用于治疗皮特-霍普金斯综合征的米诺环素的制作方法

用于治疗皮特
‑
霍普金斯综合征的米诺环素
技术领域
1.本发明涉及皮特
‑
霍普金斯综合征(pitt
‑
hopkins syndrome，pths)的治疗。


背景技术：

2.皮特
‑
霍普金斯综合征是一种由参与胚胎神经元分化的tcf4的分子变体引起的罕见的遗传性神经病症。
3.pths的特征在于独特的面部特征(综合征面部)、发育迟缓(精神运动迟缓)、智力残疾、早发性近视、癫痫发作、便秘和呼吸异常(过度换气
‑
呼吸暂停发作，即其呼吸急促的复发性发作，通常随后是其难以呼吸或暂时停止呼吸的发作)和低肌肉张力(张力减退)。另外的症状包含重复性非功能性手部移动和行为异常，如活动过度和焦虑。许多受影响的个体符合自闭症谱系病症的标准。
4.pths是由染色体18q21.2上发现的tcf4基因的致病性变体引起的。这种综合征于1978年首次在两个不相关的个体中进行描述，所述两个不相关的个体共享变形的面部特征、发育迟缓、杵状指和异常呼吸模式的类似特性。在2007年鉴定出tcf4基因(mim编号：602272)，从而证实继发于tcf4的单倍剂量不足的常染色体显性遗传模式之前，假定所述综合征是一种常染色体隐性病症。转录因子4(tcf4的蛋白质产物)是一种被认为参与早期大脑发育和神经元分化的基本的螺旋
‑
环
‑
螺旋e
‑
蛋白。
5.目前还没有治疗pths的有效疗法。需要用于治疗pths的疗法。
6.米诺环素是用于治疗细菌感染和寻常痤疮的四环素抗生素。米诺环素的系统名称为(4～{s},4～{a}～{s},5～{a}～{r},12～{a}～{r})
‑
4,7
‑
双(二甲氨基)
‑
1,10,11,12～{a}
‑
四羟基
‑
3,12
‑
二氧代
‑
4～{a},5,5～{a},6
‑
四氢
‑
4～{h}
‑
并四苯
‑2‑
甲酰胺。


