病毒组合物

1.本发明的各方面广泛用于医学领域，且更具体地涉及组合物或成套试剂盒(kits
‑
of
‑
parts)，其包含作为呼肠孤病毒科(reoviridae)家族成员的病毒。所公开的组合物或成套试剂盒特别用于疗法中，诸如例如用于治疗赘生性疾病的方法中或用于免疫方法中。本发明还涵盖用于制造或使用所公开组合物或成套试剂盒的方法。
2.发明背景
3.病毒是严格的细胞内寄生物，并且由于其简单性，它们几乎在复制周期的所有阶段都依赖于宿主生物。在进化和适应其宿主的过程中，它们获得了相关的分子“钥匙”或“入场券”，从而能够利用和控制细胞功能。病毒进入在很大程度上取决于病毒颗粒与其宿主细胞表面受体之间的相互作用。这些相互作用决定了病毒附着、摄取、细胞内运输以及最终渗透到细胞溶质的机制。
4.呼肠孤病毒科家族的病毒是核糖核酸(rna)病毒，缺乏外脂膜，呈球形，直径约为60
‑
100纳米，具有两个衣壳(或同心壳，通常称为外衣壳和内核)，并且含有分段双链rna核。呼肠孤病毒科病毒目前分为两个亚科：光滑呼肠孤病毒亚科(sedoreovirinae)和刺突呼肠孤病毒亚科(spinareovirinae)，包括许多属，其中正呼肠孤病毒属(orthoreovirus)、环状病毒属(orbivirus)和轮状病毒属(rotavirus)是最为熟知的。呼肠孤病毒科病毒的宿主范围很广，包括脊椎动物、无脊椎动物、植物、原生生物和真菌。例如，某些正呼肠孤病毒属、环状病毒属、科罗拉多壁虱热病毒属(coltivirus)和轮状病毒属物质会感染人类，某些正呼肠孤病毒属物种会感染鸟类，植物呼肠孤病毒属(phytoreovirus)和斐济病毒属(fijivirus)物种会感染植物和昆虫，质型多角体病毒属(cypovirus)物种会感染昆虫，水生呼肠孤病毒属(aquareoviruses)会感染鱼类。
5.感染哺乳动物正呼肠孤病毒(呼肠孤病毒)可能是常见的，但通常是轻微的或亚临床的，但是最近在人类中的一项研究证明呼肠孤病毒感染通过破坏对麸质的口服耐受性而引起乳糜泻进展(bouziat,r.et al.reovirus infection triggers inflammatory responses to dietary antigens and development of celiac disease.science 2017,vol.356,44
‑
50)。此外，轮状病毒属是引起感染性婴幼儿腹泻的主要人类病原体，且普遍使用轮状病毒疫苗，如rotarix(glaxosmithkline)或(merck vaccines)，来保护婴幼儿。
6.呼肠孤病毒感染普遍存在于商业家禽中。大多数毒株都是非病原性的，似乎在肠道中无害地存活。但是其他毒株与几种疾病病症相关。家禽中最常见的呼肠孤病毒相关疾病是病毒性关节炎，表现为小腿和飞节以上肌腱肿胀。被感染的鸟类走路时步态僵硬，或根本不愿移动。针对鸡呼肠孤病毒感染的疫苗可以商购获得，例如从msd animal health购得的reo 1133。
7.此外，呼肠孤病毒是很有前景的溶瘤剂，因为呼肠孤病毒通过激活的ras信号传导途径选择性地靶向转化细胞，并且至少约30％的人类肿瘤表现出异常的ras信号传导。通过靶向ras激活细胞，呼肠孤病毒可直接裂解癌细胞，破坏肿瘤免疫抑制机制，重建多细胞免
疫监视，并产生强大的抗肿瘤应答(duncan et al.differential sensitivity of normal and transformed human cells to reovirus infection.j.virol.1978,vol.28,444
‑
449；coffey et al.reovirus therapy of tumors with activated ras pathway.science 1998,vol.282,1332
‑
1334)。呼肠孤病毒已在难治性人类癌症的临床试验中显示出疗效(mahalingam et al.a phase ii study of pelareorep(reolysin((r)))in combination with gemcitabine for patients with advanced pancreatic adenocarcinoma.cancers(basel)2018,vol.10,e160；samson et al.oncolytic reovirus as a combined antiviral and anti
‑
tumour agent for the treatment of liver cancer.gut 2018,vol.67,562
‑
573；samson et al.intravenous delivery of oncolytic reovirus to brain tumor patients immunologically primes for subsequent checkpoint blockade.science translational medicine 2018,vol.10,eaam7577)。
8.在其病毒外衣壳蛋白中，sigma
‑
1(σ1)蛋白是呼肠孤病毒进入的决定因素(stencel
‑
baerenwald et al.the sweet spot:defining virus
‑
sialic acid interactions.nat.rev.microbiol.2014,vol.12,739
‑
749)。σ1蛋白是一种纤维状三聚体，由两个结构域组成，一个是与病毒颗粒连接的细长尾部结构域，另一个是从病毒颗粒表面凸出的球状头部结构域。这两部分都包含受体结合结构域。尾部结构域能够与含有α
‑
连接的唾液酸(α
‑
sa)的细胞表面碳水化合物接合，而头部结构域与结合粘附分子a(jam
‑
a)结合(danthi et al.reovirus receptors,cell entry,and proapoptotic signaling.adv.exp.med.biol.2013,vol.790,42
‑
71)。最近的研究表明，α
‑
sa结合中涉及的σ1尾部区域的单点突变是呼肠孤病毒嗜性产生血清型依赖性差异的原因，尤其会影响呼肠孤病毒血清型3型的神经毒力(frierson et al.utilization of sialylated glycans as coreceptors enhances the neurovirulence of serotype 3reovirus.j.virol.2012,jvi.01822
‑
01812)，而jam
‑
a受体是所有这三种呼肠孤病毒血清型的受体(stencel
‑
baerenwald et al.2014,supra；barton et al.utilization of sialic acid as a coreceptor enhances reovirus attachment by multistep adhesion strengthening.j.biol.chem.2001,vol.276,2200
‑
2211(
‘
barton et al.2001a’)；barton et al.junction adhesion molecule is a receptor for reovirus.cell 2001,vol.104,441
‑
451(
‘
barton et al.2001b’))。
9.发明概述
10.本发明至少部分基于本发明人为解开呼肠孤病毒与细胞表面分子结合的分子机制所做的细致努力，导致意外发现唾液酸(sa)与呼肠孤病毒sigma1(σ1)蛋白结合，会触发σ1与jam
‑
a表面受体的结合电位，这是病毒进入的关键步骤。不希望受到任何理论的限制，本发明人更具体地发现，sa与呼肠孤病毒σ1蛋白的相互作用积极促进σ1蛋白的构象向更伸展或延伸的构象变化，而σ1蛋白的这种构象变化导致病毒与同源细胞表面受体(特别是jam
‑
a)的结合能力增强，从而显著增加病毒与细胞表面之间所建立的键的数量。这种结合的增强反过来又可以将病毒限制在细胞表面上，从而有利于其进入细胞溶质内。
11.这些发现首次确定了唾液酸或包含唾液酸部分的分子是呼肠孤病毒与细胞结合以及呼肠孤病毒感染性的有效增强剂，并为提高呼肠孤病毒细胞进入方法的有效性提供了可靠途径，如基于呼肠孤病毒的疗法，例如利用呼肠孤病毒溶瘤特性的疗法，或涉及接种呼
肠孤病毒疫苗的疗法。
12.因此，一方面提供了一种组合物，其包含i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒，以及ii)唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子。
13.另一方面提供了一种成套试剂盒，其包含i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒，以及ii)唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子。
14.又一方面提供了用于疗法中的该组合物。相关方面提供了该组合物在疗法中的用途。
15.又一方面提供了用于疗法中的该成套试剂盒。相关方面提供了该成套试剂盒在疗法中的用途。
16.又一方面提供一种治疗有此需要的受试者的方法，该方法包括使该受试者施用预防或治疗有效量的i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒，以及ii)唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子。
17.又一方面提供一种作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒的体外繁殖方法，该方法包括：i)感染易受所述病毒感染的宿主细胞，其中该宿主细胞已经在唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子的存在下用所述病毒进行了基因工程改造，以过表达jam
‑
a，或者其中所述病毒先前已用唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子进行了处理；ii)使病毒在所述宿主细胞中进行繁殖；以及任选地iii)分离宿主细胞产生的繁殖病毒。
18.在以下部分和所附权利要求书中，描述了本发明的这些和其它方面以及优选实施方案。所附权利要求书的主题在此具体地并入本说明书中。
19.附图简要说明
20.图1示出了探测呼肠孤病毒与活细胞结合的基于fd的afm的原理。(a)afm放置在光学显微镜上。将cho或lec2细胞维持在专门设计的允许控制温度和气体气氛并防止培养基蒸发的细胞培养室中。(b)带有用感兴趣的病毒官能化的尖端的afm悬臂以khz范围内的频率振荡，以正弦驱动运动诱导朝向样品的接近和收回运动。(c、d)所记录的尖端
‑
样品相互作用显示为力vs.时间(c)或力vs.距离(d)，其允许跟踪朝向生物样品所建立的力。(e)机械性能(包括粘附)可从单个力曲线中提取，且与它们在样品上的位置直接相关(例如，高度图像和相应的粘附图)。
21.图2示出了通过实施例中使用的细胞系对细胞表面受体表达的表征。(a)jam
‑
a表达的流式细胞术概况(左)以及中位荧光强度的相应定量(右)。使用单克隆抗体和间接免疫荧光对jam
‑
a进行检测。(b)通过与荧光凝集素(小麦胚芽凝集素，wga)温育来分析cho和lec2细胞系的细胞表面唾液酸的表达。图示出了wga与所示细胞系结合的细胞术概况(左)以及结合凝集素的中位荧光强度的定量(右)。
22.图3示出了探测t3呼肠孤病毒与模型表面和活细胞上唾液酸化聚糖的结合。(a)在α
‑
sa聚糖衍生物(n
‑
乙酰神经氨酸(neu5ac)、唾液酸
‑
乳糖
‑
n
‑
四糖a(lsta))和不含α
‑
sa的衍生物(乳糖
‑
n
‑
新四糖[lnnt])存在或不存在的情况下，在sa包被的表面上探测单个病毒粒子的结合。(b)通过afm测量的不注射1mm聚糖情况下和注射1mm聚糖后病毒粒子与α
‑
sa之间特异性结合频率的箱形图。(c)动力学力谱(dfs)图，其示出了在t3sa+与sa包被的表面之间测量的断裂力的分布(灰点)，平均断裂力是在八个不同的加载速率(lr)范围内确定的。单个相互作用对应的数据用将配体
‑
受体键描述为简单双态模型的bell
‑
evans(be)模型拟
合(i，黑色曲线)。虚线表示两个(ii)和三个(iii)同时不相关相互作用的预测结合力(williams
‑
evans模型[wem])。插图：将配体
‑
受体键描述为简单双态模型的be模型。结合态与非结合态由位于距离x
u
处的能障分离。k
u
和k
off
分别表示热平衡下的转变速率和转变。(d)t3sa+与细胞表面上表达α
‑
sa的细胞(cho)或缺少α
‑
sa的细胞(lec2)的结合的组合的光学显微镜和基于fd的afm。(e)共培养的荧光cho细胞(肌动蛋白
‑
mcherry和h2b
‑
egfp)和lec2细胞的汇合层的dic、gfp和mcherry信号的叠加。(f、g)(e)中虚线正方形中所示的所探测的相邻细胞的基于fd的afm形貌图(f)和相应的粘附图(g)。该粘附图示出了主要在cho细胞(α
‑
sa+细胞)上的相互作用(白色像素)。(h)来自α
‑
sa模型表面(灰色圆圈，来自b)和活细胞(红点)的数据的dfs图。侧面示出了在细胞上观察到的用多峰高斯分布(n＝700)拟合的力分布直方图。(i)对于t3sa+(灰色)和t3sa
‑
(白色)病毒粒子以及注射1mm neu5ac后的t3sa+病毒粒子(红色)所观察到的bf的箱形图。误差线表示标准偏差(s.d.)。对于所有实验，数据代表至少五个独立实验。(j)通过流式细胞术测定的sa对病毒结合的影响。将细胞与pbs(mock)或alexa flour488标记的t3sa+或t3sa
‑
病毒粒子温育(每细胞105个颗粒)，并通过流式细胞术测定细胞结合的病毒的中位荧光强度(mfi)。误差线表示s.d.。实验重复两次，每次使用重复样品。****；p<0.0001；通过在graphpad prism或origin中使用图基(tukey)检验校正多重比较的双向方差分析确定。
[0023]
图4示出了探测呼肠孤病毒与模型表面和活细胞上jam
‑
a的结合。(a)在模型表面上探测的单个病毒粒子(t3sa+或t3sa
‑
)与jam
‑
a的结合。(b)dfs图，其示出了将t3sa+(上图)或t3sa
‑
(下图)病毒粒子与jam
‑
a分离所需并与be模型拟合的力。(c)呼肠孤病毒与jam
‑
a模型表面结合频率的箱形图。t3sa+相互作用以灰色表示，t3sa
‑
以白色表示，阴影线框表示注射了10μg/ml jam
‑
a抗体(ab)。(d)t3sa+与活lec2细胞上jam
‑
a的相互作用的组合的光学和基于fd的afm。(e)共培养的荧光lec2细胞(肌动蛋白
‑
mcherry和h2b
‑
egfp)和未标记的lec2
‑
jam
‑
a细胞的汇合层的dic、gfp和mcherry信号的叠加。(f、g)(e)中虚线正方形中所示的相邻细胞的基于fd的afm形貌图(f)和相应的粘附图(g)。该粘附图示出了主要在t3sa+颗粒和lec2
‑
jam
‑
a细胞之间的相互作用(白色像素)。(h)t3sa+与模型表面(灰色圆圈，取自b—上图)和活细胞(红点)上jam
‑
a的相互作用的dfs图。侧面示出了在细胞上观察到的用多峰高斯分布(n＝600)拟合的力分布直方图。(i)所观察到的注射(阴影线)和未注射jam
‑
a ab(10μg/ml)情况下t3sa+(灰色)和t3sa
‑
(白色)病毒粒子的bf的箱形图。误差线表示标准偏差。对于所有实验，数据代表至少五个独立实验。(j)使用流式细胞术测定的jam
‑
a对病毒结合的影响。未与病毒粒子(mock)或与alexa flour488标记的t3sa+或t3sa
‑
病毒粒子温育细胞(每细胞105个颗粒)，并通过流式细胞术测定与细胞结合的病毒的中位荧光强度(mfi)。误差线表示s.d.。实验重复两次，每次使用重复样品。*，p<0.05；****，p<0.0001；通过在graphpad prism或origin中使用图基(tukey)检验校正多重比较的双向方差分析确定。
[0024]
图5示出了唾液酸化聚糖对呼肠孤病毒与jam
‑
a结合的影响。(a)在注射1mmα
‑
sa聚糖(neu5ac[b，红色]和lsta[c，黄色])或非唾液酸化聚糖(lnnt[d，绿色])后，监测t3sa+或t3sa
‑
病毒粒子或t3sa+isvp与jam
‑
a的结合。(b
‑
d)添加1mm聚糖(b中为neu5ac、c中为lsta，d中为lnnt)之后所测量的t3sa+与jam
‑
a之间相互作用力的dfs图。灰点表示注射前所测量的结合力。(e)jam
‑
a与t3sa+isvp之间相互作用力的dfs图，其显示了更延伸的σ1蛋白的构
象。与未注射游离sa的t3sa+病毒粒子(灰色)相比，t3sa+isvp(蓝色)观察到多价相互作用。(f)添加游离聚糖前后单键和多键的相对频率由力分布直方图内各峰下的面积确定。(g)在注射唾液酸化(neu5ac
‑
红色、lsta
‑
黄色)或非唾液酸化(lnnt
‑
绿色)聚糖之前(灰色)和之后，jam
‑
a与t3sa+(左图)或t3sa
‑
(中图)病毒粒子或t3sa+isvp(右图)之间所建立的键的数量。灰色(“前”)曲线与lnnt曲线遵循基本相同的概况。误差线表示平均值的s.d.。对于所有实验，数据代表至少n＝3个独立实验。
[0025]
图6示出了测试游离sa化合物对t3sa
‑
与jama结合的影响。(a
‑
c)在模型表面上探测的添加1mm neu5ac(a，红色)、1mm lsta(b，黄色)或1mm lnnt(缺少sa组)(c，绿色)后t3sa
‑
与jam
‑
a之间相互作用的dfs图。重叠的灰色圆圈表示注射化合物之前的结合事件。在所有四个实验中都观察到了单个jam
‑
a
‑
t3sa相互作用，并用bell
‑
evans模型拟合(黑线)。与图5中所示的结果相反，注射neu5ac或lsta没有引起jam
‑
a
‑
t3sa结合发生任何变化或建立多价相互作用，这证明t3sa+中的唾液酸结合位点是造成这一观察结果的原因。(d)未添加sa化合物(灰色表示t3sa+、白色表示t3sa
‑
，且蓝色表示t3sa+isvp)和添加neu5ac(红色)、lsta(黄色)或lnnt(绿色)后，以及在注射10μg/ml jam
‑
a ab作为受体阻断试剂(在各箱形图中用虚线表示)后，所观察到的jam
‑
a
‑
t3sa+(左图)、jama
‑
t3sa
‑
(中图)和jama
‑
t3sa+isvp(右图)相互作用的bf的箱形图。箱内的水平线表示中位值，箱的边界表示第25和第75百分位，须(whisker)表示结果的最高值和最低值。箱中的方块表示平均值。所观察到的在jam
‑
a ab存在下结合频率的降低证实了所观察到的相互作用的特异性。对于所有实验，数据代表至少n＝3个独立实验。****，p<0.0001；由origin中的双样本t检验确定。误差线表示平均值的s.d.。
[0026]
图7示出了探测呼肠孤病毒与活细胞结合。(a)蛋白酶处理前(病毒粒子)和后(感染性亚病毒颗粒[isvp])外衣壳蛋白被标记的呼肠孤病毒颗粒的示意图。漫画示出了外衣壳蛋白在病毒粒子的双层壳中的排列，以及通过去除σ3、切割μ1以产生δ和φ，并将σ1重新排列为更伸展的构象而形成isvp。(b)呼肠孤病毒σ1蛋白的全长模型(dietrich et al.structural and functional features of the reovirusσ1tail.j.virol.2018,jvi 00336
‑
00318)，其用作与细胞表面聚糖(特别是末端α
‑
连接的唾液酸[α
‑
sa]残基)和连接粘附分子
‑
a(jam
‑
a)结合的病毒附着蛋白。示出了分子与α
‑
sa和jam
‑
a相互作用的区域。(c)利用afm探测呼肠孤病毒进入的示意图。呼肠孤病毒对细胞的最初附着涉及病毒σ1蛋白与受体jam
‑
a之间的特异性结合。细胞表面聚糖用作共受体。
[0027]
图8示出了监测sa添加对呼肠孤病毒与活细胞结合的影响。在添加1mm neu5ac(a
‑
e)、1mm lsta(f
‑
j)或1mm lnnt(k
‑
o)前和后评估t3sa+与lec2
‑
jam
‑
a细胞的结合。(a、f、k)相邻的lec2和lec2
‑
jam
‑
a细胞的afm形貌图，其荧光图像(20x20μm)插图示出了缺乏jam
‑
a表达的带荧光标签的lec2细胞。(b、g、l)注射聚糖前记录的相应的粘附图。(c、h、m)lec2
‑
jam
‑
a细胞上记录的粘附图的放大图像(粘附图中的虚线正方形)。上面的图像(浅灰色框)显示较低的力范围(300至400pn)，而下面的图像(深灰色框)显示较高的力范围(400至500pn)，其粘附事件明显更少。(d、i、n)注射游离neu5ac(d)、lsta(i)或lnnt(n)后记录的粘附图。所探测的区域与注射聚糖前记录的区域相似。(e、j、o)lec2
‑
jam
‑
a细胞上记录的粘附图的放大图像(粘附图中的虚线正方形以及与b、g、i中相同的区域显示出唾液酸化聚糖[neu5a和lsta]在高作用力范围内粘附事件更多，而非唾液酸化聚糖[lnnt]没有显著变
化)。示出了粘附事件的频率。(p
‑
s)添加neu5ac(q)、lsta(r)和lnnt(s)前(p)和后lec2
‑
jam
‑
a细胞上提取的力分布(粘附图中的虚线正方形)的直方图。直方图用多峰高斯分布拟合。(t)注射唾液酸化或非唾液酸化聚糖前(灰色)和后(彩色)jam
‑
a细胞表面受体与t3sa+之间所建立的键的数量。误差线表示平均值的s.d.。表1中示出了统计分析。对于所有实验，数据代表来自n＝5个独立实验的至少n＝15个细胞。
[0028]
表1.不同条件下jam
‑
a细胞表面受体与t3sa+病毒粒子之间所建立的键的数量的统计分析。p值源于注射唾液酸化聚糖(neu5ac、lsta)或非唾液酸化聚糖(lnnt)前和后数据的比较。与注射非唾液酸化聚糖前或后的数据相比，注射唾液酸化聚糖后建立的键的数量显著不同。ns，p＞0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；****，p＜0.0001；由origin中的双样本t检验确定。对于所有实验，数据代表来自n＝5个独立实验的至少n＝15个细胞。
[0029]
键数+neu5ac+lsta+lnntinsnsnsii********nsiii****nsiv*******nsv********nsvi********ns
[0030]
图9示出了监测sa添加对呼肠孤病毒与活细胞结合的影响。注射(虚线)和未注射jam
‑
a ab(10μg/ml)以及添加所示聚糖后，所观察到的t3sa+病毒粒子的bf的箱形图。数据代表至少5个独立实验。
[0031]
图10示出了触发呼肠孤病毒病毒粒子的多价锚定大量改变扩散电位和结合行为。(a、b)呼肠孤病毒(t3sa
‑
、t3sa+和t3sa+isvp)与固定化在nta包被的生物传感器上的jam
‑
a受体结合的生物层干涉测量术数据。检测了在溶液中添加1mm neu5ac对t3sa
‑
和t3sa+两者的影响。传感图从基线(bl)测量开始，接着是将jam
‑
a固定化到nta生物传感器上(加载)、添加病毒粒子(缔合)，最后是解离阶段。(c
‑
