r/min转速摇动72h，期间每12h更换新鲜去离子水；

步骤5：待膜材料清洗完毕后取出置室温环境下自然干燥，得到具有组织诱导性功能的用于骨损伤修复的膜材料。

实施例2

一种具有引导骨组织生长的纳米纤维膜材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：按质量比80︰20，分别取聚己内酯和凹凸棒石，将聚己内酯和凹凸棒石溶解于10ml六氟异丙醇溶液中，将混合液以转速500r/min搅拌24h，充分混合后，得第一混合液；

步骤2：按质量百分比6，取聚氧化乙烯，将聚氧化乙烯溶解于10ml六氟异丙醇溶液中，将混合液以转速500r/min搅拌24h，充分混合后，得第二混合液；

步骤3：分别将第一混合液和第二混合液吸于10ml注射器中，同时置于高压静电纺丝推进泵上。将两种混合液在电压20kv、接收距离15cm、推进速度3ml/h、电纺液10ml、针头大小22号和接收板面积80cm²条件下进行电纺，高压静电纺丝环境条件：环境湿度40％，环境温度25℃；

步骤4：待电纺结束后室温环境下自然挥发24h，小心从接收板取下膜后，置于真空环境下室温抽真空72h，以完全除去残留六氟异丙醇；得到的膜材料置于500ml烧杯中，加入400ml去离子水后，置摇床上室温或37℃环境下，以120r/min转速摇动72h，期间每12h更换新鲜去离子水；

步骤5：待膜材料清洗完毕后取出置室温环境下自然干燥，得到具有组织诱导性功能的用于骨损伤修复的膜材料。

实施例3

一种具有引导骨组织生长的纳米纤维膜材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：按质量比70︰30，分别取聚己内酯和凹凸棒石，将聚己内酯和凹凸棒石溶解于10ml六氟异丙醇溶液中，将混合液以转速500r/min搅拌24h，充分混合后，得第一混合液；

步骤2：按质量百分比6，取聚氧化乙烯，将聚氧化乙烯溶解于10ml六氟异丙醇溶液中，将混合液以转速500r/min搅拌24h，充分混合后，得第二混合液；

步骤3：分别将第一混合液和第二混合液吸于10ml注射器中，同时置于高压静电纺丝推进泵上。将两种混合液在电压20kv、接收距离15cm、推进速度3ml/h、电纺液10ml、针头大小22号和接收板面积80cm²条件下进行电纺，高压静电纺丝环境条件：环境湿度40％，环境温度25℃；

步骤4：待电纺结束后室温环境下自然挥发24h，小心从接收板取下膜后，置于真空环境下室温抽真空72h，以完全除去残留六氟异丙醇；得到的膜材料置于500ml烧杯中，加入300ml去离子水后，置摇床上室温或37℃环境下，以120r/min转速摇动72h，期间每12h更换新鲜去离子水；

步骤5：待膜材料清洗完毕后取出置室温环境下自然干燥，得到具有组织诱导性功能的用于骨损伤修复的膜材料。

实施例1所制备的膜材料如图1所示。部分未水洗的膜材料用于后续材料性能对比测试。水洗前后膜材料结构的扫描电子显微镜图，如图2～3所示，从图中可看出掺入凹凸棒石后膜材料的纳米纤维直径与未加入凹凸棒石比较明显降低；水洗后材料的纤维结构较水洗前明显光滑均一，孔隙显著增加。纤维的大小在500～1000nm，且形成多孔径。

分别利用红外光谱、水表面接触角对材料表征；测试材料的孔隙率、吸水膨胀率、透气性；生物力学测试机检测膜材料的力学性能。如图4～6所示，从图中可看出掺入凹凸棒石后材料的水表面接触角显著增大，相反吸水膨胀率降低；水洗后膜材料的孔隙率和透气性明显增加。掺入凹凸棒石后材料的力学性能增强。

对本实施例1的膜材料与间充质干细胞进行共培养，进行组织学评价生物相容性。利用细胞增殖实验、扫描电镜观察、细胞免疫荧光染色和组织学染色(he)方法分别评价材料的组织相容性，该扫描电镜图如图2-3所示，组织染色图见图8，结果显示，细胞能在材料中生长、增殖，且随着时间的延长细胞数量明显增加，该结果提示，膜材料与细胞无免疫反应和毒副作用，细胞与该材料具有良好生物相容性。

下面通过复制大鼠颅骨缺损模型，利用缺损模型评价膜材料的骨修复效果。

1、对于材料的结构：

1)采用扫描电镜、原子力显微镜和红外光谱仪技术对材料表征；接触角仪检测材料的吸水性；质量法和体积变化测定法分别测定材料的含水率和膨胀率；液体交换法测定材料壳层孔隙率；力学材料机评价干湿环境条件下，支架材料杨氏模量的变化特征；

2)将膜材料置于dmem/f12培养基中，与小鼠骨髓间充质干细胞在37℃co2培养箱进行共培养，在培养3d、7d、14d和21d后，分别进行组织学评价观察细胞与材料的复合情况；试验表明：细胞能在材料表面生长、增殖，材料无毒副作用，符合组织工程支架材料的要求。

动物学实验

采用清洁级雄性wastar大鼠60只，体重(200±20)g，随机分为3组，即实验组(采用本发明3种膜材料)、对照组(不掺和凹凸棒石膜材料)和自体缺损修复组，每组12只。按每千克体重注射质量百分比10％水合氯醛行腹腔注射麻醉。无菌环境下复制大鼠头盖骨缺损模型，骨缺损孔洞规格为直径×长度：5mm×3mm，按照预先设计植入膜材料后，逐层缝合伤口，碘伏涂抹伤口，利用消毒灭菌的纱布、绷带包扎固定伤口。术后清洁级环境下饲养，分别于4周、8周和12周时，通过micro-ct扫描、组织染色方法(he)、masson染色方法和免疫组织化学方法，分别观察并综合评价材料对骨损伤的修复效果。

1)micro-ct扫描

分别于术后4周、8周和12周时行micro-ct扫描缺损区的愈合情况、并与周围正常骨组织结合情况，比较进行观察分析，结果显示实验组的新骨生成明显多于其他组，材料与周围骨组织密切结合。

2)组织学分析

取材，常规石蜡包被，he染色，masson染色光学显微镜下观察分析宿主组织/材料的生物相容性、炎性反应程度和宿主/材料界面形成的组织结构特征，如图8所示，结果显示：宿主/材料界面无炎性细胞，并随着时间延长骨修复生物材料逐步被降解吸收；

3)免疫组织化学染色分析

免疫组织化学方法检测新生骨中col-ⅰ、ocn和opn的表达，实验组col-ⅰ、ocn和opn呈明显阳性表达。

通过上述动物实验证实：本发明骨膜材料具有引导新骨再生的功能，实现了具有组织诱导性骨修复的组织工程膜材料，以期用于临床。

本发明膜纳米膜材料的原材料为聚己内酯(pcl)，已广泛用于组织工程材料的研究和应用，是美国fda批准用于人体的生物材料。凹凸棒石为天然无机材料，来源丰富，加工工艺成熟、规范、流程简单；电纺技术成熟、易行，所用材料无毒、可降解且具有良好的生物相容性。