g)在1mm neu5ac不存在(c、d)和存在(e、f)的情况下，在共培养的cho
‑
jam
‑
a和lec2
‑
jam
‑
a细胞上温育的呼肠孤病毒颗粒(用alexa488染料标记)的实时共聚焦荧光成像。(c、e)alexa488(病毒粒子)、lec2
‑
jam
‑
a的mcherry
‑
肌动蛋白，以及pmt信号的叠加图像。(d、f)t3sa+颗粒的时移轨迹。白色和黄色的轨迹分别表示在lec2
‑
jam
‑
a细胞和cho
‑
jam
‑
a细胞上的运动。每个轨迹的放大倍数显示在右侧，并带有相应的数字。(g)对吸附到细胞混合物后，t3sa+结合(在neu5ac不存在(灰色)或存在(红色)的情况下)，以及t3sa
‑
结合(在neu5ac不存在(白色)或存在(浅红)的情况下)的平均移动距离(顶图)、平均移动速度(中图)和结合的病毒颗粒(底图)的分析。箱形图(底图)内的水平线表示中位值，箱的边界表示第25和第75百分位，并且须表示结果的最高值和最低值。箱中的方块表示平均值。数据代表至少三个独立实验，每个至少15条轨迹。***，p<0.001；****；p<0.0001；由origin中的双样本t检验确定。误差线表示平均值的s.d.。(h)描绘与α
‑
sa结合如何触发σ1蛋白中的构象变化导致更延伸的构象，从而导致对jam
‑
a的亲和力增加的模型。
[0032]
图11示出了通常在脊椎动物系统中发现的唾液酸部分的结构，其可用于本发明的某些实施方案中。
[0033]
图12示出了呼肠孤病毒颗粒的表征以及尖端和表面固定化的验证。(a、b)在低(a)
和高(b)放大倍数下沉积在新切割的hopg基底上的呼肠孤病毒颗粒的afm高度图像。插图：3d重建。(c)在用针对呼肠孤病毒的一抗和apc缀合的二抗(红色)染色后，通过激光扫描光学显微镜获得的用呼肠孤病毒官能化的afm尖端的z堆叠(z
‑
stack)图像。插图突出显示了尖端顶点的病毒粒子连接。实验重复了三次，结果相似。(d、e)在高力(约18nn)下扫描500x500nm区域以去除所附着的生物分子(称为“刮痕(scratching)”实验)后，sa(d)或jam
‑
a(e)包被的表面的afm形貌图。插图：沿着d和e中的白色虚线所取的横截面，其示出了生物物质在正方形两侧的积累。正方形内部的无生物分子表面比周围的生物分子包被表面低约1nm(d)或约2nm(e)，提供了对sa(d)或jam
‑
a(e)沉积层厚度的估计。
[0034]
图13示出了研究中使用的通过细胞系对细胞表面受体表达的表征，特别是用于从代表性数据集创建的用于流式细胞术分析的门控策略。在前两个门控步骤中，利用前向和侧向散射选择单个细胞，随后使用live/dead可固定紫色死细胞染料试剂盒(invitrogen)门控活细胞。然后测定感兴趣的通道中活细胞的中位荧光强度(mfi)。
[0035]
图14示出了用于研究sa在呼肠孤病毒与活细胞结合中的作用的对照实验。(a
‑
d)t3sa+病毒与细胞混合物结合的连续映射示出了相似的结果。(a)实验的漫画突出显示了cho细胞被荧光标记。基于fd的afm高度图像(b)(细胞的25μm x25μm荧光图像)和相应的粘附通道在两个连续的图谱(c、d)中显示出相似的结果，这表明病毒牢固地附着在探针尖端上，并且未随时间的推移而降解。(e
‑
h)用t3sa+病毒粒子和t3sa
‑
病毒粒子连续探测细胞上的同一区域。(e)实验的漫画。(f)首先用探针尖端上的t3sa+病毒粒子(f、g)，然后用探针尖端上的t3sa
‑
病毒粒子扫描同一区域(h)后，所得到的基于fd的afm高度图像和相应的粘附力。将探针尖端改为非sa结合病毒后，cho细胞上粘附(白色像素)显著降低，这证实了探测细胞表面唾液酸与t3sa+相互作用的特异性。作为sa特异性结合的另一个对照实验，进行阻断研究以测试t3sa+相互作用的抑制(如i
‑
n中所示)。(i)实验的漫画。(j)首先用探针尖端上的t3sa+病毒粒子(j、k)，然后在注射1mm neu5ac(可结合呼肠孤病毒并阻断呼肠孤病毒与细胞表面sa的相互作用)(l)后扫描同一区域获得的基于fd的afm高度图像和相应的粘附力。可以看到，粘附事件显著减少。所有的afm图像都是在细胞培养条件下，以0.25khz的振荡频率和750nm的振幅获得的。实验重复了5至10次。为了更高的可见度，粘附图像中的像素尺寸放大了两倍。
[0036]
图15示出了用于研究jam
‑
a在呼肠孤病毒与活细胞结合中的作用的对照实验。(a
‑
d)t3sa+病毒与lec2和lec2
‑
jam
‑
a细胞混合物结合的连续映射示出了相似的结果。(a)实验的漫画突出显示了lec2细胞被荧光标记。基于fd的afm高度图像(b)(插图中示出的细胞的25μm x25μm荧光图像)和相应的粘附通道在两个连续的图(c、d)中显示出相似的结果，这表明病毒牢固地附着在尖端上，并且未随时间的推移而降解。(e
‑
h)首先用t3sa+病毒粒子，然后用t3sa
‑
病毒粒子，探测细胞上的同一区域。(e)实验的漫画。(f)首先用尖端上的t3sa+病毒粒子(f、g)，然后用尖端上的t3sa
‑
病毒粒子扫描同一区域(h)获得的基于fd的afm高度图像和相应的粘附通道。两个粘附图像都显示出了相似的结果，这表明jam
‑
a独立于病毒上sa结合位点的存在参与呼肠孤病毒结合。(i
‑
j)t3sa与从lec2
‑
jam
‑
a细胞上粘附区域提取的jam
‑
a的相互作用的dfs分析。(i)实验的漫画。(j)t3sa
‑
与模型表面(灰色圆圈，取自图4b—下图)和活细胞(红点)上jam
‑
a的相互作用的dfs图。侧面示出了细胞上所观察到的用多峰高斯分布(n＝620数据点)拟合的力分布的直方图。误差线表示平均值的s.d.。(k
‑
n)作为
jam
‑
a特异性结合的另一个对照实验，检测了细胞表面受体阻断试剂对t3sa+相互作用的影响。(k)实验的漫画。(l
‑
n)首先在不含阻断试剂的情况下用尖端上的t3sa+病毒粒子(l、m)，然后在注射10μg/ml jam
‑
a ab(n)以阻断细胞表面jam
‑
a分子之后通过扫描同一区域获得的基于fd的afm高度图像和相应的粘附图像。观察到粘附事件显著减少。所有的afm图像都是在细胞培养条件下，使用0.25khz的振荡频率和750nm的振幅获得的。实验重复了5至10次。为了更高的可见度，粘附图像中的像素尺寸放大了两倍。
[0037]
图16示出了测试游离sa化合物对t3sa
‑
与jam
‑
a结合的影响，特别是在模型表面上探测的添加1mm neu5ac(红色)后t3sa+isvp和jam
‑
a之间相互作用的dfs图。neu5ac未引起在没有游离聚糖的情况下观察到的多价结合行为的任何变化。
[0038]
图17示出了在神经氨酸酶处理后监测sa添加对呼肠孤病毒与活细胞结合的影响。(a)实验的漫画突出显示了lec2细胞被荧光标记，并显示了注射的顺序。(b
‑
j)首先在生长培养基中(c)，然后在神经氨酸酶处理后扫描同一区域(e)以去除细胞表面上残留的α
‑
sa而获得的基于fd的afm高度图像(插图中显示了细胞的25μm x25μm荧光图像)(b)和相应的粘附通道。观察到粘附事件略有减少(p<0.01)，这表明na处理去除了细胞表面上的残留sa。(d、f)lec2
‑
jam
‑
a细胞上记录的粘附图的放大图像(粘附图中的虚线正方形)。上面的图像显示较低的力范围(300至400pn)，而下面的图像显示较高的力范围(400至500pn)，na处理前和后粘附事件明显更少。图中示出了粘附事件的频率。na处理后，添加游离的neu5ac(1mm)，并重新扫描同一区域(g)。在lec2
‑
jama细胞上记录的粘附图的放大图像(粘附图中的虚线正方形和c、e中的类似区域)显示出注射唾液酸化聚糖后在高力范围内有更多的粘附事件。这一结果与使用未经na处理的细胞进行的实验一致(图8a
‑
e)。最后一步，注射10μg/ml jam
‑
a ab(i、j)以阻断细胞表面jam
‑
a分子后，扫描同一区域。观察到粘附事件显著减少。所有的afm图像都是在细胞培养条件下，使用0.25khz的振荡频率和750nm的振幅获得的。实验重复了3至5次。为了清晰度和更好的可见度，粘附图像中的像素尺寸被放大了两倍。(k)首先不进行处理(灰色)，然后进行na处理(蓝色)、添加游离neu5ac(红色)，最后注射jam
‑
a ab(棕色)所观察到的t3sa+病毒粒子的bf的箱形图。箱形图内的水平线表示中位值，箱的边界表示第25和第75百分位，且须表示结果的最高和最低值。箱中的方块表示平均值。数据代表至少n＝4个独立实验。**，p<0.01；****，p<0.0001；由origin中的双样本t检验确定。
[0039]
图18示出了在不存在(a、b)和存在(c、d)1mm neu5ac的情况下，在cho
‑
jam
‑
a和lec2
‑
jam
‑
a细胞的共培养物上温育的alexa 488标记的t3sa
‑
呼肠孤病毒的实时共聚焦荧光成像。(a、c)alexa 488(病毒粒子)、mcherry(lec2
‑
jam
‑
a的肌动蛋白)和pmt信号的叠加图像。(b、d)t3sa颗粒的时移轨迹。白色(b中的1和2；d中的1
‑
3)和黄色(b中的3
‑
5；d中的4
‑
5)轨迹分别表示lec2
‑
jam
‑
a细胞和cho
‑
jam
‑
a细胞上的病毒粒子运动。每个轨迹的放大倍数显示在右侧，并带有相应的数字(比例尺：1μm)。由于t3sa
‑
缺乏sa结合，所以t3sa
‑
颗粒在两种细胞类型上的扩散程度相似，且与添加1mm neu5ac(右图中添加neuac)无关。
[0040]
相应附图的彩色版本也可参考koehler等人，glycan
‑
mediated enhancement of reovirus receptor binding.nat commun.2019,vol.10,4460。
具体实施方式
[0041]
如本文所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该”既包括单数指代，又包括复数指代，除非上下文另外明确指出。
[0042]
本文所使用的术语“包括”、“包含”和“由...组成”与“含有”同义，并且是包容的或开放的，且不排除附加的、未提及的元件、构件或方法步骤。这些术语还包括“由...组成”和“基本由...组成”，它们在专利术语中具有既定含义。
[0043]
由端点表述的数值范围包括包含在相应范围内的所有数字和分数，以及所述端点。这适用于数值范围，无论它们是由表达式
“…
至
…”
或表达式
“…
和
…
之间”，还是其他表达式引入。
[0044]
当提及诸如参数、量、持续时间等的可测量值时，本文所使用的术语“约”或“大约”意指包含指定值的变化，例如该指定值+/
‑
10％或更小、优选+/
‑
5％或更小、更优选+/
‑
1％或更小，还更优选+/
‑
0.1％或更小的变化，只要这种变化适合在所公开的本发明中执行。应当理解，修饰语“约”或“大约”所指的值本身也被具体、优选地公开。
[0045]
鉴于术语“一个或多个”或“至少一个”，例如一组元件中的一个或多个元件或至少一个元件，本身是清楚的，因此通过进一步举例说明，该术语尤其包括提及所述元件中的任何一个，或提及所述元件中的任何两个或更多个，例如，所述元件中的任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7个等，直至所有所述元件。在另一个实例中，“一个或多个”或“至少一个”可指代1、2、3、4、5、6、7个或更多。
[0046]
本文包括对本发明背景的讨论用以解释本发明的上下文。这不应被视为承认所提及的任何材料都是在任何权利要求的优先权日之前已在任何国家出版、已知或是部分公知常识。
[0047]
在本发明中，通篇引用各种出版物、专利和已公布的专利说明书作为参考文献。本说明书中引用的所有文件均通过引用全文并入本文中。具体而言，本文中具体提及的此类文件的教导或部分通过引用并入本文。
[0048]
除非另有限定，否则用于公开本发明的所有术语，包括技术术语和科学术语，均具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，本文包括术语定义，以更好地理解本发明的教导。当结合本发明的特定方面或本发明的特定实施例方案来定义特定术语时，除非另有限定，否则该内涵或含义意在应用于整个说明书，即，也应用于本发明的其他方面或实施方案的上下文中。
[0049]
在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面或实施方案。如此定义的每个方面或实施方案均可与任何其他方面或实施方案组合，除非有明确的相反指示。特别地，指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的任何其他特征组合。
[0050]
贯穿本说明书对“一个实施方案”、“实施方案”的引用是指，本发明的至少一个实施方案中包括结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性。因此，在本说明书中，短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”在各个地方的出现不一定都是指同一实施方案，但可以指代同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合，如本领域技术人员根据本发明显而易见的那样。此外，虽然本文所述的一些实施方案包括其他实施方案中包含的一些(而非其他)特征，但是不同实施方案的特征的组合意指在本发明的范围内，并且形成不同的实施方案，如本领域技术人员所理解的。例
如，在所附权利要求书中，所要求保护的实施方案中的任何一个都可以以任何组合使用。
[0051]
如示出本发明的某些代表性实施方案的实验部分所证实的，本发明人首次证明了唾液酸(sa)与呼肠孤病毒sigma 1(σ1)蛋白结合会积极促进σ1蛋白的构象向更伸展或延伸的构象变化，从而触发σ1与jam
‑
a表面受体的结合电位，增加病毒与细胞表面之间所建立的键数，有利于病毒进入细胞溶质。因此，数据证实，使用唾液酸或含唾液酸物质作为能够增强呼肠孤病毒感染性的试剂或佐剂。
[0052]
因此，本发明的一方面提供了一种组合物或成套试剂盒，其包含i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒，以及ii)唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子。因此，特别提供了：
[0053]
‑
一种组合物，其包含i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒以及ii)唾液酸，或基本由或由i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒以及ii)唾液酸组成；
[0054]
‑
一种组合物，其包含i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒以及ii)包含至少一个唾液酸部分的分子，或基本由或由i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒以及ii)包含至少一个唾液酸部分的分子组成；
[0055]
‑
一种组合物，其包含i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒以及ii)唾液酸和包含至少一个唾液酸部分的分子，或基本由或由i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒以及ii)唾液酸和包含至少一个唾液酸部分的分子组成；
[0056]
‑
一种成套试剂盒，其包含i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒以及ii)唾液酸，或基本由或由i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒以及ii)唾液酸组成；
[0057]
‑
一种成套试剂盒，其包含i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒以及ii)包含至少一个唾液酸部分的分子，或基本由或由i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒以及ii)包含至少一个唾液酸部分的分子组成；以及
[0058]
‑
一种成套试剂盒，其包含i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒以及ii)唾液酸和包含至少一个唾液酸部分的分子，或基本由或由i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒以及ii)唾液酸和包含至少一个唾液酸部分的分子组成。
[0059]
另一方面提供了用于疗法中的该组合物。相关方面提供了该组合物在疗法中的用途。另一方面提供了用于疗法中的该成套试剂盒。相关方面提供了该成套试剂盒用于疗法中的用途。另一方面提供了一种治疗有此需要的受试者的方法，该方法包括使该受试者施用预防或治疗有效量的i)作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒，以及ii)唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子。
[0060]
另一方面l提供了一种作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒的体外繁殖方法，该方法包括：i)感染易受所述病毒感染的宿主细胞，其中该宿主细胞已经在唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子的存在下用所述病毒进行了基因工程改造，以过表达jam
‑
a，或者其中所述病毒先前已用唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子进行了处理；ii)使病毒可以在所述宿主细胞中进行繁殖；以及任选地iii)分离宿主细胞产生的繁殖病毒。在宿主细胞中瞬时地或稳定地、组成地或诱导地过度表达目标蛋白的技术是本领域技术人员所熟知的，并且不需要进行详细描述。jam
‑
a蛋白和编码它的核酸也是众所周知的。例如，人jam
‑
a mrna序列在ncbi
‑
genbank下进行了注释(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，登录号为nm_016946.6。例如，人jam
‑
a前体蛋白序列在ncbi genbank下注释，登录号为np_
058642.1，并在下面示出(seq id no：1)(显示或预测了seq id no：1的氨基酸1至27构成从成熟jam
‑
a处理掉的信号肽)：
[0061]
mgtkaqverkllclfilaillcslalgsvtvhssepevripennpvklscaysgfssprvewkfdqgdttrlvcynnkitasyedrvtflptgitfksvtredtgtytcmvseeggnsygevkvklivlvppskptvnipssatignravltcseqdgsppseytwfkdgivmptnpkstrafsnssyvlnpttgelvfdplsasdtgeyscearngygtpmtsnavrmeavernvgvivaavlvtlillgilvfgiwfaysrghfdrtkkgtsskkviysqpsarsegefkqtssflv(seq id no：1)
[0062]
所有的jam
‑
a异构体都包括在内。例如，已经知道jam
‑
a的一种可变性剪接异构体缺乏seq id no：1的氨基酸81
‑
129，如下所示(seq id no：2)：
[0063]
mgtkaqverkllclfilaillcslalgsvtvhssepevripennpvklscaysgfssprvewkfdqgdttrlvcynnkitvppskptvnipssatignravltcseqdgsppseytwfkdgivmptnpkstrafsnssyvlnpttgelvfdplsasdtgeyscearngygtpmtsnavrmeavernvgvivaavlvtlillgilvfgiwfaysrghfdrtkkgtsskkviysqpsarsegefkqtssflv(se q id no：2)。
[0064]
过度表达包括任何高于或超过宿主细胞自然显示的jam
‑
a表达水平(即，在未进行基因工程改造的情况下显示的)的表达水平。
[0065]
术语“组合物”通常是指由两个或更多个组分构成的东西，更具体地，是指两种或更多种材料(例如，元素、分子、物质、生物分子或微生物材料)的混合物或共混物，以及由该组合物的材料形成的反应产物和分解产物。考虑到其用途，本发明的组合物可以配置为药物组合物。药物组合物通常包含一种或多种药理学活性成分(具有一种或多种药理作用的化学和/或生物活性材料)以及一种或多种药学上可接受的载体。本文中通常使用的组合物可以是液体、半固体或固体，并且可包括溶液或分散体。
[0066]
术语“试剂盒”或“成套试剂盒”可互换使用，并且是指含有两种或更多种组分(更具体地，两种或更多种材料(例如，元素、分子、物质、生物分子或微生物分子)，以及/或者由该试剂盒的材料形成的反应产物和分解产物)的合成物(组合产物)，其中该合成物的一种或多种组分与该合成物的一种或多种其他组分保持物理分离(例如，分装在单独的隔室、容器或小瓶内)，但是相邻的，通常作为同一产品包装或分配装置的一部分。这样的布置使得消费者或医生可以在使用前才混合试剂盒的组分，或者单独使用或施用试剂盒中物理分离的组分，例如同时或以任何顺序依次使用或施用。
[0067]
例如而非限制，本文所公开的组合物可包含呼肠孤病毒科病毒以及唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子，或基本由或由呼肠孤病毒科病毒以及唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子组成。该组合物可以是还包含一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。该组合物或药物组合物可包含在试剂盒中，与试剂盒的一个或多个其他组分物理分离。例如而非限制，本文所公开的试剂盒可包含呼肠孤病毒科病毒，以及唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子，其中呼肠孤病毒科病毒与唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子物理分离。例如，该试剂盒可包括包含呼肠孤病毒科病毒的组合物，其与包含唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子的组合物物理分离。该组合物中的一种或多种可包含一种或多种药学上可接受的载体。
[0068]
在本上下文中，该组合物或成套试剂盒特别是指人造制剂、物品或制品。此类组合物或成套试剂盒特别适用于医疗领域(如疗法中)。从这个角度来看，该术语可排除呼肠孤
病毒科病毒和唾液酸或包含至少一个唾液酸部分的分子仅作为呼肠孤病毒科病毒与在其细胞表面上显示唾液酸或包含至少一个唾液酸的分子(例如，包含在修饰细胞表面糖蛋白或神经节苷脂的聚糖中)的宿主细胞之间接触的一部分而聚集或靠近的情况，无论这种接触是在宿主细胞自然感染该病毒期间发生的，还是在实验室(如细胞培养中)再现的。因此，在特定实施方案中，该组合物或成套试剂盒中不包含细胞，如特别是呼肠孤病毒科病毒的宿主细胞，或包含呼肠孤病毒科病毒同源细胞表面受体的细胞。在特定实施方案中，该组合物或成套试剂盒不包含细胞膜，如特别是由呼肠孤病毒科病毒的宿主细胞制备的细胞膜，或由包含呼肠孤病毒科病毒同源细胞表面受体的细胞制备的细胞膜。在特定实施方案中，该组合物或该成套试剂盒不包含呼肠孤病毒科病毒同源细胞表面受体，因此当该病毒是该组合物或该成套试剂盒的一部分时，该呼肠孤病毒科病毒不与其同源受体进行相互作用。在特定实施方案中，唾液酸或包含至少一个唾液酸部分的分子不与细胞或细胞膜的表面缔合或结合，例如不包含在细胞表面的糖蛋白或神经节苷脂(例如，跨膜或细胞外糖蛋白或神经节苷脂)的聚糖中。在特定实施方案中，该组合物或成套试剂盒不包含由与细胞或细胞膜结合的呼肠孤病毒科病毒组成的复合物，例如其中该细胞或细胞膜包含与其缔合或结合的唾液酸或包含至少一个唾液酸部分的分子，以及任选地呼肠孤病毒科病毒的同源细胞表面受体。在特定实施方案中，当呼肠孤病毒科病毒是该组合物或该成套试剂盒的一部分时，该组合物或该成套试剂盒不包括包含与其同源受体相互作用的呼肠孤病毒科病毒的复合物。
[0069]
短语“作为呼肠孤病毒科家族成员的病毒”或“呼肠孤病毒科家族病毒”或“呼肠孤病毒科病毒”包括按照既定的病毒分类法或分类学惯例(如按照国际病毒分类委员会(ictv)分类系统)被分类或将被分类为呼肠孤病毒科家族的任何病毒。通过进一步指导而非限制，呼肠孤病毒科病毒是核糖核酸(rna)病毒，其包含分段(通常为10至12段)双链rna核，缺乏外脂膜，并具有包含同心外蛋白壳和同心内蛋白壳的二十面体衣壳。
[0070]
本文包括呼肠孤病毒科亚科病毒，包括光滑呼肠孤病毒(sedoreovirinae)亚科和刺突呼肠孤病毒(spinareovirinae)亚科。
[0071]
本文包括任何呼肠孤病毒科属的病毒，特别包括甲壳动物呼肠孤病毒属(cardoreovirus)、微胞藻呼肠孤病毒属(mimoreovirus)、环状病毒属(orbivirus)、植物呼肠孤病毒属(phytoreovirus)、轮状病毒属(rotavirus)、东南亚十二节段rna病毒属(seadornavirus)、水生动物呼肠孤病毒属(aquareovirus)、科罗拉多壁虱热病毒属(coltivirus)、质型多角体病毒属(cypovirus)、迪诺维纳病毒属(dinovernavirus)、斐济病毒属(fijivirus)、昆虫非包涵体病毒属(idnoreovirus)、真菌呼肠孤病毒属(mycoreovirus)、正呼肠孤病毒属(orthoreovirus)和水稻病毒属(oryzavirus)。不受限制地，已知正呼肠孤病毒属、环状病毒属、科罗拉多壁虱热病毒属和轮状病毒属会感染人类；已知某些正呼肠孤病毒属会感染鸟类；已知植物呼肠孤病毒属和斐济病毒属会感染植物和昆虫；已知质型多角体病毒属会感染昆虫；并且已知水生呼肠孤病毒属会感染鱼类。
[0072]
本文还包括任何呼肠孤病毒科物种的病毒，尤其包括中华绒螯蟹呼肠孤病毒(eriocheir sinensis reovirus)(甲壳动物呼肠孤病毒属)；细小微胞藻呼肠孤病毒(micromonas pusilla reovirus)(微胞藻呼肠孤病毒属)；非洲马瘟病毒(african horse sickness virus)、蓝舌病病毒(bluetongue virus)、钱吉诺拉病毒(changuinola virus)、秦纽达病毒(chenuda virus)、乔巴峡病毒(chobar gorge virus)、科里帕塔病毒
(corriparta virus)、动物流行性出血病病毒(epizootic hemorrhagic disease virus)、马脑炎病毒(equine encephalosis virus)、北澳蚊病毒(eubenangee virus)、大岛病毒(great island virus)、伊理病毒(ieri virus)、莱邦博病毒(lebombo virus)、奥伦盖病毒(orungo virus)、帕利亚姆病毒(palyam virus)、秘鲁马瘟病毒(peruvian horse sickness virus)、圣克罗伊河病毒(st croix river virus)、尤马蒂拉病毒(umatilla virus)、瓦德麦达尼病毒(wad medani virus)、沃勒尔病毒(wallal virus)、沃里戈病毒(warrego virus)、王戈尔病毒(wongorr virus)、云南环状病毒(yunnan orbivirus)(所有的环状病毒属)；水稻矮缩病毒(rice dwarf virus)、水稻瘤矮病毒(rice gall dwarf virus)、伤瘤病毒(wound tumor virus)(所有的植物呼肠孤病毒属)；环状病毒a、b、c、d、e、f、g、h、i型(所有的轮状病毒属)；版纳病毒(banna virus)、卡迪皮诺病毒(kadipiro virus)、辽宁病毒(liao ning virus)(所有的东南亚十二节段rna病毒属)；水生动物呼肠孤病毒属a、b、c、d、e、f、g型(所有的水生动物呼肠孤病毒属)；科罗拉多蜱传热病毒(colorado tick fever virus)、埃亚契病毒(eyach virus)(所有的科罗拉多壁虱热病毒属)；质型多角体病毒属1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16型(所有的质型多角体病毒属)；假鳞斑伊蚊呼肠孤病毒(aedes pseudoscutellaris reovirus)(迪诺维纳病毒属)；斐济病病毒(fiji disease virus)、大蒜矮缩病毒(garlic dwarf virus)、玉米粗缩病毒(maize rough dwarf virus)、里奥夸尔托病毒(mal de rio cuarto virus)、褐飞虱呼肠孤病毒(nilaparvata lugens reovirus)、燕麦不孕矮缩病毒(oat sterile dwarf virus)、马唐矮化病毒(pangola stunt virus)、水稻黑条矮缩病毒(rice black streaked dwarf virus)、南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black
‑
streaked dwarf virus)(所有的斐济病毒属)；昆虫非包涵体病毒1、2、3、4、5型(所有的昆虫非包涵体病毒属)；真菌呼肠孤病毒1、2、3型(所有的真菌呼肠孤病毒属)；禽正呼肠孤病毒(avian orthoreovirus)、狒狒正呼肠孤病毒(baboon orthoreovirus)、mahlapitsi orthoreovirus、哺乳动物正呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus)、尼尔森湾正呼肠孤病毒(nelson bay orthoreovirus)、鱼正呼肠孤病毒(piscine orthoreovirus)、爬行动物正呼肠孤病毒(reptilian orthoreovirus)(所有的正呼肠孤病毒属)；稗草齿叶矮缩病毒(echinochloa ragged stunt virus)、水稻齿叶矮缩病毒(rice ragged stunt virus)(所有的水稻病毒属)。本文还包括任何呼肠孤病毒科物种内的任何血清型、毒株、克隆体或分离物的病毒。
[0073]
在某些实施方案中，呼肠孤病毒科病毒对动物显示出宿主嗜性。宿主嗜性是指病毒对特定宿主、宿主群或宿主分类单元的感染特异性。病毒通常可特异性地感染宿主的一种或多种细胞类型、组织或器官(组织嗜性)。因此，病毒可感染动物，但不能感染植物、原生生物和真菌。在某些实施方案中，呼肠孤病毒科病毒对至少一个动物属表现出宿主嗜性，如仅对一个特定动物属，或仅对两个或多个特定动物属，或更广泛地对一系列动物物种或属表现出宿主嗜性。
[0074]
在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒对至少一个动物物种表现出宿主嗜性，如仅对一个特定动物物种，或仅对两个或更多个特定动物物种(其通常可属于但不需要属于同一动物属)，或更广泛地对一系列动物物种或属表现出宿主嗜性。在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒对至少一个温血动物物种表现出宿主嗜性，如仅对一个特定温血动物
物种，或仅对两个或更多个特定温血动物物种(其通常可属于但不需要属于同一温血动物属)，或更广泛地对一系列温血动物物种或属表现出宿主嗜性。
[0075]
在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒对至少一个脊椎动物物种显示出宿主嗜性，如仅对一个特定脊椎动物物种，或仅对两个或更多个特定脊椎动物物种(其通常可属于但不需要属于同一脊椎动物属)，或更广泛地对一系列脊椎动物物种或属显示出宿主嗜性。术语“脊椎动物”广义上包括按照既定分类学惯例分类在脊椎动物亚门内的任何动物，例如包括某些种类的鱼，以及两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物。
[0076]
在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒对至少一个鸟类物种显示出宿主嗜性，如仅对一个特定鸟类物种，或仅对两个或更多个特定鸟类物种(其通常可属于但不需要属于同一鸟类属)，或更广泛地对一系列鸟类物种或属显示出宿主嗜性。术语“鸟类”广义上包括按照既定分类学惯例分类在鸟纲内的任何脊椎动物。优选的鸟类可以是家禽，包括猎鸟和陆禽(鸡形目)；以及水禽(雁形目)，如鸡、鹌鹑、火鸡、鹧鸪、雉鸡、鸭子、鹅或天鹅。
[0077]
在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒对至少一个哺乳动物物种显示出宿主嗜性，如仅对一个特定哺乳动物物种，或仅对两个或更多个特定哺乳动物物种(其通常可属于但不需要属于同一哺乳动物物种)，或更广泛地对一系列哺乳动物物种或属显示出宿主嗜性。术语“哺乳动物”广义上包括按照既定分类学惯例划分为哺乳动物纲的任何脊椎动物，例如包括人类、非人类灵长类动物、啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)、犬科动物、猫科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物等。
[0078]
在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒对人类显示出宿主嗜性。这里所指的任何分类单元(如物种)包括该物种中任何性别(例如，雄性或雌性)和任何年龄的个体。
[0079]
在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒是正呼肠孤病毒属，如禽正呼肠孤病毒、狒狒正呼肠孤病毒、mahlapitsi orthoreovirus、哺乳动物正呼肠孤病毒、尼尔森湾正呼肠孤病毒、鱼正呼肠孤病毒或爬行动物正呼肠孤病毒。在某些优选实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒是禽正呼肠孤病毒，包括其任何血清型或毒株。尤其禽正呼肠孤病毒在家禽群中广泛存在，因此其具有重要的经济意义。
[0080]
在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒是哺乳动物正呼肠孤病毒。哺乳动物正呼肠孤病毒会感染许多哺乳动物物种，包括人类。哺乳动物或人类正呼肠孤病毒属通常也简称为“呼肠孤病毒”，这是“呼吸道肠道孤儿病毒“的一个描述性缩写，根据历史观察，该病毒可以从人类的呼吸道和肠道中分离，但与人类的任何已知疾病状态不相关(sabin.reoviruses:a new group of respiratory and enteric viruses formerly classified as echo type 10is described.science.1959,vol.130,1387
–
1389)。因此，在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒是人类呼肠孤病毒。本文还包括呼肠孤病毒的任何血清型或毒株。目前，呼肠孤病毒包括四种已知血清型(或毒株)，即，1型(lang株、t1l)、2型(jones株、t2j)、3型(dearing株或abney株、t3d)和4型(ndelle株、t4n)。在某些优选实施方案中，该呼肠孤病毒可以是呼肠孤病毒3型。这些血清型尤其可基于本领域已知的抗体中和和血凝抑制测定来进行区分。有时，“呼肠孤病毒”的名称在本领域中也可用于表示其他正呼肠孤病毒物种，如在“禽呼肠孤病毒”一词中。
[0081]
在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒是环状病毒属，如非洲马瘟病毒、蓝舌病病毒、钱吉诺拉病毒、秦纽达病毒、乔巴峡病毒、科里帕塔病毒、动物流行性出血病病毒、马
脑炎病毒、北澳蚊病毒、大岛病毒、伊理病毒、莱邦博病毒、奥伦盖病毒、帕利亚姆病毒、秘鲁马瘟病毒、圣克罗伊河病毒、尤马蒂拉病毒、瓦德麦达尼病毒、沃勒尔病毒、沃里戈病毒、王戈尔病毒或云南环状病毒，包括其任何血清型或毒株。环状病毒属可感染节肢动物和脊椎动物宿主，并在节肢动物和脊椎动物宿主中广泛复制，包括但不限于牛、山羊和绵羊、野生反刍动物、马科动物、骆驼科动物、有袋类动物、树懒、蝙蝠、鸟类、大型犬科和猫科食肉动物以及人类。在某些优选实施方案中，该环状病毒属是蓝舌病病毒、非洲马瘟病毒或动物流行性出血病病毒，包括其任何血清型或毒株，由于其常出现在具有重要经济价值的动物(如绵羊、牛、水牛、鹿、马、骡子和驴子)中，因此具有重要的经济价值。
[0082]
在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒是轮状病毒属，如轮状病毒a、b、c、d、e、f、g、h、i型，包括其任何血清型或毒株，其是婴幼儿腹泻的最常见病因。在某些优选实施方案中，该轮状病毒属是轮状病毒a型，包括其任何血清型或毒株，其是引起人类90％以上轮状病毒感染的最常见物种。
[0083]
然而，本文所使用的对病毒的提及可包括处于其生命周期任何阶段的病毒，以及在其生命周期过程中呈任何形状或形式的病毒，特别地该术语意指病毒颗粒或病毒粒子，更特别地是指完整的病毒颗粒或病毒粒子。
[0084]
该呼肠孤病毒科病毒可以是天然存在或非天然存在的。当该病毒是从天然来源分离出来，并选择性地在适当的生物系统(如在易受病毒感染的培养细胞系)中繁殖，并且被收集、富集或纯化，但没有被人类有意修饰时，可以认为该病毒是“天然存在的”。例如，该病毒可能是从野生来源分离出来的，例如宿主个体，如感染了病毒的人类个体。该病毒可以是培养适应性的。与相应的天然存在的病毒相比，该病毒经修饰后可被认为是“非天然存在的”。这种修饰可包括实质上改变病毒结构的化学或生物化学处理，例如但不限于将可检测标记物连接至外衣壳、蛋白水解地截短或去除外衣壳的一个或多个组分，或将病毒包裹在脂质体或胶束中，并和/或者可包括对病毒核酸进行基因改造。基因改造可改变一个或多个病毒基因和/或围绕一个或多个病毒基因的核酸，并且可能影响病毒进程，如病毒感染性、病毒dna复制、病毒蛋白合成、病毒颗粒组装及成熟，以及病毒颗粒释放，或者可引入插入异源核酸病毒的位点。此类异源核酸可例如但不限于包括对宿主细胞有害或有毒的基因有效荷载，例如以进一步刺激溶瘤形式的病毒对赘生性细胞的毒性。例如，也可以引入编码凋亡诱导剂、介导体或执行者的基因，如tnf相关凋亡诱导配体(trail)、白细胞介素24、半胱天冬酶，或抗凋亡基因的sirna或微小rna沉默子。当该病毒是通过重组具有不同致病表型的呼肠孤病毒科物种的两个或更多个亚型(如两个或更多个呼肠孤病毒亚型)而得到，使得其包含不同的抗原决定簇，从而降低或阻止先前暴露于呼肠孤病毒科病毒的宿主(如先前暴露于呼肠孤病毒亚型的哺乳动物)的免疫应答时，该病毒也可视作“非天然存在的”。这种重组病毒粒子可以通过用呼肠孤病毒科病毒的不同亚型(如呼肠孤病毒的不同亚型)共感染宿主细胞，从而将不同亚型外壳蛋白整合到所产生的病毒粒子衣壳中而产生。
[0085]
本文所预期的呼肠孤病毒科病毒可以特别是活病毒，在这个意义上，该病毒能够感染易受所述病毒感染的宿主细胞，如体外培养的宿主细胞(此类细胞通常表达病毒的同源表面受体，并允许病毒复制)。这种感染通常涉及几个阶段或步骤，包括病毒颗粒粘附至宿主细胞表面的同源受体、它们的摄取、细胞内运输和渗透到细胞溶质中、脱壳、病毒核酸复制和病毒蛋白产生，以及新产生的病毒颗粒的组装和释放。在某些实施方案中，该病毒可
感染宿主细胞，而不裂解宿主细胞(非裂解性感染)。在某些实施方案中，病毒感染宿主细胞可导致宿主细胞裂解(裂解性感染)。换言之，此类呼肠孤病毒科病毒不会变得无法存活、失活或被杀死。
[0086]
呼肠孤病毒科病毒可从野生来源分离，如从感染该病毒的宿主的生物样品中分离。根据病毒的组织嗜性，病毒颗粒可流入各种生物样品，并从中回收，这些生物样品可包括器官或组织样本、全血、血浆、淋巴、血清、血细胞、唾液、尿液、粪便(排泄物)、眼泪、汗液、皮脂、乳头抽吸液、乳腺导管冲洗液、滑液、脑脊髓液、羊水、精液、阴道分泌物、炎症液或任何其他体液、渗出液或分泌液。例如，可在必要时使用标准的组织均质技术(如在适当的缓冲液中切碎和混合)使样品均质，可通过离心使碎片粒化，并可收集含病毒的上清液，并使其通过0.45μm或0.25μm，使细胞分离并允许病毒通过。所得的滤液可用于接种悬浮或单层培养的易于受病毒感染的合适培养细胞系，以繁殖病毒。例如，哺乳动物呼肠孤病毒通常可使用小鼠成纤维细胞l929细胞系培养(尤其可从以下获得：european collection of cell cultures,ecacc,health protection agency
–
porton down salisbury,wiltshire sp4 0jg,united kingdom,cat.no.85011425)。还参见berard&coombs.mammalian reoviruses:propagation,quantification,and storage.curr protoc microbiol.2009chapter 15:unit 15c.1。可通过氯化铯梯度离心法从感染的细胞裂解液中纯化繁殖的病毒，以供进一步使用。上下文中的术语“纯化”不需要绝对纯度。相反，它表示被纯化的东西处于一个离散的环境中，在这个环境中，它相对于其他成分的丰度大于原始物质中的丰度。离散环境表示单一介质，例如单一溶液、凝胶、沉淀物、冻干剂等。在纯化之后，病毒蛋白或多肽可优选地占离散环境蛋白含量的≥10％，更优选≥50％，例如≥60％，但更优选≥70％，例如≥80％，再更优选≥90％，例如≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或甚至100％。蛋白含量可例如通过lowry方法(lowry et al.1951j biol chem 193:265)测定，可选地如hartree 1972anal biochem48:422
‑
427所述。肽、多肽或蛋白的纯度可通过sds
‑
page在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色测定。病毒的病毒感染性可通过使用标准技术测定病毒滴度来确定，例如噬斑测定或通过计算感染剂量，或者通过测定受攻击宿主的病毒载量。必要时，可通过标准程序保存病毒，例如使用常用的抗冻剂(如甘油或dmso)进行冷冻保存，或使用常用的稳定剂(如葡萄糖、脱脂乳或蔗糖
‑
磷酸酯
‑
谷氨酸
‑
白蛋白(spga))进行冷冻干燥(冻干)。病毒鉴定也可采用标准技术，例如测序、免疫测定法(如，elisa)来检测特征性表面抗原等。
[0087]
或者，该呼肠孤病毒科病毒可以从例如美国典型培养物保藏中心(atcc)(10801university blvd.manassas,virginia 20110
‑
2209,usa)或者通过国家病原性病毒保藏中心(ncpv)(public health england
–
porton down salisbury,wiltshire sp4 0jg,united kingdom)的公共收藏获得，包括但不限于哺乳动物呼肠孤病毒atcc acc.no.vr
‑
215、vr
‑
231、vr
‑
232、vr
‑
824、vr
‑
871或ncpv目录号0006252v，或禽正呼肠孤病毒atcc acc.no.vr
‑
826、vr
‑
857、vr
‑
2449、pta
‑
47。
[0088]
完整的呼肠孤病毒科病毒通常包括两个同心衣壳，尽管用于表示这些结构的术语可能不同(例如，外衣壳和内衣壳；外衣壳和内核；外壳和内壳)。质型多角体病毒属和迪诺维纳病毒属是例外，因为它们包含一个衣壳。此外，一些属(如轮状病毒属和环状病毒属)可描述为还包含介于外衣壳和内衣壳之间的中间衣壳。
[0089]
例如，在正呼肠孤病毒属物种(包括禽正呼肠孤病毒和哺乳动物正呼肠孤病毒)中，内衣壳由内衣壳蛋白lambda 1和sigma 2形成，外衣壳由外衣壳蛋白lambda 2、mu 1、sigma 1和sigma 3组成。已知对呼肠孤病毒进行蛋白酶处理(例如通过糜蛋白酶)可以通过去除sigma 3、切割mu 1以产生delta和phi，以及将sigma 1重新排列为更伸展的构象，而产生感染性亚病毒颗粒(isvp)。在某些优选实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒，例如但不限于正呼肠孤病毒(例如但不限于，禽正呼肠孤病毒或哺乳动物正呼肠孤病毒)，包括外衣壳和内核。例如，此类病毒没有经过蛋白酶处理，就产生了isvp。
[0090]
在不受任何理论约束的情况下，本发明人发现，唾液酸与呼肠孤病毒外衣壳蛋白sigma 1(σ1)蛋白的相互作用积极地促进σ1蛋白的构象向更伸展或延伸的构象变化，从而有利地导致病毒结合同源细胞表面受体的能力增强，进而感染细胞。
[0091]
因此，在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒包含能够与宿主细胞表面受体结合的外衣壳蛋白，其中该唾液酸或包含至少一个唾液酸部分的该分子使得所述外衣壳蛋白在呼肠孤病毒科病毒上采用比在不存在唾液酸或包含至少一个唾液酸部分的分子的情况下的构象更伸展或延伸的构象。在本上下文中，短语“能够与宿主细胞表面受体结合”表示外衣壳蛋白与其同源细胞表面受体之间的特异性相互作用。蛋白的这种相对伸展或延伸构象的出现可以例如使用合适的病毒可视化方法来确定，例如如实施例中所示的x
‑
射线晶体衍射、低温电子显微镜(cryo
‑
em)和/或原子力显微镜(afm)。
[0092]
因此，在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒包含能够与宿主细胞表面受体结合的外衣壳蛋白，其中该唾液酸或包含至少一个唾液酸部分的该分子使所述外衣壳蛋白与宿主细胞表面受体的结合比在不存在唾液酸或包含至少一个唾液酸部分的分子的情况下的结合更强烈。结合的强度可以例如使用实施例中采用的原子力显微镜(afm)来确定。
[0093]
在优选实施方案中，该外衣壳蛋白是sigma
‑
1蛋白。在某些优选实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒是正呼肠孤病毒属，例如但不限于禽正呼肠孤病毒或哺乳动物正呼肠孤病毒，其包含能够与宿主细胞表面受体结合的外衣壳蛋白sigma
‑
1(如结合粘附分子(jam)蛋白，更具体地是由呼肠孤病毒识别的jam
‑
a蛋白)，其中该唾液酸或包含至少一个唾液酸部分的该分子使得所述sigma
‑
1蛋白在病毒上采用比在不存在唾液酸或包含至少一个唾液酸部分的分子的情况下的构象更伸展或延伸的构象。在某些优选实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒是正呼肠孤病毒属，例如但不限于禽正呼肠孤病毒或哺乳动物正呼肠孤病毒，其包含能够与宿主细胞表面受体结合的外衣壳蛋白sigma
‑
1(如jam蛋白，更具体地是由呼肠孤病毒识别的jam
‑
a蛋白)，其中该唾液酸或包含至少一个唾液酸部分的该分子使得所述sigma
‑
1蛋白与宿主细胞表面受体的结合比在不存在唾液酸或包含至少一个唾液酸部分的分子的情况下的结合更强烈。
[0094]
如图7所示并在本说明书其他地方讨论的，呼肠孤病毒σ1蛋白可包含尾部结构域(如特别由α
‑
螺旋卷曲螺旋和三
‑
β螺旋形成的)以及头部结构域(如特别由紧凑的八链β
‑
桶形成)。尾部结构域(特别是三
‑
β螺旋)可与α
‑
sa结合，而头部结构域可与jam
‑
a结合。因此，在某些实施方案中，如本文所预期的σ1蛋白可包含能够与α
‑
sa结合的尾部结构域和能够与jam
‑
a结合的头部结构域。
[0095]
在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒为溶瘤病毒。术语“溶瘤病毒”泛指能够在分裂细胞，更优选在赘生性细胞(如肿瘤细胞、癌细胞)中选择性复制的病毒，其目的是在
体外或体内减缓所述细胞的生长和/或裂解，同时在非分裂细胞，更优选在非赘生性细胞中显示不复制或最小复制。溶瘤病毒的优选实例是哺乳动物正呼肠孤病毒3型(如哺乳动物正呼肠孤病毒3型dearing株)，其在转化细胞中优先诱导细胞裂解和死亡，并因此显示出固有的溶瘤特性。更具体地，呼肠孤病毒3型dearing株能够通过激活的ras信号传导途径在转化细胞中复制，而正常的未转化细胞无法支持感染。因此，在某些实施方案中，如本文所预期的易受溶瘤呼肠孤病毒科病毒感染的赘生性细胞可包含组成性ras
‑
map信号传导或以组成性ras
‑
map信号传导为特征。
[0096]
因此，在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒是溶瘤哺乳动物正呼肠孤病毒3型，更优选为3型dearing株。例如但非限制，溶瘤呼肠孤病毒的一个实施方案由oncolytics biotech inc.(calgary，alberta，canada)以商标制造，特别指示用于实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤。reolysin是未经修饰的呼肠孤病毒的非致病性专有分离物，其诱导选择性肿瘤裂解，并通过先天性和适应性免疫应答促进炎症肿瘤表型，例如wo 2000/050051中所设想的。
[0097]
因此，在某些实施方案中，本文所设想的是使用唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子作为呼肠孤病毒科病毒(如本文所预期的溶瘤呼肠孤病毒科病毒)的佐剂，以增强病毒感染性的用途或方法。
[0098]
在某些实施方案中，该溶瘤呼肠孤病毒科病毒可与能够与赘生性细胞特异性结合的结合剂共同施用，例如，以相同组合物共同施用，或以任何顺序从单独组合物同时或以一定顺序共同施用。在某些优选实施方案中，该溶瘤呼肠孤病毒科病毒可与能够与赘生性细胞特异性结合的结合剂连接，例如共价或非共价连接，优选共价连接。在某些实施方案中，非共价连接可涉及为呼肠孤病毒科病毒和结合剂各自提供亲和力对的不同部分或组分，例如但不限于生物素
‑
链霉抗生物素蛋白亲和力对或抗体
‑
半抗原亲和力对。例如，链霉抗生物素蛋白可连接(通常可共价连接)至呼肠孤病毒科病毒，而生物素可连接(通常可供价连接)至结合剂，或者反之亦然。
[0099]
术语“特异性结合”是指试剂(本文中也称为“结合剂”或“特异性结合剂”)与一个或多个期望靶点(如肽、多肽、蛋白、核酸或细胞)结合，基本上排除随机或不相关的其他实体，且任选地基本上排除结构上相关的其他分子。术语“特异性结合”并不一定要求试剂只与其预期靶点结合。例如，如果试剂在结合条件下对此预期靶点的亲和力比其对非靶点的亲和力大至少约2倍，优选大至少约5倍，更优选大至少约10倍，再更优选大至少25倍，还更优选大至少约50倍，甚至更优选大至少100倍，或至少约1000倍，或至少约104倍，或至少约105倍，或至少约106倍或更高，则可以说该试剂与目标靶点特异性结合。优选地，特异性结合剂可以与其预期靶点结合，此结合的亲和常数(k
a
)为k
a
≥1
×
106m
‑1，更优选为k
a
≥1
×
107m
‑1，还更优选为k
a
≥1
×
108m
‑1，甚至更优选为k
a
≥1
×
109m
‑1，再更优选为k
a
≥1
×
10
10
m
‑1或k
a
≥1
×
10
11
m
‑1或k
a
≥1
×
10
12
m
‑1，其中，k
a
＝[sba_t]/[sba][t]，sba表示特异性结合剂，t表示预期靶点。k
a
的测定可以通过本领域已知的方法进行，例如使用平衡透析法和斯卡查德(scatchard)作图分析法。
[0100]
在一些实施方案中，该结合剂可以是抗体。如本文所使用的，术语“抗体”以其最广义使用，并且通常是指任何免疫结合剂。该术语具体包括完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多价抗体(如2
‑
、3
‑
或更多价抗体)和/或多特异性抗体(如双特异
性抗体或更多特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性(特别是，特异性结合目标抗原的能力(即，抗原结合片段))，以及这种片段的多价和/或多特异性复合物。术语“抗体”不仅包括通过包括免疫接种的方法产生的抗体，还包括任何多肽(例如重组表达的多肽)，其被制为包含能够特异性结合至目标抗原上的表位的互补决定区(cdr)。因此，该术语适用于这些分子，不管它们是在体外还是在体内产生的。
[0101]
抗体可以是iga、igd、ige、igg和igm类中的任何一种，并且优选igg类抗体。抗体可以是多克隆抗体，例如，从其纯化(如亲和纯化)的抗血清或免疫球蛋白。抗体可以是单克隆抗体或单克隆抗体的混合物。单克隆抗体可以以更高的选择性和可重复性靶向特定抗原或抗原内的特定表位。例如而非限制，单克隆抗体可通过kohler等人1975(nature 256:495)首先描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组dna方法(例如，us 4,816,567中所述)制备。单克隆抗体也可以使用如clackson等人1991(nature 352:624
‑
628)和marks等人1991(j mol biol 222:581
‑
597)所述的技术，从噬菌体抗体库中分离。
[0102]
抗体结合剂可以是抗体片段。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab’、f(ab’)2、fv和scfv片段、单结构域(sd)fv，如vh结构域、vl结构域和vhh结构域；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，特别是重链抗体；以及由抗体片段形成的多价和/或多特异性抗体，例如，双抗体、三抗体和多抗体。上述名称fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv等意在具有其本领域既定的含义。
[0103]
术语抗体包括源自或包含衍生自任何动物物种(优选脊椎动物物种，包括例如鸟类和哺乳动物)的一个或多个部分的抗体。不受限制，该抗体可以是鸡、火鸡、鹅、鸭、珍珠鸡、鹌鹑或雉鸡。同样不受限制，该抗体可以是人、鼠(如小鼠、大鼠等)、驴、兔、山羊、绵羊、豚鼠、骆驼(如双峰骆驼和单峰骆驼)、无峰驼(如羊驼(lama paccos)、家羊驼(lama glama)或小羊驼(lama vicugna))或马。
[0104]
本领域技术人员应当理解，抗体可包括一个或多个氨基酸缺失、添加和/或替换(如保守性替换)，只要这种改变保持其与相应抗原结合。抗体还可包括对其组成性氨基酸残基的一种或多种天然或人工修饰(如糖基化等)。
[0105]
生产多克隆和单克隆抗体及其片段的方法以及生产重组抗体或其片段的方法在本领域是众所周知的(参见例如，harlow and lane,“antibodies:alaboratory manual”,cold spring harbour laboratory,new york,1988；harlow and lane,“using antibodies:alaboratory manual”,cold spring harbour laboratory,new york,1999,isbn 0879695447；“monoclonal antibodies:amanual of techniques”,by zola,ed.,crc press 1987,isbn 0849364760；“monoclonal antibodies:a practical approach”,by dean&shepherd,eds.,oxford university press 2000,isbn 0199637229；methods inmolecular biology,vol.248:“antibody engineering:methods and protocols”,lo,ed.,humana press 2004,isbn 1588290921)。
[0106]
在某些实施方案中，该试剂可以是术语和是ablynx nv(比利时)的商标。术语“纳米抗体(nanobody)”在本领域是众所周知的，并且如本文以其最广义使用的包括(1)通过分离重链抗体(优选衍生自骆驼科的重链抗体)的v
hh
结构域获得的免疫结合剂；(2)通过表达编码v
hh
结构域的核苷酸序列获得的免疫结合剂；(3)通过“人源化”天然存在的v
hh
结构域或通过表达编码此类人源化v
hh
结构
域的核酸而获得的免疫结合剂；(4)通过“骆驼化”来自动物物种，特别是哺乳动物物种(如来自人类)的v
h
结构域，或通过表达编码该骆驼化v
h
结构域的核酸而获得的免疫结合剂；(5)通过“骆驼化”本领域所述的“结构域抗体”或“dab”，或通过表达编码此类骆驼化dab的核酸而获得的免疫结合剂；(6)通过使用用于制备蛋白、多肽或其他本身已知的氨基酸序列的合成或半合成技术获得的免疫结合剂；(7)通过使用本身已知的核酸合成技术制备编码纳米抗体的核酸，随后通过表达由此获得的核酸而获得的免疫结合剂；和/或(8)通过前述各项中的一个或多个方法的任何组合而获得的免疫结合剂。本文所使用的“骆驼科”包括旧大陆骆驼科(双峰骆驼和单峰骆驼)，以及新大陆骆驼科(如羊驼、家羊驼和小羊驼)。
[0107]
例如，该结合剂(如抗体)可配置为特异性地结合由赘生性细胞表达的蛋白，如肿瘤抗原。术语“肿瘤抗原”是指与正常或非赘生性细胞相比，由肿瘤细胞(无论是细胞内还是肿瘤细胞表面上(优选肿瘤细胞表面上))独特或差异表达的抗原。例如，肿瘤抗原可存在于肿瘤细胞中或其上，而不常存在于正常细胞或非赘生性细胞(如仅由有限数量的正常组织(如睾丸和/或胎盘)表达)中或上，或者肿瘤抗原以比在正常或非赘生性细胞中或上更大的量存在于肿瘤细胞中或上，或者肿瘤抗原可以以与正常或非赘生性细胞中或上发现的不同的形式存在于肿瘤细胞中或上。因此，该术语包括肿瘤特异性抗原(tsa)(包括肿瘤特异性膜抗原)、肿瘤相关抗原(taa)(包括肿瘤相关膜抗原)、肿瘤上的胚胎抗原、生长因子受体、生长因子配体等。该术语还包括癌症/睾丸(ct)抗原。肿瘤抗原的实例包括但不限于β人绒毛膜促性腺激素(βhcg)、糖蛋白100(gp100/pme117)、癌胚抗原(cea)、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1(gp75/trp1)、酪氨酸酶相关蛋白2(trp
‑
2)、ny
‑
br
‑
1、ny
‑
co
‑
58、ny
‑
eso
‑
1、mn/gp250、独特型、端粒酶、滑膜肉瘤x断裂点基因2(ssx2)、粘蛋白1(muc
‑
1)、黑色素瘤相关抗原(mage)家族的抗原、高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw
‑
maa)、t细胞识别的黑色素瘤抗原1(mart1)、wilms’肿瘤基因1(wt1)、her2/neu、间皮素(msln)、甲胎蛋白(afp)、癌抗原125(ca
‑
125)以及ras或p53的异常形式。赘生性疾病的其他靶点包括但不限于cd37(慢性淋巴细胞白血病)、cd123(急性骨髓性白血病)、cd30(霍奇金/大细胞淋巴瘤)、met(nsclc、胃食管癌)、il
‑
6(nsclc)和gitr(恶性黑色素瘤)。
[0108]
在某些优选实施方案中，唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子可与所述结合剂连接(如共价或非共价连接，优选共价连接)。在某些实施方案中，非共价连接可涉及为唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子和结合剂各自提供亲和力对(如生物素
‑
链霉抗生物素蛋白亲和力对或抗体
‑
半抗原亲和力对)的不同部分或组分。例如，链霉抗生物素蛋白可与唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子连接(通常共价连接)，而生物素可与结合剂连接(通常供价连接)，或者反之亦然。这有助于唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子与连接至所述结合剂的呼肠孤病毒科病毒之间的相互作用。在某些优选实施方案中，溶瘤呼肠孤病毒科病毒与能够与赘生性细胞特异性结合的结合剂连接，且唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子也与所述结合剂连接。在某些优选实施方案中，溶瘤呼肠孤病毒科病毒与能够与赘生性细胞特异性结合的抗体连接，且唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子也与所述抗体连接。
[0109]
这里所期望的两个分子之间的任何共价连接都可以是直接的，也可以通过合适的接头连接，如本领域中通常所知的，其性质和结构不受特别限制。接头可以是例如肽或非肽接头，例如非肽聚合物(如非生物聚合物)。优选地，任何连接均可以是水解稳定连接，即，在
有用的ph值下(尤其包括在生理条件下)在水中是基本稳定的，持续延长时间(如天)。
[0110]
在某些实施方案中，非肽接头可包含非肽聚合物，或基本由或由非肽聚合物组成。术语“非肽聚合物”泛指生物相容性聚合物，包括通过共价键(不包括肽键)彼此连接的两个或更多个重复单元。例如，非肽聚合物可以是2至200个单元长，或2至100个单元长，或2至50个单元长，或2至45个单元长，或2至40个单元长，或2至35个单元长，或2至30个单元长，或5至25个单元长，或5至20个单元长，或5至15个单元长。非肽聚合物可选自由以下各项所构成的组：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylated polyol)、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物(如pla(聚乳酸)和plga(聚乳酸
‑
乙醇酸))、脂质聚合物、甲壳素、透明质酸及其组合。特别优选的是聚乙二醇(peg)。非肽聚合物的分子量优选可以在1至100kda的范围内，并且优选在1至20kda的范围内。非肽聚合物可以是一种聚合物或不同类型聚合物的组合。非肽聚合物具有能够与由此连接的实体结合的反应性基团。优选地，非肽聚合物在每端均具有反应性基团。优选地，该反应性基团选自由反应性醛基、丙醛基(propione aldehyde group)、丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物所构成的组。该琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺丙酸酯、羟基琥珀酰亚胺、琥珀酰亚胺羧甲基或琥珀酰亚胺基碳酸酯。
[0111]
如本文所教导的，包含呼肠孤病毒科病毒(如溶瘤呼肠孤病毒科病毒)以及唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子的组合物或成套试剂盒可用于疗法中，特别是用于赘生性疾病的治疗。因此，如本文所教导的，一方面提供了包含呼肠孤病毒科病毒(如溶瘤呼肠孤病毒科病毒)以及唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子的组合物或成套试剂盒，其用于疗法中。
[0112]
如本文所教导的，另一方面提供了包含呼肠孤病毒科病毒(如尤其是溶瘤呼肠孤病毒科病毒)以及唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子的组合物或成套试剂盒，其用于治疗赘生性疾病的方法中。相关方面提供了一种治疗受试者赘生性疾病的方法，该方法包括使该受试者施用治疗或预防有效量的呼肠孤病毒科病毒(如特别是溶瘤呼肠孤病毒科病毒)以及唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子。在某些实施方案中，该赘生性疾病的特征可以是ras
‑
map信号传导途径失调，例如存在组成性ras
‑
map信号传导。如本说明书中所述，本发明人证实，唾液酸(sa)与呼肠孤病毒sigma 1(σ1)蛋白结合，可以触发σ1与jam
‑
a细胞表面受体的结合电位，这是病毒进入细胞的关键步骤。jam
‑
a可在许多细胞类型中相对广泛地表达，因此也将由各种组织起源的赘生性细胞(如肿瘤或癌细胞)表达。本领域技术人员应立即理解，其中至少一些赘生性细胞表达jam
‑
a蛋白的赘生性疾病是特别预期的，因为这些将在至少一定程度上特别受益于本文所述的效果和机制。
[0113]
所提及的“疗法”或“治疗”广义上包括治愈性和预防性治疗，并且该术语可特别是指缓解或可测量地减轻一个或多个症状或病理状况(如疾病或病症)的可测量标记。该术语包括主要治疗，以及新辅助治疗、辅助治疗和辅助疗法。术语“治疗赘生性疾病”或“抗癌疗法”或“抗癌治疗”泛指缓解或可测量地减轻赘生性疾病的一个或多个症状或可测量标记。可测量的减轻包括可测量标记或症状的任何统计上的显著减少。通常而言，这些术语包括治愈性治疗和旨在减轻症状和/或减缓疾病进展的治疗。这些术语既包括对已经进展的病理状况的治疗，也包括预防性措施，其中目的是防止或减少病理状况发生的机会。在某些实施方案中，该术语可涉及治疗性治疗。在某些实施方案中，该术语可涉及预防性治疗。在缓
解期内对慢性病理状况的治疗也可被视为构成治疗性治疗。在本发明的上下文中，该术语可包括适当的体外或体内治疗。例如，包括使用本发明的组合物或成套试剂盒进行体外治疗，以从受试者体内获得和/或引入或移植入受试者体内的细胞成分中去除赘生性细胞。
[0114]
术语“受试者”、“个体”或“患者”在本说明书中可互换使用，并且通常且优选表示人类，但也可包括对非人动物，优选温血动物，甚至更优选哺乳动物(如非人类灵长类动物、啮齿类动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物等)的引用。术语“非人类动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物，如非人类灵长类动物(特别是高级灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔子、牛、水牛、鹿、马、骡子和驴；以及非哺乳动物，如鸟类、鸡(包括鸡、鹌鹑、火鸡、鹧鸪，雉、鸭、鹅或天鹅)；两栖动物；爬行动物等。在某些实施方案中，该受试者是非人类哺乳动物。在某些实施方案中，该受试者是人。在某些优选实施方案中，该受试者是鸡。在其他实施方案中，该受试者是作为疾病模型的实验动物或动物替代物。该术语并不表示特定的年龄或性别。因此，成人和新生儿受试者以及胎儿，无论是男性还是女性，都将包括在内。术语“受试者”还意在包括转基因非人类物种。
[0115]
术语“治疗有效量”通常表示足以引起医生、临床医生、外科医生、兽医或研究人员等执业医师正在寻求的受试者药理作用或药物反应的量，除其他外，这可包括以单剂量或多剂量缓解所治疗疾病的症状。术语“预防有效量”通常表示执业医生正在寻求的受试者中以单剂量或多剂量足以引起预防效果(如抑制或延迟疾病的发生)的量。本发明组合物或成套试剂盒组分的适当预防或治疗有效剂量可由合格医生根据疾病的性质和严重程度以及患者的年龄和状况来确定。本文所述的待施用的组合物或成套试剂盒组分的有效量可取决于许多不同的因素，并且可以由本领域普通技术人员通过常规实验来确定。可考虑的一些非限制性因素包括活性成分的生物活性、活性成分的性质、待治疗受试者的特征等。术语“施用”通常是指分散或应用，并且通常包括对组织的体内施用和体外施用，优选活体内施用。通常而言，组合物可全身性或局部性施用。
[0116]
术语“赘生性疾病”通常是指以肿瘤细胞生长和增殖为特征的任何疾病或病症，无论是良性(未进入周围正常组织，未形成转移)、恶性前(癌变前)或恶性(进入邻近组织，并能产生转移)。术语“赘生性疾病”通常包括所有的转化细胞和组织，以及所有的癌细胞和组织。赘生性疾病或病症包括但不限于细胞异常生长、良性肿瘤、恶化前或癌变前病变、恶性肿瘤以及癌症。赘生性疾病或病症的实例是位于任何组织或器官(如前列腺、结肠、腹部、骨头、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、脑垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头和颈、神经(中枢神经和外周神经)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸腔或泌尿生殖道)的良性、恶化前或恶性赘生物。
[0117]
如本文所使用的，术语“肿瘤”或“肿瘤组织”是指由于细胞过度分裂而导致的异常组织块。肿瘤或肿瘤组织包括肿瘤细胞，这些肿瘤细胞是具有异常生长特性且无有用身体功能的赘生性细胞。肿瘤、肿瘤组织和肿瘤细胞可以是良性的、恶性前的或恶性的，或者可以表示没有任何癌变潜能的病变。肿瘤或肿瘤组织还可包括肿瘤相关的非肿瘤细胞，如形成供应肿瘤或肿瘤组织的血管的血管细胞。非肿瘤细胞可被肿瘤细胞诱导复制和发育，例如，在肿瘤或肿瘤组织中诱导血管生成。
[0118]
如本文所使用的，术语“癌症”是指以细胞生长失调或不受调控为特征的恶性赘生
物。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(如其细胞不会迁移至受试者体内除原始恶性肿瘤或肿瘤部位外的那些)和继发性恶性细胞或肿瘤(如由转移引起的，恶性细胞或肿瘤细胞迁移至不同于原始肿瘤部位的继发部位的那些)。术语“转移性”或“转移”通常是指癌症从一个器官或组织扩散到另一个非相邻器官或组织。赘生性疾病在其他非相邻器官或组织中的发生称为转移。
[0119]
癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体实例包括但不限于：鳞状细胞癌(如鳞状上皮细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌和肺大细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠道癌)、胰腺癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞癌、肛管癌、阴茎癌以及cns癌、黑色素瘤、头颈癌、骨癌、骨髓癌、十二指肠癌、食道癌、甲状腺癌或血液癌。
[0120]
癌症或恶性肿瘤的其他非限制性实例包括但不限于：儿童急性淋巴母细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、aids相关淋巴瘤、aids相关恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和尿道癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、子宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性淋巴母细胞白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干胶质瘤、胶质母细胞瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤、儿童霍奇金病、儿童霍奇金淋巴瘤、儿童下丘脑和视觉通路胶质瘤(childhood hypothalamic and visual pathway glioma)、儿童淋巴母细胞白血病、儿童髓母细胞瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、皮肤t细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌(endocrine pancreas islet cell carcinoma)、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤文氏肉瘤及相关肿瘤、胰腺外分泌肿瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金病、霍奇金淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、胰腺胰岛细胞癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇癌和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴组织增殖性疾病、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、转移性隐匿性原发性鳞状颈癌(metastatic occult primary squamous neck cancer)、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性疾病、鼻腔癌和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、孕期非霍奇金淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、转移性隐匿性原发性鳞状颈癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、低度恶性潜能卵巢肿瘤、胰腺癌、副蛋白血症、紫斑症、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞瘤/多发
性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和尿道癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节病肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、t细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、肾盂和输尿管移行癌(transitional renal pelvis and urethra cancer)、滋养细胞肿瘤、尿道和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、华氏巨球蛋白血症或威耳姆氏肿瘤。
[0121]
在某些实施方案中，该肿瘤是实体瘤。实体瘤包括形成通常不含囊肿或液体区域的赘生性肿块的任何肿瘤。实体瘤可以是良性的、恶性前的或恶性的。实体瘤的实例为癌、肉瘤、黑色素瘤和淋巴瘤。在某些实施方案中，该赘生性疾病可以是血液恶性肿瘤。在某些实施方案中，该赘生性疾病可以是白血病。在某些优选实施方案中，该赘生性疾病是恶性胶质瘤。
[0122]
在某些实施方案中，本发明组合物或成套试剂盒可与一种或多种其他抗癌疗法组合使用(组合疗法)。抗癌疗法的非限制性实例包括手术、放疗、化疗、生物疗法及其组合。在抗癌疗法涉及使用化学或生物分子或试剂的情况下，本发明组合物或成套试剂盒(例如，特别是呼肠孤病毒科病毒为溶瘤性的组合物或成套试剂盒)还可包含所述一种或多种化学或生物分子或试剂。
[0123]
在本说明书中使用的术语“手术”泛指包括从受试者体内手术切除赘生性组织或细胞的治疗。癌症手术可切除整个肿瘤，减小肿瘤，或切除引起疼痛或压迫的肿瘤或其部分。癌症手术尤其包括常规开放式手术、腹腔镜手术、冷冻手术、激光手术、诸如高温激光消融或射频消融的热消融手术、光动力疗法及其组合。
[0124]
本说明书中使用的术语“放疗”泛指包括将赘生性组织暴露于电离辐射(如来自x射线、伽马射线、中子、质子或其他放射源的辐射)的治疗。放射源可以是外部装置(外照射放疗)，或者放射性物质可放置在体内赘生性组织附近(内照射放疗或近距离放疗)，或者放射性物质可以通过注射、输注或食用的方式进行全身输送(全身性放射性同位素疗法)，并可以自发地或通过靶向部分(如癌症靶向抗体)集中在赘生性组织中。
[0125]
本文所使用的术语“化疗”应广义上理解，通常包括使用化学物质或组合物进行的治疗。化疗剂通常可表现出细胞毒性或细胞抑制作用。
[0126]
在某些实施方案中，化疗剂可以是烷化剂、细胞毒性化合物、抗代谢物、植物碱、萜类化合物、拓朴异构酶抑制剂或其组合。
[0127]
术语“烷化剂”通常是指在生理条件下能够烷基化亲核官能团的试剂。烷化剂的实例包括但不限于环磷酰胺、卡莫司汀、顺铂、卡铂、奥沙利铂、氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥(盐酸盐)、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、洛莫司汀、丝裂霉素c、塞替派(thiotepa)、白消安及其组合。
[0128]
术语“细胞毒性化合物”通常是指对细胞具有毒性的试剂。细胞毒性化合物的实例包括但不限于放线菌素(actinomycin、dactinomycin)；蒽环类药物，如多柔比星、柔红霉素、戊柔比星、伊达比星和表柔比星；博莱霉素；普卡霉素；米托蒽醌；丝裂霉素；及其组合。
[0129]
术语“抗代谢物”通常是指能够抑制代谢物(如嘌呤或嘧啶)的使用的试剂。抗代谢物在细胞周期的s期阻止嘌呤和嘧啶进入dna，从而阻止正常发育和分裂。抗代谢物的实例包括但不限于硫唑嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、5
‑
氟尿嘧啶、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、奈拉滨、培
美曲塞及其组合。
[0130]
植物生物碱和萜类化合物来源于植物，通过阻止微管功能来抑制细胞分裂。非限制性实例包括长春花生物碱和紫杉烷及其组合。长春花生物碱的实例包括但不限于长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛及其组合。紫杉烷的实例包括但不限于紫杉醇、多西紫杉醇及其组合。
[0131]
术语“拓朴异构酶抑制剂”通常是指维持dna拓扑结构的酶。非限制性实例包括ⅰ型和ⅱ型拓扑异构酶抑制剂。i型拓扑异构酶抑制剂的实例包括但不限于喜树碱，如伊立替康、拓扑替康及其组合。ii型拓扑异构酶抑制剂的实例包括但不限于安吖啶、多柔比星、柔红霉素、依托泊苷、磷酸依托泊苷、米托蒽醌、替尼泊苷及其组合。
[0132]
在某些实施方案中，化疗剂可选自由以下各项所构成的组：环磷酰胺、多柔比星、伊达比星、米托蒽醌、奥沙利铂、硼替佐米、地高辛、洋地黄毒苷、金丝桃素、紫草素、汉黄芩素、索拉非尼、依维莫司、伊马替尼、格尔德霉素、帕比司他、卡莫司汀、顺铂、卡铂、氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥(盐酸盐)、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、白消安、放线菌素、柔红霉素、戊柔比星、表柔比星、博莱霉素、普卡霉素、米托蒽醌、丝裂霉素、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、奈拉滨、培美曲塞、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛、紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、拓扑替康、安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、阿那曲唑、依西美坦、博舒替尼、伊立替康、凡德他尼、比卡鲁胺、洛莫司汀、克罗拉滨、卡博替尼、阿糖胞苷、环磷酰胺(cytoxan)、地西他滨、地塞米松、羟基脲、达卡巴嗪、亮丙瑞林、表柔比星、天门冬酰胺酶、雌莫司汀、维莫德吉、氨磷汀、氟他胺、托瑞米芬、氟维司群、来曲唑、地加瑞克、氟达拉滨、普拉曲沙、氟尿苷、吉西他滨、卡莫司汀晶片、艾立布林、六甲蜜胺、拓扑替康、阿昔替尼、吉非替尼、罗米地辛、伊沙匹隆、鲁索替尼、卡巴他赛、来那度胺、苯丁酸氮芥、沙格司亭、克拉屈滨、亮丙瑞林、米托坦、甲基苄肼、甲地孕酮、美司钠、氯化锶
‑
89、丝裂霉素、非格司亭、聚乙二醇非格司亭、索拉非尼、尼鲁米特、喷司他丁、他莫昔芬、培门冬酶、地尼白介素、阿利维a酸、卡铂、泼尼松、巯基嘌呤、唑来膦酸、来那度胺、奥曲肽、达沙替尼、瑞戈非尼、组氨瑞林、舒尼替尼、高三尖杉酯碱(omacetaxine)、硫代鸟嘌呤、埃罗替尼、贝沙罗汀、达卡巴嗪、替莫唑胺、塞替派、沙利度胺、bcg、坦罗莫司、盐酸苯达莫司汀、曲普瑞林、三氧化二砷(砒霜)、拉帕替尼、戊柔比星(膀胱内)、维甲酸、阿扎胞苷、帕唑帕尼、替尼泊苷、甲酰四氢叶酸、克唑替尼、卡培他滨、恩杂鲁胺、阿柏西普(ziv
‑
aflibercept)、链脲霉素、威罗菲尼、戈舍瑞林、伏立诺他、唑来膦酸、阿比特龙及其组合。
[0133]
本文所使用的术语“生物疗法”应广义上理解，并且通常包括使用生物物质或组合物(如生物分子)或生物试剂(如病毒或细胞)进行的治疗。在某些实施方案中，该生物物质或组合物可发挥治疗益处的药理作用或效果。在某些其他实施方案中，该生物物质或组合物可用于向赘生性组织或细胞递送或靶向化疗剂或放射性同位素，例如，该生物物质或组合物可与化疗剂或放射性同位素共轭(例如而非限制，靶向癌症的单克隆抗体和细胞毒性化学化合物的共轭联物)。
[0134]
在某些实施方案中，生物分子可以是肽、多肽、蛋白、核酸或小分子(如初级代谢物、次级代谢物或天然产物)或其组合。合适的生物分子的实例包括但不限于白介素、细胞因子、抗细胞因子、肿瘤坏死因子(tnf)、细胞因子受体、疫苗、干扰素、酶、治疗性抗体、抗体片段、类抗体蛋白支架或其组合。
[0135]
合适的生物分子的实例包括但不限于aldesleukine、阿仑单抗、阿特珠单抗、贝伐珠单抗、博纳吐单抗、本妥昔单抗、卡妥索单抗、西妥昔单抗、达雷妥尤单抗、地尼白介素、德尼单抗、地努图希单抗、埃罗妥珠单抗、吉妥珠单抗、钇
‑
90替伊莫单抗、伊达鲁珠单抗、干扰素a、伊匹单抗、耐昔妥珠单抗、纳武单抗、阿托珠单抗、奥法木单抗、奥拉单抗、帕尼单抗、帕博利珠单抗、雷莫芦单抗、利妥昔单抗、他索纳明(tasonermin)、131i
‑
托西莫单抗、曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗、fam
‑
trastuzumab deruxtecan
‑
nxki(曲妥珠单抗重组冻干粉注射剂)及其组合。
[0136]
合适的溶瘤病毒的实例包括但不限于talimogene laherparepvec(溶瘤单纯疱疹病毒)。
[0137]
抗癌疗法的进一步分类尤其包括激素疗法(内分泌疗法)、免疫疗法和干细胞疗法，这些疗法通常被认为属于生物疗法。
[0138]
激素疗法或内分泌疗法包括施用激素或抗激素药物来治疗激素依赖性或激素敏感性癌症(特别是例如，激素依赖性或激素敏感性乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌、子宫内膜癌或肾癌)的治疗。
[0139]
合适的激素疗法的实例包括但不限于：他莫昔芬；芳香酶抑制剂，如阿那曲唑、依西美坦、来曲唑及其组合；促黄体生成素阻断剂，如戈舍瑞林、亮丙瑞林(leuprorelin)、曲普瑞林及其组合；抗雄激素，如比卡鲁胺、醋酸环丙孕酮、氟他胺及其组合；促性腺激素释放激素阻断剂，如地加瑞克；孕酮治疗，如醋酸甲羟孕酮、甲地孕酮及其组合；及其组合。
[0140]
术语“免疫疗法”广义上包括调节受试者免疫系统的任何治疗。具体而言，该术语包括调节免疫应答(如体液免疫应答、细胞介导免疫应答或二者)的任何治疗。免疫应答通常可涉及免疫系统的细胞(如b细胞、细胞毒性t细胞(ctl)、辅助性t(th)细胞、调节性t(treg)细胞、抗原呈递细胞(apc)、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、自然杀伤(nk)细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或中性粒细胞)对刺激的应答。在抗癌治疗的上下文中，免疫疗法可优选地引发、诱导或增强免疫应答，例如特别是针对肿瘤组织或细胞的免疫应答，例如以实现肿瘤细胞死亡。免疫疗法可调节(例如，提高或增强)任何免疫系统成分(如任何免疫细胞，例如但不限于t细胞(如ctl或th细胞)、树突状细胞和/或nk细胞)的丰度、功能和/或活性。
[0141]
免疫疗法包括基于细胞的免疫疗法，其中免疫细胞(如t细胞和/或树突状细胞)被移植到患者体内。该术语还包括施用调节受试者免疫系统的物质或组合物，例如化学化合物和/或生物分子(如抗体、抗原、白介素、细胞因子或其组合)。
[0142]
癌症免疫疗法的实例包括但不限于使用单克隆抗体(如针对肿瘤细胞表达的蛋白的fc
‑
改造单克隆抗体)进行的治疗、免疫检查点抑制剂、预防性或治疗性癌症疫苗、过继性细胞疗法及其组合。
[0143]
免疫检查点是一种抑制性途径，可以减缓或停止免疫应答，并防止免疫细胞活动失控造成过度组织损伤。抑制免疫检查点靶点可以刺激免疫细胞(如ctl)对肿瘤细胞的免疫应答。
[0144]
用于抑制的免疫检查点靶点的实例包括但不限于：pd
‑
1(pd
‑
1抑制剂的实例包括但不限于帕博利珠单抗、纳武单抗及其组合)、ctla
‑
4(ctla
‑
4抑制剂的实例包括但不限于伊匹单抗、替西木单抗及其组合)、pd
‑
l1(pd
‑
l1抑制剂的实例包括但不限于阿特珠单抗)、
lag3、b7
‑
h3(cd276)、b7
‑
h4、tim
‑
3、btla、a2ar、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)、ido及其组合。
[0145]
在某些实施方案中，该呼肠孤病毒科病毒为减毒活病毒。术语“减毒”在疫苗接种领域是众所周知的，并且当与病毒结合使用时，表示在预期接受者(如人或非人类动物)中表现出比野生型病毒低得多的毒力，而刺激免疫应答的能力保持与野生型病毒相似的病毒变体或突变体，优选为在宿主(即，体内)表现出繁殖减少(例如，由于与野生型病毒相比生长速度减缓，和/或复制水平降低)的病毒变体或突变体。减毒病毒在宿主(即，体内)的繁殖可比野生型病毒少至少约10倍，例如至少约25倍，或至少约50倍，或至少约75倍，优选至少约100倍。通常，这种减毒病毒不会引起病毒感染症状，或者在感染受试者(优选，通过接种疫苗)时仅诱发轻微症状，但是病毒感染的严重症状通常不会发生在受感染者(优选，接种疫苗的受试者)体内。本说明书其他地方已描述了用于测量病毒繁殖或毒力的合适方法。衰减病毒的标准方法通常是已知的，并且可包括病毒通过外源宿主(如外源宿主的体外培养细胞、胚胎卵或活的非人类动物)的传代，或者野生型病毒的随机或定点诱变。
[0146]
如本文所教导的，包含呼肠孤病毒科病毒(如减毒活呼肠孤病毒科病毒)以及唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子的组合物或成套试剂盒可用于疗法中，并且尤其可用于针对呼肠孤病毒科病毒的免疫接种的方法中。因此，一方面提供了包含本文所教导的呼肠孤病毒科病毒(如减毒活呼肠孤病毒科病毒)以及唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子的组合物或成套试剂盒，其用于疗法中。
[0147]
另一方面提供了包含本文所教导的呼肠孤病毒科病毒(如特别是减毒活呼肠孤病毒科病毒)以及唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子的组合物或成套试剂盒，其用于针对呼肠孤病毒科病毒的免疫接种的方法中。相关方面提供了一种在受试者体内针对呼肠孤病毒科病毒进行免疫接种的方法，该方法包括使该受试者施用治疗或预防有效量的本文所教导的呼肠孤病毒科病毒(如特别是减毒活呼肠孤病毒科病毒)以及唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子。
[0148]
因此，这些方面和实施方案提供了作为针对呼肠孤病毒科病毒的疫苗的组合物和成套试剂盒。术语“疫苗”通常是指用于体内施用至受试者的治疗性或预防性药物组合物，其包含诱导接种受试者提高免疫应答(优选保护性免疫应答)的组分。
[0149]
任选地，该疫苗还可包含用于提高免疫应答的一种或多种佐剂。合适的佐剂包括例如但不限于皂苷、诸如氢氧化铝的矿物凝胶、诸如溶血卵磷脂的表面活性物质、复合多元醇、聚阴离子、肽、油或碳氢化合物乳剂、钥孔血蓝蛋白(klh)、单磷酰脂质a(mpl)、短小棒状杆菌、包含非甲基化cpg基序的寡核苷酸，以及qs
‑
21。一个实例是弗氏佐剂(freund’s adjuvant)。
[0150]
任选地，该疫苗还可包含一种或多种免疫刺激分子。此类分子的非限制性实例包括各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子。例如具有免疫刺激性、免疫增强性及促炎活性的分子的非限制性实例如白介素(如il
‑
1、il
‑
2、il
‑
3、il
‑
4、il
‑
12、il
‑
13)；生长因子(如粒细胞
‑
巨噬细胞(gm)集落刺激因子(csf))；以及其他免疫刺激分子(如巨噬细胞炎症因子、flt3配体、b7.1、b7.2等)。
[0151]
针对呼肠孤病毒感染的说明性疫苗可商购得到，并且构成可用于实施本发明的实施方案，例如来自msd animal health用于鸡的reo 1133，或轮状病毒疫苗
rotarix(glaxosmithkline)或(merck vaccines)。
[0152]
本文所述的组合物和成套试剂盒可配制为具有药学上可接受的赋形剂(即，一种或多种药学上可接受的载体物质和/或添加剂，例如缓冲液、载体、赋形剂、稳定剂等)的药物组合物或成套试剂盒。本文所述的术语“药学上可接受的”与本领域一致，并且是指与药物组合物的其他成分相容并且对其接受者无害。因此，一方面提供了一种药物组合物，其包含本文所教导的呼肠孤病毒科病毒，以及唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子。另一方面提供了一种药物成套试剂盒，其包含本文所教导的呼肠孤病毒科病毒，以及唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子。在某些实施方案中，该药物组合物或成套试剂盒可以是本说明书其他部分所述的疫苗。
[0153]
术语“药物组合物”和“药物制剂”可互换使用。本文所教导的药物制剂或成套试剂盒除本文特别指出的组分外，还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。合适的药用赋形剂取决于活性成分的剂型和特性，并且可由技术人员选择(例如，参考the handbook of pharmaceutical excipients 7th edition 2012,eds.rowe et al.)。如本文所使用的，“载体”或“赋形剂”包括任何及所有的溶剂、稀释剂、缓冲剂(如中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、增溶剂、胶体、分散介质、载体、填料、螯合剂(如edta或谷胱甘肽)、氨基酸(如甘氨酸)、蛋白、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、增香剂、增稠剂、实现贮存效果的试剂、涂料、抗真菌剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、张力控制剂(tonicity controlling agent)、吸收延迟剂等。可接受的稀释剂、载体和赋形剂通常不会对接受者的体内平衡(如电解质平衡)产生不利影响。将这种介质和试剂用于药物活性物质是本领域公知的。这些材料应该是无毒的，且不应干扰活性药物成分的活性。可接受的载体可包括生物相容、惰性或生物可吸收的盐、缓冲剂、寡糖或多糖、聚合物、粘度改善剂、防腐剂等。一种示例性载体是生理盐水(0.15m nacl，ph 7.0至7.4)。另一种示例性载体为50mm磷酸钠、100mm氯化钠。
[0154]
载体或其他材料的精确性质取决于施用途径。例如，药物组合物可以是可肠胃外接受的水溶液，其不含热原并且具有合适的ph值、等渗性和稳定性。
[0155]
该药物制剂可包含近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如ph调节剂和缓冲剂、防腐剂、络合剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、磷酸钠、氢氧化钠、氯化氢、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯、edta、油酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。优选地，该药物制剂的ph值在生理ph范围内，例如，特别是制剂的ph值在约5与约9.5之间，更优选在约6与约8.5之间，甚至更优选在约7与约7.5之间。此类药物制剂的制备在本领域技术人员的普通技术范围内。
[0156]
该药物组合物的施用可以是全身性的或局部的。药物组合物可配制为适合于肠胃外和/或非肠胃外施用。具体的施用方式包括皮下、静脉内、肌肉内、腹腔内、经皮、鞘内、口服、直肠、颊部、局部、鼻腔、经眼、关节内、动脉内、蛛网膜下腔、支气管内、淋巴、阴道内、以及子宫内施用。
[0157]
在某些优选实施方案中，该施用可以是静脉内(iv)施用，如iv输注或iv注射。
[0158]
在某些优选实施方案中，该施用可以是皮下施用，如皮下注射。
[0159]
在某些优选实施方案中，该施用可以是腹腔内(ip)施用，如ip注射。
[0160]
施用可以通过周期性注射一剂药物组合物来进行，或者可以通过从外部(如iv注
射袋)或内部(如生物可蚀性植入物、生物人工器官或植入宿主细胞集落)的贮存器静脉内、皮下或腹腔内施用来不间断或连续地进行。药物组合物的施用与可使用合适的递送方式来实现，例如：泵、微胶囊、连续释放聚合物植入物、大胶囊、皮下注射、静脉内注射、动脉内注射、肌肉内注射到其它合适部位，或以胶囊、液体、片剂、丸剂或缓释制剂的形式口服施用。
[0161]
肠胃外递送系统的实例包括乙烯
‑
醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统、泵递送、包囊细胞递送、脂质体递送、针递送注射、无针注射、雾化器、气雾器、电穿孔和透皮贴剂。
[0162]
适合于肠胃外施用的制剂适当地包含活性药物成分的无菌水性制剂，其优选与接受者的血液等渗(如生理盐水溶液)。制剂可以以单位剂量或多剂量形式呈现。
[0163]
适合于口服施用的制剂可呈现为离散单元，例如，胶囊、扁囊剂(cachets)、片剂或锭剂(各自均含有预定量的活性药物成分)，或水性液体或非水性液体中的悬浮液(如糖浆、酏剂、乳剂或药水(draught)。
[0164]
适合于局部施用的制剂可呈现为例如乳膏、喷雾、泡沫、凝胶、软膏、油膏或干搓(dry rub)。干搓可以在施用部位补充水分。此类制剂也可直接注入绷带、纱布或贴片中(如浸泡并干燥)，可局部施用。此类制剂也可在用于局部施用的绷带、纱布或贴片中保持半液体、凝胶或全液体状态。
[0165]
在某些实施方案中，活性药物成分可以是冻干的。本文所述的任何药物组合物可与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。在一些实施方案中，该组合物包装为一次性小瓶，如一次性注射器。
[0166]
在某些实施方案中，该组合物或该成套试剂盒的任何组分均可为冷冻保存或冻干的。
[0167]
本领域技术人员应当认识到，上述描述是说明性的而不是详尽的。实际上，许多其他制剂技术和药学上可接受的赋形剂和载体溶液对于本领域技术人员是熟知的，用于在各种治疗方案中使用本文所述特定组合物的合适剂量和治疗方案的开发也是如此。
[0168]
术语“唾液酸”在本领域中是众所周知的，并且通过进一步的指导构成神经氨酸(neu)的n
‑
和/或o
‑
取代衍生物的通用术语。neu是一种九碳单糖((4s,5r,6r,7s,8r)
‑5‑
氨基
‑
4,6,7,8,9
‑
五羟基
‑2‑
氧代壬酸)，由下式表示：
[0169][0170]
在某些实施方案中，该唾液酸为n
‑
取代神经氨酸，或者该至少一个唾液酸部分为n
‑
取代神经氨酸部分。在某些实施方案中，该唾液酸为o
‑
取代神经氨酸，或者该至少一个唾液酸部分为o
‑
取代神经氨酸部分。在某些实施方案中，该唾液酸为n
‑
取代和o
‑
取代神经氨酸，或者该至少一个唾液酸部分为n
‑
取代和o
‑
取代神经氨酸部分。在某些实施方案中，该唾液酸为o
‑
取代神经氨酸或n
‑
和o
‑
取代神经氨酸，或者该至少一个唾液酸部分为o
‑
取代神经氨酸部分或n
‑
和o
‑
取代神经氨酸部分，其中神经氨酸或神经氨酸部分的两个或更多个羟基
基团被取代，例如两个、三个、四个或五个羟基基团。特别地，羟基基团存在于c2、c4、c7、c8和c9处。
[0171]
取代基的性质可不同。通常，neu的c5处的氨基可被乙酰基或羟乙酰基基团取代，但已经对其他取代基进行了描述，如羟基、亚氨乙酰基、乙酰基
‑
o
‑
羟乙酰基、甲基
‑
o
‑
羟乙酰基或n
‑
羟乙酰神经氨酸
‑2‑
o
‑5‑
羟乙酰基。
[0172]
在某些优选实施方案中，神经氨酸或神经氨酸部分被乙酰基基团或羟乙酰基基团n
‑
取代，优选由乙酰基基团取代，或者换句话说，唾液酸或至少一个唾液酸部分在c5处包含n
‑
乙酰基或n
‑
羟乙酰基基团，优选n
‑
乙酰基基团。
[0173]
因此，在某些实施方案中，该唾液酸为n
‑
乙酰神经氨酸(neu5ac)或n
‑
羟乙酰神经氨酸(neu5gc)。在优选实施方案中，该唾液酸为neu5ac。在甚至更优选实施方案中，该组合物或成套试剂盒包含neu5ac。在某些实施方案中，该至少一个唾液酸部分为neu5ac部分或neu5gc部分。在优选实施方案中，该至少一个唾液酸部分为neu5ac部分。在某些实施方案中，该组合物或成套试剂盒包括包含至少一个neu5ac部分的分子。
[0174]
在某些实施方案中，该神经氨酸或该神经氨酸部分是n
‑
取代的，但不是o
‑
取代的。
[0175]
在某些实施方案中，神经氨酸或n
‑
取代神经氨酸或者神经氨酸部分或n
‑
取代神经氨酸部分的一个或多个羟基基团中的氢被取代。通常唾液酸中的o
‑
连接取代基可各自独立地选自包含以下各项或由以下各项所构成的组：乙酰基、甲基、乳酰基、硫酸酯、磷酸酯、d
‑
半乳糖基(gal)、d
‑
岩藻糖基(fuc)、d
‑
葡萄糖基(glc)和唾液酸基(sia)。
[0176]
更典型地，c4处的o
‑
连接取代基(如果c4处的
‑
oh基团被取代)可选自包含以下各项或由以下各项所构成的组：乙酰基、fuc和gal；c7处的o
‑
连接取代基(如果c7处的
‑
oh基团被取代)可以是乙酰基；c8处的o
‑
连接取代基(如果c8处的
–
oh基团被取代)可选自包含以下各项或由以下各项所构成的组：乙酰基、甲基、硫酸酯、sia和glc；并和/或者c9处的o
‑
连接取代基(如果c9处的
–
oh基团被取代)可选自包含以下各项或由以下各项所构成的组：乙酰基、乳酰基、磷酸酯、硫酸酯和sia。在某些实施方案中，无水连接(c
‑
o
‑
c)可在c4和c8之间和/或在c2和c7之间形成。
[0177]
在某些实施方案中，该唾液酸为n
‑
乙酰神经氨酸(neu5ac)或n
‑
羟乙酰神经氨酸(neu5gc)，任选地其中所述neu5ac或neu5gc的一个或多个羟基基团各自均独立地被例如乙酰基、甲基、乳酰基、硫酸酯或磷酸酯取代；或者其中该至少一个唾液酸部分为neu5ac或neu5gc部分，任选地其中所述neu5ac或neu5gc部分的一个或多个羟基基团各自均独立地被例如乙酰基、甲基、乳酰基、硫酸酯或磷酸酯取代。
[0178]
该唾液酸或该至少一个唾液酸部分可以是游离酸形式(
–
cooh，或解离为
–
coo
‑
和h+)，或者可以是盐形式，特别是药学上可接受的盐，例如，可以通过用适当的有机碱和无机碱进行处理而转化为金属或胺加成盐形式。适当的碱加成盐形式包括例如，铵盐、碱金属盐和碱土金属盐(如锂盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等)、铝盐、锌盐、有机碱(如伯、仲、叔脂族胺和芳族胺，例如甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、四丁胺异构体、二甲胺、二乙胺、二乙醇胺、二丙胺、二异丙胺、二正丁胺、吡咯烷、哌啶、吗啉、三甲胺、三乙胺、三丙胺、奎宁环、吡啶、喹啉和异喹啉)形成的盐；苄星青霉素、n
‑
甲基
‑
d
‑
葡糖胺、哈胺(hydrabamine)盐，以及氨基酸(如精氨酸、赖氨酸等)形成的盐。相反，盐形式可以通过酸处理转化为游离酸形式。
[0179]
根据本发明的原则，包含至少一个唾液酸部分的分子的性质或结构不受限制，只
要该分子使得该至少一个唾液酸部分可以与呼肠孤病毒科病毒(更具体地与该病毒的外衣壳蛋白，甚至更具体地与正呼肠孤病毒属(如禽正呼肠孤病毒或哺乳动物正呼肠孤病毒)的sigma
‑
1蛋白)接触或进行相互作用。通过进一步的指导而非限制，该分子可使得该至少一个唾液酸部分至少部分或完全暴露于环境或溶剂中，且该分子的其余部分不会在空间上或以其他方式阻碍该唾液酸部分与病毒的接触或相互作用。可包含至少一个唾液酸部分的分子的说明性但非限制性实例包括寡糖、多糖、肽、多肽、蛋白、蛋白结构域、蛋白复合物、葡聚糖、聚乙二醇、小分子或其组合(如与肽、多肽或蛋白结合的寡糖或多糖)。此类分子可优选为药学上可接受的。
[0180]
该至少一个唾液酸部分可以与该分子的其余部分共价结合，并且可以更通常通过其含有羟基基团的c原子之一结合，甚至更通常通过其c2原子结合。该连接可包括该至少一个唾液酸部分与该分子的其余部分之间的c
‑
o
‑
c键。
[0181]
在某些实施方案中，该分子包括包含至少一个唾液酸部分的寡糖或者由包含至少一个唾液酸部分的寡糖组成。在某些实施方案中，该分子包括包含至少一个唾液酸部分的多糖或者由包含至少一个唾液酸部分的多糖组成。
[0182]
术语“寡糖”泛指其中2至20个单糖单元通过糖苷键连接的化合物。根据单元的数量，它们被称为双糖、三糖、四糖、五糖等。例如，寡糖可包含唾液酸部分和一个或多个其他单糖单元(如1、2、3、4、5、6、7、8或9个其他单糖单元)或者由唾液酸部分和一个或多个其他单糖单元(如1、2、3、4、5、6、7、8或9个其他单糖单元)组成。例如，寡糖可包含两个唾液酸部分或者由两个唾液酸部分组成。例如，寡糖可包含两个唾液酸部分和一个或多个其他单糖单元或者由两个唾液酸部分和一个或多个其他单糖单元组成。例如，寡糖可包含三个或更多个唾液酸部分和一个或多个其他单糖单元或者由三个或更多个唾液酸部分和一个或多个其他单糖单元组成。术语“多糖”泛指由通过糖苷键结合在一起的单糖单元(如超过20个单糖单元)组成的聚合物或大分子。寡糖或多糖可以是直链的或支链的。
[0183]
如本文所预期的可由寡糖或多糖组成的单糖单元的说明性但非限制性实例包括：d
‑
葡萄糖、d
‑
半乳糖、l
‑
半乳糖、d
‑
甘露糖、d
‑
阿洛糖、l
‑
阿卓糖、d
‑
古洛糖、l
‑
艾杜糖、d
‑
塔罗糖、d
‑
核糖、d
‑
阿拉伯糖、l
‑
阿拉伯糖、d
‑
木糖、d
‑
来苏糖、d
‑
赤藓糖、d
‑
苏糖、l
‑
甘油基
‑
d
‑
甘露庚糖、d
‑
甘油基
‑
d
‑
甘露庚糖、6
‑
脱氧
‑
l
‑
阿卓糖、6
‑
脱氧
‑
d
‑
塔罗糖、d
‑
岩藻糖、l
‑
岩藻糖、d
‑
鼠李糖、l
‑
鼠李糖、d
‑
奎诺糖、2
‑
脱氧葡萄糖、2
‑
脱氧核糖、橄榄糖(olivose)、泰威糖(tyvelose)、ascarylose、阿比可糖、泊雷糖(paratose)、洋地黄毒糖、可立糖、d
‑
葡萄糖胺、d
‑
半乳糖胺、d
‑
甘露糖胺、d
‑
阿洛糖胺、l
‑
阿卓糖胺、d
‑
古洛糖胺、l
‑
艾杜糖胺、d
‑
塔罗糖胺、n
‑
乙酰
‑
d
‑
葡糖胺、n
‑
乙酰基
‑
d
‑
半乳糖胺、n
‑
乙酰
‑
d
‑
甘露糖胺、n
‑
乙酰
‑
d
‑
阿洛糖胺、n
‑
乙酰
‑
d
‑
阿卓糖胺、n
‑
乙酰
‑
d
‑
古洛糖胺、n
‑
乙酰
‑
l
‑
艾杜糖胺、n
‑
乙酰
‑
d
‑
塔罗糖胺、n
‑
乙酰
‑
d
‑
岩藻糖胺、n
‑
乙酰
‑
l
‑
岩藻糖胺、n
‑
乙酰
‑
l
‑
鼠李糖胺、n
‑
乙酰
‑
d
‑
奎诺糖胺、d
‑
葡萄糖醛酸、d
‑
半乳糖醛酸、d
‑
甘露糖醛酸、alluronic acid、l
‑
altruronic acid、d
‑
古洛糖醛酸、l
‑
古洛糖醛酸、l
‑
艾杜糖醛酸、taluronic acid及其组合。该术语还可包括糖醇，如赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、葡萄糖醇、半乳糖醇和/或甘露糖醇。该术语还可包括酮糖，如d
‑
阿洛酮糖、d
‑
果糖、l
‑
山梨糖、d
‑
塔格糖、d
‑
木酮糖和/或d
‑
景天庚酮糖。任何此类单糖单元，尤其是其一个或多个羟基基团，均可被一个或多个其他官能团(例如但不限于乙酰基、甲基、乳酰基、硫酸酯和/或磷酸酯)取代。
[0184]
在某些实施方案中，该分子包含寡糖或多糖或者由寡糖或多糖组成，其中该至少一个唾液酸部分经由该唾液酸部分的c2碳通过糖苷键与基础(underlying)单糖单元结合。在某些优选实施方案中，该分子包含寡糖或多糖或者由寡糖或多糖组成，其中该至少一个唾液酸部分经由该唾液酸部分的c2碳通过α糖苷键与基础单糖单元结合(即，α
‑
连接唾液酸部分)。在某些实施方案中，该基础单糖单元各自均独立地为半乳糖、n
‑
乙酰半乳糖胺、n
‑
乙酰葡糖胺或唾液酸。在某些实施方案中，该唾液酸部分各自均独立地经由其c2碳通过α
‑
糖苷键与半乳糖的c3、c4或c6、n
‑
乙酰半乳糖胺的c6、n
‑
乙酰半乳糖胺的c4或c6，或唾液酸的c8或c9结合。
[0185]
在某些实施方案中，该分子包括包含至少一个唾液酸部分作为末端部分的寡糖或多糖或者由包含至少一个唾液酸部分作为末端部分的寡糖或多糖组成。因此，此类寡糖或多糖包含至少一个末端唾液酸部分，更具体地至少一个α
‑
连接末端唾液酸部分，更具体地经由该唾液酸部分的c2碳通过α
‑
糖苷键与基本单糖单元结合的至少一个末端唾液酸部分。此类寡糖或多糖可包含一个或多个(例如，在分支结构中)末端唾液酸部分，并且任选地还可包含一个或多个非末端唾液酸部分。因此，末端唾液酸部分将形成与寡糖或多糖中基础单糖单元的糖苷键(例如，经由其c2的α
‑
糖苷键)，但不会插入基础单糖单元和另一个随后的单糖单元之间。例如，末端唾液酸部分的c7、c8和c9将不参与糖苷键。
[0186]
在某些实施方案中，包含至少一个唾液酸部分的该分子是唾液酸乳糖
‑
n
‑
四糖(lsta)。在甚至更优选实施方案中，该组合物或成套试剂盒包含lsta。
[0187]
在某些实施方案中，包含至少一个唾液酸部分的该分子是α
‑
2,3
‑
唾液酸乳糖、α
‑
2,6
‑
唾液酸乳糖或α
‑
2,8
‑
二唾液酸乳糖。在某些实施方案中，该组合物或成套试剂盒包含α
‑
2,3
‑
唾液酸乳糖、α
‑
2,6
‑
唾液酸乳糖或α
‑
2,8
‑
二唾液酸乳糖。
[0188]
在某些实施方案中，该唾液酸或包含至少一个唾液酸部分的该分子可任选地经由接头与大分子结构结合，例如聚合物载体或珠或载体，如琼脂糖珠、乳胶珠、纤维素珠、磁珠、二氧化硅珠、聚丙烯酰胺珠或玻璃珠。
[0189]
唾液酸和包含(末端)唾液酸的分子(如寡糖和多糖)广泛分布于动物组织以及真菌和酵母中(例如，在糖蛋白的聚糖和神经节苷脂中)，并且可以从中分离，如本领域所知。例如，n
‑
乙酰神经氨酸可商购获得(例如，sigma
‑
aldrich cat.no.a0812)。
[0190]
在本文所述的组合物或成套试剂盒的上下文中，设想任何数量的适合于实现预期效果(例如溶瘤或免疫效果)的呼肠孤病毒科病毒。例如而非限制，单剂量呼肠孤病毒科病毒的量可在102与10
10
ccid
50
(50％细胞培养感染剂量)之间，例如103与109ccid
50
之间，例如104与108ccid
50
之间，例如105与107ccid
50
之间，例如至少约106ccid
50
。
[0191]
此外，设想任何量的适合于增强呼肠孤病毒科病毒与宿主细胞的结合和/或提高病毒感染性的唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子。例如而非限制，该病毒可与浓度范围在1μm至1m，例如10μm至100mm，例如100μm至10mm，例如约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm或约10mm的唾液酸(如neuac)接触。例如而非限制，该病毒可与浓度范围为1μm至1m，例如10μm至100mm，例如100μm至10mm，例如约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm或约10mm的包含至少一个唾液酸部分的分子(如lsta)接触。例如而非限制，该病毒可与一定浓度的包含至少一个唾液酸部分的分子接触，从而使得α
‑
连接末端唾液酸部分的浓度范围为1μm至1m，例如10μm至100mm，例如100μm
至10mm，例如约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm或约10mm。
[0192]
本申请还提供了如下陈述中所述的方面和实施方案：
[0193]
陈述1.一种组合物或成套试剂盒，其包含i)作为呼肠孤病毒科(reoviridae)家族成员的病毒，以及ii)唾液酸和/或包含至少一个唾液酸部分的分子。
[0194]
陈述2.根据陈述1所述的组合物或成套试剂盒，其中所述呼肠孤病毒科病毒对至少一种脊椎动物物种显示出宿主嗜性。
[0195]
陈述3.根据陈述1或2所述的组合物或成套试剂盒，其中所述呼肠孤病毒科病毒对至少一种哺乳动物物种显示出宿主嗜性。
[0196]
陈述4.根据陈述1至3中任一项所述的组合物或成套试剂盒，其中所述呼肠孤病毒科病毒对人显示出宿主嗜性。
[0197]
陈述5.根据陈述1至4中任一项所述的组合物或成套试剂盒，其中所述呼肠孤病毒科病毒是正呼肠孤病毒属(orthoreovirus)、环状病毒属(orbivirus)或轮状病毒属(rotavirus)。
[0198]
陈述6.根据陈述1至5中任一项所述的组合物或成套试剂盒，其中所述呼肠孤病毒科病毒包含外衣壳和内核。
[0199]
陈述7.根据陈述1至6中任一项所述的组合物或成套试剂盒，其中所述呼肠孤病毒科病毒包含能够与宿主细胞表面受体结合的外衣壳蛋白，其中所述唾液酸或包含所述至少一个唾液酸部分的所述分子使得所述外衣壳蛋白在所述呼肠孤病毒科病毒上采用比在不存在所述唾液酸或包含所述至少一个唾液酸部分的所述分子的情况下的构象更伸展或延伸的构象。
[0200]
陈述8.根据陈述7所述的组合物或成套试剂盒，其中所述外衣壳蛋白是sigma
‑
1蛋白。
[0201]
陈述9.根据陈述1至8中任一项所述的组合物或成套试剂盒，其中所述唾液酸是n
‑
取代神经氨酸，或者其中所述至少一个唾液酸部分是n
‑
取代神经氨酸部分，任选地其中所述n
‑
取代神经氨酸或所述n
‑
取代神经氨酸部分是进一步o
‑
取代的。
[0202]
陈述10.根据陈述1至9中任一项所述的组合物或成套试剂盒，其中所述唾液酸是n
‑
乙酰神经氨酸(neu5ac)或n
‑
羟乙酰神经氨酸(neu5gc)，任选地其中所述neu5ac或neu5gc的一个或多个羟基基团各自独立地被例如乙酰基、甲基、乳酰基、硫酸酯或磷酸酯取代；或者其中所述至少一个唾液酸部分是neu5ac或neu5gc部分，任选地其中所述neu5ac或neu5gc部分的一个或多个羟基基团各自独立地被例如乙酰基、甲基、乳酰基、硫酸酯或磷酸酯取代。
[0203]
陈述11.根据陈述1至10中任一项所述的组合物或成套试剂盒，其中所述唾液酸是neu5ac，或者其中所述至少一个唾液酸部分是neu5ac部分，优选地其中所述组合物或成套试剂盒包含neu5ac。
[0204]
陈述12.根据陈述1至11中任一项所述的组合物或成套试剂盒，其中所述分子包括包含所述至少一个唾液酸部分作为末端部分的寡糖或多糖或者由包含所述至少一个唾液酸部分作为末端部分的寡糖或多糖组成。
[0205]
陈述13.根据陈述1至12中任一项所述的组合物或成套试剂盒，其中所述呼肠孤病毒科病毒是溶瘤病毒。
[0206]
陈述14.根据陈述13所述的组合物或成套试剂盒，其中所述溶瘤呼肠孤病毒科病毒与能够与赘生性细胞特异性结合的结合剂(如抗体)连接，任选地其中所述唾液酸和/或包含所述至少一个唾液酸部分的所述分子也与所述结合剂连接。
[0207]
陈述15.根据陈述1至12中任一项所述的组合物或成套试剂盒，其中所述呼肠孤病毒科病毒是减毒活病毒。
[0208]
陈述16.根据陈述1至15中任一项所述的组合物或成套试剂盒，其用于疗法中。
[0209]
陈述17.根据陈述13或14所述的组合物或成套试剂盒，其用于治疗赘生性疾病的方法中。
[0210]
陈述18.根据陈述15所述的组合物或成套试剂盒，其用于针对呼肠孤病毒科病毒的免疫方法中。
[0211]
虽然已经结合本发明的具体实施方案对本发明进行了描述，但是显而易见的是，根据上述描述，许多替代方案、修改和变型对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，在所附权利要求书的精神和广泛范围中，其意在涵盖如下所有此类替代方案、修改和变型。
[0212]
以下非限制性实施例进一步支持了本文所公开的方面和实施方案。
[0213]
实施例
[0214]
实施例1—实施例2
‑
5中使用的材料和方法
[0215]
呼肠孤病毒原种的产生
[0216]
之前已经对t3sa+和t3sa
‑
呼肠孤病毒原种进行了描述(frierson et al.2012,supra)。t3sa+对应于野生型株3型dearing(t3d)，且t3sa
‑
对应于携带sigma
‑
1(σ1)蛋白中点突变的t3d衍生物，即r202w(即，t3d
‑
σ1r202w)，而位于σ1蛋白同一区域的其他点突变，更具体地n198、r202或p204处的突变也可以消除t3σ1与唾液酸的结合(参见reiter et al.crystal structure of reovirus attachment protein σ1in complex with sialylated oligosaccharides plos pathog 2011,vol.7(8),e1002166)。通过噬斑纯化，并将病毒(atcc，#ccl
‑
1)在l929细胞中传代3
‑
4次来制备t3sa+和t3sa
‑
呼肠孤病毒原种。如上所述，通过氯化铯梯度离心从感染的l929细胞裂解物制备纯化的病毒粒子(furlong et al.sigma 1protein of mammalian reoviruses extends from the surfaces of viral particles.j.virol.1988,vol.62,246
‑
256)。简单地说，通过超声裂解感染的细胞，并采用vertrel xf从裂解物中提取病毒粒子(furlong et al.,supra；mendez et al.a comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.j.virol.methods 2000,vol.90,59
–
67)。将提取的病毒粒子分层到1.2至1.4g/cm3氯化铯阶梯梯度上，并在4℃下以25000rpm离心18小时。收集呼肠孤病毒颗粒密度对应的条带(约1.36g/cm3)，并针对病毒粒子储存缓冲液(150mm nacl、15mm mgcl2和10mm tris[ph7.4])彻底透析。根据260nm处的光密度测定颗粒浓度(1od
260
＝2.1x10
12
颗粒/ml)(smith et al.polypeptide components of virions,top component and cores of reovirus type 3.virology 1969,vol.39,791
‑
810)。将病毒粒子(2
×
10
12
颗粒/ml)与2mg/ml α
‑
糜蛋白酶(sigma
‑
aldrich)在37℃下温育60分钟来产生感染性亚病毒粒子颗粒(isvp)(baer&dermody.mutations in reovirus outer
‑
capsid protein sigma3 selected during persistent infections of l cells confer resistance to protease inhibitor e64.j.virol.1997,vol.71,4921
‑
4928)。通过在冰上进行温育，并添
加苯甲基磺酰氟(sigma
–
aldrich)至浓度为2mm来淬灭反应。将在新鲜50mm碳酸氢钠中稀释的呼肠孤病毒颗粒(ph 8.5；6
×
10
12
颗粒/ml)通过与alexa flour 488(invitrogen)的20μm琥珀酰亚胺酯在室温下在黑暗中温育90分钟而进行标记以产生荧光素化的病毒粒子。通过在4℃下对pbs透析过夜而去除未反应的染料(mainou&dermody.transport to late endosomes is required for efficient reovirus infection.j.virol.2012,vol.86)。用α
‑
糜蛋白酶处理荧光素化的病毒粒子而制备荧光素化的isvp。使用l929细胞通过噬斑测定来测定病毒滴度(virgin et al.antibody protects against lethal infection with the neurally spreading reovirus type 3(dearing).j.virol.1988,vol.62,4594
‑
4604)。
[0217]
细胞系
[0218]
表达jam
‑
a的细胞系的工程化改造和表征。用编码嘌呤霉素抗性基因和人jam
‑
a或仅编码嘌呤霉素抗性基因的慢病毒转导单层cho(atcc，#ccl
‑
61)和lec2(atcc，#crl
‑
1736)细胞。通过在含有20μg ml
‑1嘌呤霉素的培养基中传代两次，来针对嘌呤霉素抗性对转导的细胞进行选择。所使用的嘌呤霉素的浓度是导致未转导的cho和lec2细胞完全死亡的最低浓度。在选择嘌呤霉素抗性后，利用荧光激活细胞分选术(facs)针对jam
‑
a的细胞表面表达对细胞进行进一步选择。使用单克隆抗体j10.4检测jam
‑
a的细胞表面表达(liu et al.human junction adhesion molecule regulates tight junction resealing in epithelia.j.cell sci.2000,vol.113,2363
‑
2374)，并且使用嘌呤霉素选择来收集和繁殖具有高jam
‑
a表达的细胞级分。在随后的实施方案中，经转导且仅针对嘌呤霉素抗性选择的细胞将称为cho和lec2，而针对嘌呤霉素抗性和jam
‑
a表达选择的细胞将分别称为cho
‑
jam
‑
a和lec2
‑
jam
‑
a。
[0219]
cho细胞系的培养。使cho细胞(cho、cho
‑
jam
‑
a)在37℃下，于具有5％co2的潮湿气氛中，在补充为含有10％胎牛血清(fbs)、青霉素(100u ml
‑1)和链霉素(100μg ml
‑1)(invitrogen)的ham’s f12培养基(sigma
‑
aldrich)中生长。在交替传代期间，向培养基中添加20μg ml
‑1嘌呤霉素。
[0220]
lec2细胞系的培养。lec2细胞(lec2、lec2
‑
jam
‑
a)在37℃下，于具有5％co2的潮湿气氛中，在补充为含有10％fbs、青霉素(100u ml
‑1)和链霉素(100μg ml
‑1)的memα核苷培养基(gibco)中生长。在交替传代期间，培养基中包括20μg ml
‑1嘌呤霉素。
[0221]
cho和lec2细胞的转导。如上所述，分别使用h2b
‑
egfp
‑
表达慢病毒和肌动蛋白
‑
mcherry
‑
表达慢病毒转导在随后的实施例中使用的四种细胞类型以表达核gfp以及细胞质mcherry(salmon&trono.production and titration of lentiviral vectors.current protocols in human genetics 2007,vol.54,12.10.11
‑
12.10.24)。通过facs选择表达gfp和mcherry两者的细胞，并利用上述培养条件进行繁殖。此外，用于单颗粒跟踪实验的仅表达mcherry的lec2
‑
jam
‑
a也如前所述进行选择和繁殖。
[0222]
转导细胞的facs。对gfp和肌动蛋白
‑
mcherry转基因转导的细胞进行胰蛋白酶消化，并将其收集到具有2mm edta和1％fbs的pbs中。使用bd facsaria iii细胞分选仪分选细胞，其中喷嘴为85μm，鞘层压力为45psi，下降频率为47khz，且分选精度为0
‑
32
‑
0。用488nm激光激发gfp，并用530/30带通滤波器和505长通镜过滤发射。用561nm(黄绿)激光激发mcherry，并用610/20带通滤波器过滤发射。收集表达gfp和mcherry两者的细胞，并使用
microscopy of live cells.pan stanford publishing,2011)。将镀金表面用乙醇冲洗，用温和的氮气流干燥，通过uv和臭氧处理清洁15分钟，并在含有0.05mm nta封端(10％)和三甘醇(eg)封端(90％)的烷硫醇的乙醇中浸泡过夜。用乙醇冲洗后，将包被有烷硫醇的样品浸入40mm niso4(ph 7.2)水溶液中1小时，用水冲洗，与带his6标签的jam
‑
a(0.1mg ml
‑1)温育2小时，并用pbs冲洗。使官能化表面保持含水，并在制备后立即使用。在重复扫描下，表面显示均匀且稳定的形态，并展示出约3nm的厚度。厚度是按照用于测量唾液酸包被模型表面所述的方式测量的。
[0229]
模型表面上基于fd的afm
[0230]
使用afm nanoscope multimode 8(bruker)(nanoscope软件v9.1)进行基于fd的afm。使用病毒官能化的msct
‑
d探针(使用热调谐计算弹簧常数，范围为0.024至0.043n m
‑1)(butt&jaschke.calculation of thermal noise in atomic
‑
force microscopy.nanotechnol.1995,vol.6,1
‑
7)在力
‑
体积(接触)模式下记录5x5μm阵列的力曲线。接近速度保持恒定在1μm s
‑1，且收回速度从0.1、0.2、1、5、10至20μm s
‑1不等，以确保在广泛的加载速率范围内探测病毒与其同源受体之间的能量图景(energy landscape)。牵拉速度(v)和加载速率(lr)可以如下相关：lr＝δf/δt＝k
eff
·
v，其中δf/δt是随时间施加的力，k
eff
是该系统的有效弹簧常数。斜坡尺寸设置为500nm，最大力设置为500pn，没有表面延迟。使用1hz的线频率扫描样品，每行扫描32个像素(总共32行，每收回速度1024个数据点[fd曲线])。所有基于fd的afm测量均在约25℃下于病毒缓冲液中获得。使用nanoscope analysis软件v1.7(bruker)对力曲线进行分析。为了确定与peg间隔物连接的颗粒与受体模型表面之间发生的粘附事件相对应的峰值，用聚合物延伸的蠕虫样链模型拟合键断裂前的收回曲线(bustamante et al.entropic elasticity of lambda
‑
phage dna.science 1994,vol.265,1599
‑
1600)。后者表示半柔性聚合物的力
‑
延伸(f
‑
x)关系，并由以下方程式描述，其中l
p
为持续长度，l
c
为轮廓长度，且k
b
t为热能：
[0231][0232]
如所述使用origin软件(originlab)在动力学力谱(dfs)图中显示结果，以拟合不同加载速率范围的断裂力分布的直方图，并应用各种力谱模型(alsteens et al.nanomechanical mapping of first binding steps of a virus to animal cells.nat nanotechnol 2017,vol.12,177
‑
183；newton et al.combining confocal and atomic force microscopy to quantify single
‑
virus binding to mammalian cell surfaces.nat.protoc.2017,vol.12,2275；delguste et al.in nanoscale imaging,483
‑
514,springer,2018(
‘
delguste et al.2018a’)；delguste et al.multivalent binding of herpesvirus to living cells is tightly regulated during infection.science advances 2018,vol.4,eaat1273(
‘
delguste et al.2018b’))。
[0233]
活细胞上的基于fd的afm和荧光显微镜
[0234]
如所述在peakforce qnm模式(nanoscope软件v9.2)下运行的afm(bioscope catalyst and bioscope resolve，bruker)上采集相关图像，以进行基于fd的afm，并将其
偶联至倒置外荧光显微镜(zeiss observer z.1)(newton et al.2017,supra；knoops et al.specific interactions measured by afm on living cells between peroxiredoxin
‑
5and tlr4:relevance for mechanisms of innate immunity.cell chemical biology 2018,vol.25,550
‑
559,e553)。使用40倍油物镜(na＝0.95)。如所述afm配备有150μm压电扫描器，和允许控制温度、湿度和co2浓度的细胞培养室(alsteens et al.2017,supra)。使用尖端长度为17μm、尖端半径为65nm、且开口角度为15
°
的pfqnm
‑
lc探针(bruker)在成像力为约500pn下记录细胞表面(20
‑
30μm2)的概览图像。所有的荧光显微镜和基于fd的afm成像实验都是在memα核甘培养基或ham’s f12培养基(取决于细胞类型)中在37℃下于细胞培养条件下使用afm和荧光显微镜室组合(图1a)进行的。使用气体加湿器膜(permselect silicone)在95％相对湿度下将合成空气与5％co2的气体混合物以0.1l min
–
1注入显微镜室中。使用湿度传感器(sensirion)控制湿度。首先用热噪声法校准悬臂(hutter&bechhoefer.calibration of atomic
‑
force microscope tips.review of scientific instruments 1993,vol.64,1868
‑
1873)，从而得到pfqnm
‑
lc探针的值范围为0.095至0.135n m
–1。afm尖端在0.25khz下以正弦方式振荡，在peakforce tapping模式下振幅为750nm。使用0.125hz的频率和每行256个像素(256行)扫描样品。使用nanoscope analysis软件(v1.7，bruker)、origin和imagej(v1.52e)对afm图像和fd曲线进行分析。利用nanoscope分析和origin软件对检测病毒与细胞表面间非结合事件的单个fd曲线进行分析。在收回曲线的最后30％上使用线性拟合来校正收回曲线的基线。利用力
‑
时间曲线，确定每个断裂事件的加载速率(斜率)(图1c)。使用zen blue软件(zeiss)对光学图像进行分析(alsteens et al.2017,newton et al.2017,delguste et al.2018a,delguste et al.2018b,all supra)。
[0235]
监测sa添加的效果
[0236]
如上所述通过扫描适当的细胞区域，然后向培养基中添加1mm的相应聚糖来进行活细胞实验。再次扫描同一区域以监测聚糖添加后的潜在变化。为评估特异性，随后添加阻断剂(1mm neu5ac或10μg/ml jam
‑
a ab[sigma，#sab4200468])。
[0237]
监测呼肠孤病毒与经神经氨酸酶处理的细胞的结合
[0238]
为了从lec2细胞中去除残余的细胞表面sa，如上所述通过扫描适当的细胞区域，然后在显微镜台上用神经氨酸酶进行处理以允许在处理后对同一区域进行第二次扫描，来进行活细胞实验。去除培养基，用2ml pbs(sigma
–
aldrich)洗涤细胞，在pbs中用最终浓度为40munit/ml的产脲节杆菌(arthrobacter ureafaciens)神经氨酸酶(sigma
–
aldrich)处理1小时，并用2ml pbs洗涤。实验采用不补充任何抑制sa恢复的添加物的细胞培养基来进行。此外，在第三次扫描期间添加1mm neu5ac，并在第四次扫描期间添加10μg/ml jam
‑
a ab，以分别监测sa介导的变化和评估所观察到的相互作用的特异性。
[0239]
定量呼肠孤病毒和凝集素结合
[0240]
在37℃下用cellstripper(cellcro)从细胞培养皿中分离cho和lec2细胞(puro和jam
‑
a细胞系)15分钟，用相应的细胞培养基进行淬灭，并用pbs洗涤一次。为了定量呼肠孤病毒结合，将细胞在4℃下，以每细胞105个荧光素化呼肠孤病毒病毒粒子或isvp吸附1小时。为确定游离sa对呼肠孤病毒结合的影响，在病毒吸附过程中，将细胞与1μm neu5ac温育。为比较细胞系间细胞表面sa的表达，在4℃下，在含5％bsa的pbs中用浓度为1μg/ml的荧
binding to sialic acid are contained in the fibrous tail domain of viral attachment protein sigma1.j.virol.1997,vol.71,1834
–
1841)。将混合的血清预先吸附在cho细胞单层上，以消耗非特异性抗体。在室温下，将每个悬臂在500μl的一抗溶液中温育1小时。用阻断缓冲液洗涤悬臂三次。通过将与别藻蓝蛋白(apc)荧光团(thermo fisher，catalog#17
‑
4210
‑
82)缀合的大鼠抗小鼠igg2a抗体以1:400稀释度添加阻断缓冲液中来制备二抗溶液。在室温下，将悬臂在500μl二抗溶液中温育1小时。最后，将悬臂用pbs洗涤三次，并在4℃下于黑暗中储存，直到进一步使用。用倒置共聚焦显微镜(zeiss lsm 880)的488nm激光线对悬臂进行成像。
[0247]
吸附在hopg基底上的呼肠孤病毒病毒粒子的afm成像
[0248]
将80μl的病毒溶液滴(约109颗粒ml
‑1)沉积在新切割的hopg(高定向热解石墨，nt
‑
mdt仪器)基底上，并在室温下温育15分钟。在pbs缓冲液中使用ac40 biolever mini afm尖端(标称弹簧常数为0.1nm
‑1，bruker)在peakforce tapping模式下进行afm成像。根据所需的分辨率和扫描尺寸，使用不同的成像参数：尖端振荡频率范围在1至2khz之间，最大峰值力为100pn，扫描速率范围在0.5至2khz之间，峰值力振幅在50至100nm之间，且分辨率为每行256或512个像素(分别为256行或512行)。
[0249]
实施例2—外衣壳蛋白sigma1(σ1)通过多价键附着于α
‑
连接唾液酸(α
‑
sa)聚糖
[0250]
由于sigma 1(σ1)与α
‑
连接唾液酸(α
‑
sa)聚糖结合是呼肠孤病毒附着至细胞表面的第一步(barton et al.2001a,supra)，所以我们使用原子力显微镜(afm)利用模型表面和活细胞两者来评估呼肠孤病毒与α
‑
sa的结合强度(图1示出了基于力
‑
距离的afm的原理；图12验证了呼肠孤病毒病毒粒子形态、尖端官能化和模型表面化学性质；并且图2和图13描述了所使用的细胞系)。为了体外模拟细胞表面聚糖，将生物素化
‑
α
‑
sa聚糖固定化在链霉抗生物素蛋白包被的表面上，以允许病毒接近α
‑
sa (lee et al.sensing discrete streptavidin
‑
biotin interactions with atomic force microscopy.langmuir 1994,vol.10,354
‑
357,dupres et al.nanoscale mapping and functional analysis of individual adhesins on living bacteria.nat.methods 2005,vol.2,515)。模型表面使用afm进行成像，并通过刮去吸附层，露出约1.0
±
0.3nm的沉积层而进行验证(图12d)。为了定量呼肠孤病毒与α
‑
sa的结合，我们将α
‑
sa结合的呼肠孤病毒株t3sa+的纯化病毒粒子(图12c，示出了尖端顶点处的单个病毒粒子)共价附着至与afm尖端化学连接的长聚乙二醇(peg)
27
间隔物的游离端(alsteens et al.2017,newton et al.2017,delguste et al.2018a,all supra)。记录力
‑
距离曲线(fd曲线)以评估t3sa+病毒粒子与α
‑
sa聚糖之间的结合强度(图3a
‑
c)。在断裂距离>5nm时，在10
‑
15％的收回fd曲线上观察到特定的粘附事件，这对应于peg接头的延伸。为了证实这些相互作用的特异性，我们使用以下各项进行了另外的独立对照实验：(i)附着至非sa结合病毒株t3sa
‑
的afm尖端，其由于σ1的α
‑
sa结合位点中的p204l突变而不与α
‑
sa接合(reiter et al.crystal structure of reovirus attachment proteinσ1in complex with sialylated oligosaccharides.plos path.2011,vol.7,e1002166)；以及(ii)与可溶性α
‑
sa分子，包括乙酰神经氨酸(neu5ac)、唾液酸
‑
乳糖
‑
n
‑
四糖(lsta)或乳糖
‑
n
‑
新四糖(lnnt)(一种缺少α
‑
sa的聚糖)的竞争实验。正如预期的那样，t3sa
‑
没有显示出与sa的显著结合，并且注射游离neu5ac和lsta(而非lnnt)与t3sa+强烈竞争与sa的结合(图3b)。这些对照证实了相互作用的特异性和σ1尾部区
域中特定残基对α
‑
sa结合的关键重要性。
[0251]
为了提取σ1
‑
α
‑
sa相互作用的动力学，我们在不同的力加载速率下对相互作用进行了力探测(merkel et al.energy landscapes of receptor
‑
ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.nature 1999,vol.397,50
‑
53)(图3c和图1c、d)。利用生理相关的力的方向施加，σ1
‑
α
‑
sa复合物承受25至400pn范围的力。力状态(force regime)通常与蛋白构象的稳定性有关，这引起了与afm尖端连接的呼肠孤病毒病毒粒子可能会随着时间的推移而受损的担忧。由于悬臂顶端的半径约为40nm，因此它们只能承载少量的病毒颗粒，这一点可以通过激光扫描光学显微镜得到证实(图12c)。如果尖端顶点的呼肠孤病毒病毒粒子被机械地改变，那么此类改变将会随着时间的推移而导致相互作用的频率迅速降低。相反，单个悬臂在数千次相互作用和数张图中保持活跃，表明尖端和表面官能化维持了高力。
[0252]
根据bell
‑
evans(be)模型，σ1
‑
α
‑
sa复合物可描述为简单的双态模型，在这种模型中，结合态与非结合态通过位于距离x
u
＝0.48
±
0.03nm且与转变率k
off
＝0.09
±
0.04s
‑
1交叉的单个能障分离。我们还观察到了二价和三价相互作用。这些多价相互作用表现为平行加载的非相关键，这是由预测williams
‑
evans(we)模型(图3c，虚线曲线ii和iii)所证实的。这些多价相互作用很可能是在附着至afm尖端的单个病毒粒子上的σ1分子与固定化于表面上的多个α
‑
sa分子之间建立的。这一假设得到以下原因的证实：(i)σ1是具有三个结合位点的三聚体；(ii)每个病毒粒子均具有σ1三聚体的多个拷贝(最多12个，对应于病毒粒子二十面体顶点)；(iii)尖端顶点只携带一个或两个病毒粒子；以及(iv)未结合发生在单个步骤中(在fd曲线中观察到的单个断裂峰)。因此，我们的体外实验证实了t3sa+病毒粒子与α
‑
sa聚糖特异性相互作用，并且病毒粒子与α
‑
sa聚糖快速(ms范围内)建立多价键。隐藏在暴露的细胞表面聚糖中，概念上讲可能越来越多的σ1
‑
α
‑
sa复合物为病毒粒子提供与细胞表面的第一稳定锚定。
[0253]
接下来，我们用表达α
‑
sa的活cho细胞(用核gfp和肌动蛋白
‑
mcherry进行荧光标记)和缺乏α
‑
sa表达(其糖蛋白和神经节苷脂中缺少约70
‑
90％的sa)的lec2细胞进行实验来证实我们的体外结果(图2a、b)。lec2细胞是从亲本cho细胞衍生的突变体克隆，其显示出胞苷
‑
5'
‑
单磷酸
‑
sa向高尔基体(golgi)的转运显著减少(deutscher et al.translocation across golgi vesicle membranes:a cho glycosylation mutant deficient in cmp
‑
sialic acid transport.cell 1984,vol.39,295
‑
299)。使用用t3sa+官能化的afm尖端，我们对使用繁殖cho细胞和lec2两种细胞的条件下共培养的cho细胞和lec2细胞的汇合单层进行了成像(alsteens et al.2017,supra)(图3d
‑
g)。在荧光的指导下，我们选择了两种细胞类型接近的区域，用作afm成像期间的直接内部对照(图3e)。afm高度图像与相应的粘附图像一起记录，显示了在粘附图上显示为亮像素的特定粘附事件的位置(图3f、g)。值得注意的是，cho细胞显示出高密度的粘附事件(约4％，图3i)，而lec2细胞仅显示出稀疏分布的粘附事件(<1％，图3i)，这证实活细胞上特异性t3sa+
‑
α
‑
sa键的建立。我们还通过使用相同的t3sa+尖端记录连续的图来评估afm尖端顶点上病毒粒子的稳定性。在连续图过程中，afm尖端上病毒的存在排除了病毒粒子在我们的afm实验期间内化的可能性(图14a
–
d)。实际上，由于接触时间短(在约ms范围内)，所观察到内化事件的可能性极低。因此，呼肠孤病毒病毒粒子在与细胞表面结合的早期阶段(280至1500秒之间)基本上是静
止的。断裂力(图3h，深灰色点)在50
‑
400pn范围内。利用we预测(根据体外数据建立)，我们推断，t3sa+病毒粒子平行建立了多达6个相互作用，最可能3至4个相互作用(图3h，虚线[ii至vi]和直方图)。这些结果表明，尽管t3sa+病毒粒子与细胞表面的接触时间较短(为约1ms)，但t3sa+病毒粒子能够形成多个平行的相互作用。σ1蛋白形成理论上可与多达三个α
‑
sa聚糖同时相互作用的同源三聚体，并且几个σ1三聚体也可以在给定时间与细胞表面sa相互作用，从而产生所观察到的多价相互作用。这些结果表明，病毒粒子在早期附着于细胞表面时使用超出单个σ1蛋白。使用三种不同的方法来验证t3sa+α
‑
sa相互作用的特异性：(i)首先用t3sa+尖端，然后用t3sa
‑
尖端探测同一cho
‑
lec2细胞混合物(图3i和图14e
‑
h)，(ii)使用1mm neu5ac阻断特异性病毒
‑
聚糖相互作用(图3i和图14i
‑
l)，以及(iii)对病毒粒子结合进行流式细胞术分析(图3j)。采用流式细胞术在更大范围内检测使用单个病毒颗粒进行的观察。将细胞与无病毒粒子(mock)或alexa flour488标记的t3sa+或t3sa
‑
病毒粒子(每细胞105颗粒)一起温育1小时，并测定与细胞结合的病毒的中位荧光强度(mfi)(图13)。如图3j中所示，t3sa+病毒粒子主要与cho细胞结合，而mock或t3sa
‑
病毒粒子几乎没有检测到结合。尽管cho细胞表面上的结合力比模型α
‑
sa表面上的结合力大得多，但上述对照显示的相互作用的特异性证实了我们正在探测细胞和模型表面两者上相同的相互作用。更大的力可能是同时建立的键的数量不同的结果。总之，这些结果证实，t3sa+病毒粒子与活细胞上的α
‑
sa聚糖建立了多种特异性相互作用。
[0254]
实施例3—σ1蛋白与jam
‑
a受体形成稳定且多价的复合物
[0255]
虽然α
‑
sa接合可以为呼肠孤病毒在细胞表面上提供第一个立足点，但接合特定受体(如jam
‑
a)促进细胞进入。为了评估呼肠孤病毒与jam
‑
a的结合，我们首先对t3sa+或t3sa
‑
病毒粒子与jam
‑
a包被的表面的结合进行力探测(图4a)。为了模拟生理条件，将带his6标签的jam
‑
a分子以生理定向方式固定化在nta
‑
ni
2+
包被的金表面上(dupres et al.2005,dufr
ê
ne 2011,all supra)(图4a)，并使用afm刮痕实验验证了表面化学(见图12e)。在20至130pn的范围内观察到了特异性结合力，并将其转换为jam
‑
a
‑
t3sa+(图4b，上图)和jam
‑
a
‑
t3sa
‑
(图4b，下图)相互作用的dfs图。jam
‑
a
‑
呼肠孤病毒相互作用可以定义为具有单个能障，对于jam
‑
a
‑
t3sa+键，x
u
＝0.71
±
0.05nm，且k
off
＝0.04
±
0.01s
‑1以及对于jam
‑
a
‑
t3sa
‑
键，x
u
＝0.48
±
0.03nm，k
off
＝0.05
±
0.03s
‑1。虽然off
‑
速率是相当的，但对于t3sa
‑
，到过渡态的距离较小，这表明能量图景由可以容纳更少构象变化的较窄能谷描述。对于t3sa
‑
与jam
‑
a的结合，我们经常观察到更大的结合力，这对应于多重相互作用。与较窄能谷一起，这一观察结果表明，t3sa
‑
σ1的单点突变导致更刚性和/或紧凑的蛋白的构象。注射jam
‑
a抗体(ab)降低了结合频率，这证实了病毒粒子
‑
jam
‑
a结合的特异性(图4c)。
[0256]
为了定义呼肠孤病毒与jam
‑
a在生理条件下的相互作用，我们评估了呼肠孤病毒与活细胞上表达的jam
‑
a的结合。使用与未标记的lec2
‑
jam
‑
a细胞共培养的荧光标记的活lec2细胞(核gfp和肌动蛋白
‑
mcherry)进行组合的光学和基于fd的afm(图4d
‑
g)。利用这两种细胞类型的t3sa+结合的映射突出显示了lec2
‑
jam
‑
a细胞上高密度的粘附事件(约3.5％，图4g、i)，结合力(断裂力)范围在50至400pn之间。lec2细胞仅显示出罕见的结合事件(<0.8％，图4g、i)，证实了细胞表面jam
‑
a和t3sa+之间的特异性相互作用(也可参见图15a
‑
d中的连续映射)。为了消除最小sa表达对lec2细胞的影响，我们还探测了t3sa
‑
与lec2
‑
jam
‑
a细胞之间的相互作用，并观察到了类似的频率(约4.0％，图4i)。此外，使用(i)
jam
‑
a抗体(ab)(图4i和图15k
‑
n)和(ii)流式细胞术(图4j)评估了相互作用的特异性。与使用体外方法收集的结果相似，sa结合位点的改变不影响呼肠孤病毒与jam
‑
a的结合(图15e
‑
h)。总之，这些结果表明，t3sa+与jam
‑
a建立了稳定的弱(低多价)相互作用，与sa接合无关。
[0257]
为了更好地定义jam
‑
a作为活细胞上特异性受体的功能，我们分析了jam
‑
a结合力，并将数据叠加到先前在模型表面上获得的dfs图上(图4h)。与在体外获得的数据相比，在使用活细胞的实验中，我们观察到建立了多达四个同时不相关的病毒受体键(we模型，虚线曲线)。类似地，提取用lec2
‑
jam
‑
a细胞上的t3sa
‑
病毒粒子测量的结合力，并将其与dfs图叠加(图15i、j)，在结合频率(图4i)和在活细胞上同时建立的不相关病毒受体键的数量(图15j)方面提供了相似的结果。这些结果表明，与jam
‑
a结合在动力学上或空间上都不如与细胞上的α
‑
sa结合(在类似的实验条件下观察到多达六个键)有利。然而，对于t3sa+和t3sa
‑
两者，大多数粘附事件都显示出与一个或两个jam
‑
a受体相互作用的断裂相对应的断裂力(图4h、图15j、直方图)，这表明与jam
‑
a结合在动力学或空间上都不如与细胞上的α
‑
sa结合(在类似的实验条件下观察到多达六个键)有利。
[0258]
实施例4—与α
‑
唾液酸化聚糖结合触发呼肠孤病毒与jam
‑
a结合
[0259]
由于α
‑
sa和jam
‑
a两者在呼肠孤病毒附着到细胞表面的过程中协同作用，所以我们首先使用模型表面(图5和图6)，然后使用细胞(图8)评估了α
‑
sa存在下呼肠孤病毒与jam
‑
a的结合。在体外探测t3sa+与jam
‑
a的结合时，我们注射了含有(neu5ac和lsta)和不含有(lnnt)末端α
‑
sa的1mm聚糖。值得注意的是，neu5ac和lsta两者的添加(图5b、c)对总结合力产生了强烈的影响(高达400pn，而与之相比在没有α
‑
sa的情况下为130pn，图4b)，这表明发生了向多价相互作用的转变。在α
‑
sa存在的情况下，在t3sa+和jam
‑
a之间观察到三个或更多个同时不相关的病毒受体键(图5b)，从而引起整体亲合力增加。相反，与lnnt进行温育对t3sa+与jam
‑
a的整体结合没有产生影响(图5d)，这表明所观察到的行为需要唾液酸基团。由于t3sa
‑
未观察到这种行为(图6a
‑
c)，所以α
‑
sa触发的多价相互作用可归因于血清型3σ1尾部结构域中唾液酸化聚糖和聚糖结合位点之间复合物的形成(图7b)。
[0260]
我们假设α
‑
sa与σ1的结合可以诱导σ1中的构象变化。为了研究这一假设，我们定义了t3sa+感染性亚病毒粒子颗粒(isvp)的结合潜能(图5e)。在对病毒粒子进行蛋白水解处理以产生isvp之后，σ1通过cryoem图像重建出现以呈现出更延伸的状态(从颗粒表面放射状突出)(dryden et al.early steps in reovirus infection are associated with dramatic changes in supramolecular structure and protein conformation:analysis of virions and subviral particles by cryoelectron microscopy and image reconstruction.the journal of cell biology 1993,vol.122,1023
‑
1041)(图7a)。这一观察结果提供了一种工具以测试isvp
‑
jam
‑
a相互作用是否在存在α
‑
sa和σ1的潜在更扩展构象异构体的情况下模拟病毒粒子
‑
jam
‑
a相互作用。值得注意的是，我们观察到了t3sa+isvp与jam
‑
a之间的强烈相互作用，这与t3sa+病毒粒子与α
‑
sa温育后与jam
‑
a的相互作用相当，这表明α
‑
sa与σ1结合会诱导蛋白构象发生变化，增强其对jam
‑
a的亲和力。此外，对呼肠孤病毒病毒粒子和jam
‑
a之间建立的键的数量的分析表明，在与α
‑
sa结合后，呼肠孤病毒
‑
jam
‑
a的结合电位增加至与isvp相似的程度(图5f、g)。我们还测试了用游离α
‑
sa进行处理是否可以增强isvp与jam
‑
a的结合(图5g、图16、图6d)。然而，α
‑
sa处理后没有观察到isvp
‑
jam
‑
a相互作用发生明显变化。因此，在α
‑
sa激活t3sa+后，σ1蛋白似乎经历了构象
的变化为更延伸的形式。
[0261]
为了测试这种激活机制是否发生在细胞环境中，我们探测了呼肠孤病毒与lec2
‑
jam
‑
a细胞的结合，并监测了注射neu5ac、lsta或lnnt后的粘附行为(图8、图9)。由于lec2
‑
jam
‑
a细胞缺少唾液酸化聚糖，且呼肠孤病毒与lec2细胞的结合很少(<1％，图9)，所以我们假设呼肠孤病毒与lec2
‑
jam
‑
a细胞的大多数相互作用是通过jam
‑
a受体建立的。因此，我们利用该细胞系研究了注射的聚糖衍生物对呼肠孤病毒
‑
jam
‑
a相互作用的影响，并比较了聚糖注射前后的总结合频率。我们观察到，仅注射具有末端α
‑
sa的聚糖(neu5ac和lsta)后t3sa+结合效率提高。注射α
‑
sa
‑
聚糖(neu5ac和lsta)后，t3sa+病毒粒子显示出显著的约20
‑
25％的结合增加(图9；对于neu5ac，从3.9％增加至4.9％，且对于lsta，从3.8％增加至4.8％)。相反，我们在注射缺少α
‑
sa的lnnt之后没有观察到结合增加(图9；从3.8％增加至3.9％)。为了评估lec2细胞上残留的sa是否会影响我们的结果，我们用神经氨酸酶(40munit/ml，1小时)对lec2细胞进行处理以切割残留的细胞表面α
‑
sa聚糖(图8)。与使用未经处理的细胞得到的结果相似，我们观察到在经神经氨酸酶处理的lec2细胞上注射neu5ac后，t3sa+结合增加约20％。这些结果表明，与sa的相互作用增强了呼肠孤病毒与细胞表面jam
‑
a的结合，而lec2细胞表面上残留的sa对呼肠孤病毒的相互作用影响最小。
[0262]
为了定量呼肠孤病毒与细胞表面受体结合的多价性，我们分析了结合力分布(图8p
‑
s)。检查显示高力范围内的结合事件的粘附图像(图8c、e、h、j、m、o)表明，这些事件的结合频率在与α
‑
sa一起温育后显著增加。这一观察结果与我们的体外数据一致，证实了由α
‑
sa温育引发的病毒粒子结合电位的变化。对t3sa+病毒粒子与细胞表面上jam
‑
a分子之间建立的键的数量的分析(图8t)证实了这种增强的多价性。在通过α
‑
sa激活后，键的平均数量增加了2.5倍，从聚糖注射之前的1.8
±
0.3个键增加到聚糖注射后的4.5
±
1.2个键。总之，这些数据证明，α
‑
sa与σ1结合增强了σ1对jam
‑
a的亲和力，这可能是(但不受任何假设的限制)诱导构象变化的结果。
[0263]
实施例5—触发呼肠孤病毒的多价锚定改变了病毒粒子的结合和扩散电位
[0264]
为了评估α
‑
sa对呼肠孤病毒与jam
‑
a结合的动力学的影响，我们采用了光学生物层干涉测量术(bli)和基于荧光显微镜的单粒子跟踪法(spt)。
[0265]
利用bli技术，我们定量了呼肠孤病毒与包被有jam
‑
a的ni
2+
‑
nta生物传感器的结合，并测试了游离neu5ac对整体亲合力的影响。数据表明，t3sa+和t3sa
‑
以高亲合力(kd约nm范围)与jam
‑
a结合(图10a、b)。正如所预期的，游离neu5ac对t3sa
‑
结合没有影响。与此明显不同的是，与游离neu5ac和isvp一起温育的t3sa+病毒粒子对jam
‑
a具有更高的亲合力，达到非常高亲和力(kd约pm范围)(图10a)。这些观察结果与我们的afm数据一致，这表明与α
‑
sa化合物温育的t3sa+病毒粒子的结合电位与isvp相当。
[0266]
用高速共聚焦显微镜通过spt动态评估呼肠孤病毒与活细胞表面的结合。荧光标记的t3sa+病毒粒子和与cho
‑
jam
‑
a细胞共培养的mcherry标记的lec2
‑
jam
‑
a细胞进行温育。在存在或不存在1mm neu5ac的情况下记录图像的时移系列(图10c
‑
f)。t3sa+颗粒在缺少sa的细胞(lec2细胞)上扩散更快，而颗粒在表达sa和jam
‑
a受体(cho
‑
jam
‑
a)的细胞上则更稳定。将病毒颗粒与neu5ac一起注射导致它们的扩散电位显著降低(图10f)。对每种细胞类型上至少15个颗粒的轨迹进行分析表明，病毒粒子在缺少α
‑
sa聚糖的细胞上扩散的距离更大且速度增加(图10g)。此外，注射游离sa降低了t3sa+在细胞表面的扩散(这可能是由于
能够介导与jam
‑
a的多价相互作用的能力)，并显著增加了与cho
‑
jam
‑
a细胞结合的颗粒的数量(图10g)。重要的是，在非sa结合株t3sa
‑
中未观察到这种影响(图10g)。总之，这些观察结果加强了我们的结论，即σ1与α
‑
sa的结合诱导σ1构象发生变化，从而导致病毒与细胞表面受体的多价附着增加。
[0267]
实施例2
‑
5的结论
[0268]
我们使用afm与共聚焦显微镜组合来对促进呼肠孤病毒进入细胞的细胞质膜的基本成分进行力探测和表征。呼肠孤病毒附着蛋白σ1的晶体结构显示为细长纤维，其尾部结构域由α
‑
螺旋卷曲螺旋和三
‑
β螺旋形成，且头部结构域由八链β
‑
桶形成。作为启动呼肠孤病毒进入的主要因素，血清型3呼肠孤病毒的σ1在尾部结构域和头部结构域都含有受体结合区。尾部结构域的三
‑
β螺旋与α
‑
sa结合，头部结构域与jam
‑
a结合。
[0269]
利用单病毒力谱术，我们通过定量呼肠孤病毒与各受体的结合强度，以及提取单个键的动力学参数，研究了呼肠孤病毒与α
‑
sa和jam
‑
a两者的结合。利用模型表面和活细胞进行的afm实验使我们能够确定细胞环境中相互作用的多价性。在呼肠孤病毒与细胞表面结合的过程中，我们观察到与α
‑
sa的三个平行相互作用和与jam
‑
a的两到三个相互作用是有利的。这一发现表明，σ1三聚体的每个单体上的受体结合结构域可以独立地与受体α
‑
sa和jam
‑
a接合。这些结果也证实了，已建立的键的数量有助于病毒受体结合的整体亲合力。不希望受到任何理论或假设的约束，对单个受体分子的亲和力可能非常低(对于单蛋白
‑
聚糖相互作用，在mm范围内)，但由于多价相互作用可以增加到显著的亲合力值(在nm范围内)。在呼肠孤病毒的情况下，在降落在细胞表面上并与受体结合后，病毒粘附至限制位置，在该位置它将以信号诱导的方式被内吞。最大化键的数量可能有助于降低病毒粒子的横向扩散。在此背景下，如本文所进行的在单个病毒粒子水平上提取病毒受体键的数量允许我们理解感染过程的起始。
[0270]
附着因子通常介导缺乏特异性的弱相互作用，并将病毒拴在细胞表面，从而允许进入特定的进入介质。我们意外地发现，呼肠孤病毒σ1尾部与α
‑
sa的结合增强了σ1头部与jam
‑
a的结合。由于α
‑
sa介导的病毒粒子对jam
‑
a亲和力提高模拟了isvp(含有更延伸的σ1构象)对jam
‑
a的亲和力，不希望受到任何假设的约束，我们的数据证实了σ1与α
‑
sa的结合触发了σ1蛋白构象发生变化，使得jam
‑
a结合位点更容易接近。从分子的角度来看，一个有吸引力的假设是α
‑
sa与σ1尾部的结合诱导l203
‑
p204键的顺反异构化，从而导致向更延伸形式蛋白的重要构象变化(图10h)。与α
‑
sa结合(以低亲和力接合)作为初始附着事件，并触发σ1蛋白的构象变化，其进一步增强与高亲和力jam
‑
a受体的特异性相互作用。我们的发现为疫苗和溶瘤应用提供了操纵呼肠孤病毒结合效率和传染性的独特机会。
[0271]
实施例6—呼肠孤病毒感染体外培养细胞
[0272]
如实施例1所述制备t3sa+和t3sa
‑
呼肠孤病毒原种，并纯化获得的病毒粒子。如实施例1中所述制备和培养lec2、lec2
‑
jam
‑
a、cho和cho
‑
jam
‑
a细胞。
[0273]
用呼肠孤病毒以合适的感染复数(moi)以分批悬浮液或单层形式感染细胞，并通过适当的测定法(如，定量感染细胞中的病毒蛋白表达或噬斑测定)分析感染性。
[0274]
t3sa+病毒感染性增加如下：lec2<cho<<lec2
‑
jam
‑
a<cho
‑
jam
‑
a。
[0275]
t3sa
‑
病毒感染性增加如下：lec2～cho<<lec2
‑
jam
‑
a～cho
‑
jam
‑
a。
[0276]
抗
‑
jam
‑
a抗体中和t3sa+或t3sa
‑
病毒感染性。
[0277]
用lec2
‑
jam
‑
a和cho
‑
jam
‑
a细胞进行进一步实验。
[0278]
唾液酸化聚糖neu5ac或lsta与病毒共同施用(与病毒混合，或从单独的小瓶添加到细胞中)，且与不含neu5ac或lsta的t3sa+相比，显著增加了t3sa+对lec2
‑
jam
‑
a和cho
‑
jam
‑
a的感染性。
[0279]
唾液酸化聚糖neu5ac或lsta不影响t3sa
‑
对lec2
‑
jam
‑
a或cho
‑
jam
‑
a的感染性。
[0280]
与不含lnnt的t3sa+相比，非唾液酸化聚糖lnnt不影响t3sa+对lec2
‑
jam
‑
a和cho
‑
jam
‑
a的感染性。
[0281]
实施例7—用呼肠孤病毒感染小鼠
[0282]
如实施例1所述制备t3sa+和t3sa
‑
呼肠孤病毒原种，并纯化获得的病毒粒子。
[0283]
使小鼠经口接种107或10
10
个病毒空斑形成单位(pfu)，并在感染后4
‑
7天使用实时pcr定量小肠内的病毒滴度。
[0284]
检测病毒感染的说明性方法包括pcr、荧光成像或elisa(参见例如bouziat et al.reovirus infection triggers inflammatory responses to dietary antigens and development of celiac disease.science 2017,vol.356,pp.44
‑
50；montufar
‑
solis and klein.experimental intestinal reovirus infection of mice:what we know,what we need to know,immunol res.2005,vol.33,257
–
265)或生物发光测定法(参见例如pan et al.visualizing influenza virus infection in living mice.nature communications 2013,vol.4,2369)。
[0285]
或者，感染小鼠的呼吸道，并基本如flano等人所述测定感染性(methods used to study respiratory virus infection.curr protoc cell biol.2009,chapter:unit
–
26.3)。使用标准的程序，包括(i)用于小鼠感染、组织取样和保存的基本技术，(ii)病毒滴度测定，使用流式细胞术分离和分析淋巴细胞和树突状细胞，以及(iii)肺组织学、免疫组织化学和原位杂交。
[0286]
在这些模型中，t3sa+比t3sa
‑
更具感染性。唾液酸化聚糖neu5ac或lsta与病毒共同施用(与病毒混合，或从单独的小瓶添加到小鼠体内)，并且与不含neu5ac或lsta的t3sa+相比，显著增加了t3sa+的感染性。唾液酸化聚糖neu5ac或lsta不影响t3sa
‑
的感染性。非唾液酸化聚糖lnnt不影响t3sa+的感染性。
[0287]
实施例8—疫苗
[0288]
以下组合物示出了体现本发明原理的疫苗。
[0289]
禽呼肠孤病毒疫苗a。一种疫苗组合物，其包含活减毒呼肠孤病毒s 1133株(可从msd animal health以reo 1133获得)，至少103ccid
50
/剂量(0.2ml)，补充有1mm n
‑
乙酰神经氨酸(neu5ac)。
[0290]
禽呼肠孤病毒疫苗b。一种疫苗组合物，其包含活减毒呼肠孤病毒s 1133株，至少103ccid
50
/剂量(0.2ml)，补充有10mm n
‑
乙酰神经氨酸。
[0291]
禽呼肠孤病毒疫苗c。一种疫苗组合物，其包含活减毒呼肠孤病毒s 1133株，至少103ccid
50
/剂量(0.2ml)，补充有1mm唾液酸
‑
乳糖
‑
n
‑
四糖a(lsta)。
[0292]
禽呼肠孤病毒疫苗d。一种疫苗组合物，其包含活减毒呼肠孤病毒s 1133株，至少103ccid
50
/剂量(0.2ml)，补充有10mm lsta。
[0293]
人呼肠孤病毒疫苗a。活减毒人呼肠孤病毒1型lang株，至少106ccid
50
/口服剂量
(1.5ml)，补充有1mm neu5ac，或1mm lsta，或10mm neu5ac，或10mm lsta。悬浮液含有蔗糖作为稳定剂。
[0294]
人呼肠孤病毒疫苗b。活减毒人呼肠孤病毒2型jones株，至少106ccid
50
/口服剂量(1.5ml)，补充有1mm neu5ac，或1mm lsta，或10mm neu5ac，或10mm lsta。悬浮液含有蔗糖作为稳定剂。
[0295]
人轮状病毒疫苗a。活减毒人轮状病毒rix4414株(可从glaxosmithkline以获得)，至少106ccid
50
/口服剂量(1.5ml)，补充有1mm neu5ac，或1mm lsta，或10mm neu5ac，或10mm lsta。悬浮液含有蔗糖作为稳定剂。
[0296]
人轮状病毒疫苗a。活减毒人
‑
牛轮状病毒重配g1型(不少于2.2x106个感染单位(iu))、g2型(不少于2.8x106iu)、g3型(不少于2.2x106iu)、g4型(不少于2.0x106iu)和p1a[8]型(不少于2.3x106iu)(可作为从merck vaccines获得的的一部分)，每剂口服剂量为2.0ml，补充有1mm neu5ac，或1mm lsta，或10mm neu5ac，或10mm lsta。悬浮液含有蔗糖作为稳定剂。
[0297]
实施例9—溶瘤制剂
[0298]
以下组合物示出了体现本发明原理的溶瘤制剂。
[0299]
溶瘤制剂a。一种非致病性溶瘤人野生型呼肠孤病毒3型dearing株，3x10
10 ccid
50
/剂量，配置为静脉内施用，补充有1mm neu5ac，或1mm lsta，或10mm neu5ac，或10mm lsta。
[0300]
溶瘤制剂b。一种与针对肿瘤特异性抗原的单结构域vhh抗体共价偶联的非致病性溶瘤人野生型呼肠孤病毒3型dearing株。该抗体含有与其共价偶联的neu5ac或lsta。3x10
10 ccid
50
/剂量，配置为静脉内施用。