技术实现要素：

7.本发明是一种米诺环素或其药学上可接受的盐，其用于治疗pths。如根据以下呈现的体内数据将显而易见的，米诺环素在治疗pths中是有效的。用米诺环素长期治疗显著改善了tcf4+/
‑
小鼠表型、挽救条件恐惧、旷场、筑巢、自我理毛、社交和力量测试。这是米诺环素在pths疗法中有用的证据。
8.本发明的第一方面是用于治疗皮特
‑
霍普金斯综合征的米诺环素或其药学上可接受的盐。
附图说明
9.图1示出了米诺环素体内条件恐惧测试(学习和记忆)的结果。
10.图2示出了米诺环素体内旷场测试(活动过度)的结果。
11.图3示出了米诺环素体内筑巢测试(日常生活测试)的结果。
12.图4示出了米诺环素体内自我理毛(刻板动作(stereotypy)，即重复性移动)测试的结果。
13.图5示出了米诺环素体内社交测试的结果。
14.图6示出了米诺环素体内力量测试(力量)的结果。
15.图7示出了在5个行为测试中的剂量反应实验的结果。
16.在附图中，“ns”意指与野生型对照组没有显著差异。这表明，在行为测试中，经过药物处理的敲除的行为与未经过处理的或经过处理的野生型组相似，这意味着化合物在改善综合征的表型方面显著有效。
具体实施方式
17.患有皮特
‑
霍普金斯综合征的患者具有许多不同的表现和症状。这些包括：活动过度和重复性行为，包含重复性非功能性手部移动；智力受损，如学习和记忆困难，例如认知、执行和语言表现、短期记忆、执行功能、视觉记忆、视觉
‑
空间关系和空间工作记忆困难；刻板动作；社交焦虑(即，社交互动困难)；低肌肉张力(张力减退)；便秘、睡眠障碍、癫痫发作；不规则或异常呼吸模式和严重近视(近视)。
18.在本发明中，并且如由以下体内数据所证明的，米诺环素用于治疗以上症状中的一种或多种症状，并且因此是pths的有效治疗。优选地，米诺环素用于治疗pths，其中患者表现出包含以下的综合征的典型症状：活动过度；社交焦虑；智力受损，特别是学习和记忆困难；刻板动作；和张力减退。
19.术语“智力受损”具有其在本领域中的正常含义。其涵盖学习受损和记忆受损。学习受损也可以称为智力障碍。其涵盖认知受损、智力功能的延迟或限制，如推理。记忆受损是指无法短期或长期地保留信息。其可以包含认知、执行和语言表现、执行功能和视觉记忆困难。其还可以包含工作记忆，也称为短期记忆(即，在处理相同或其它信息的同时临时存储信息)困难和语音记忆(或口头工作记忆)困难。这种症状在“条件恐惧”下的小鼠中进行测试(参见以下体内数据)。
20.术语“活动过度”具有其在本领域中的正常含义。活动过度可以包含注意力持续时间非常短、对视觉、听觉、触觉和嗅觉刺激的超敏反应、注意力分散性、冲动、躁动和/或过度活动。这种症状在“旷场”下的小鼠中进行测试(参见以下体内数据)。
21.术语“日常生活测试”具有其在本领域中的正常含义。其还可能意味着执行物种正常事物的能力，包含所执行的任何日常活动，如寝具、喂养等。这种症状在“筑巢”下的小鼠中进行测试(参见以下体内数据)。
22.术语“刻板动作”具有其在本领域中的正常含义。其还可以被称为重复性移动或重复性行为。这种症状在“自我理毛”下的小鼠中进行测试(参见以下体内数据)。
23.术语“社交焦虑”具有其在本领域中的正常含义。其还可以被称为社交互动困难或社交低。社交焦虑可以包含眼神接触不良、厌恶凝视、开始社交互动的时间延长、社交回避或退缩以及形成同伴关系的挑战。这种症状在“社交”下的小鼠中进行测试(参见以下体内数据)。
24.术语“张力减退”具有其在本领域中的正常含义。这种症状在“力量测试”下的小鼠中进行测试。术语“力”具有其在本领域中的正常含义。其还可以意指投入到行动中的力量或能量。
25.如本文所使用的，药学上可接受的盐是具有药学上可接受的酸或碱的盐。药学上
可接受的酸包含无机酸，如盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸或硝酸；以及有机酸，如柠檬酸、富马酸、马来酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、酒石酸、苯甲酸、乙酸、甲磺酸、乙磺酸、水杨酸、硬脂酸、苯磺酸或对甲苯磺酸。药学上可接受的碱包含碱金属(例如，钠或钾)和碱土金属(例如，钙或镁)氢氧化物和有机碱，如烷基胺、芳基胺或杂环胺。
26.在本发明中，米诺环素可以以多种剂型施用。在一个实施例中，米诺环素可以调配成适合于口服、直肠、肠胃外、鼻内或经皮施用或通过吸入或通过栓剂施用的形式。
27.米诺环素可以例如以片剂、含片、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒的形式口服施用。优选地，将米诺环素调配成使得其适合于口服施用，例如片剂和胶囊。
28.米诺环素还可以肠胃外施用，无论是皮下施用、静脉内施用、肌内施用、胸骨内施用、经皮施用还是通过输注技术。米诺环素还可以以栓剂的形式施用。
29.米诺环素还可以通过吸入施用。与通过口服途径摄取的许多药物相比，吸入药物的优点在于其直接递送到血液供应丰富的区域。由于肺泡具有巨大的表面积和丰富的血液供应，并且绕过首过代谢，因此吸收非常迅速。
30.本发明还提供了含有米诺环素的吸入装置。通常，所述装置是定量吸入器(metered dose inhaler，mdi)，其含有药学上可接受的化学推进剂以将药物推出吸入器。
31.米诺环素还可以通过鼻内施用进行施用。鼻腔的高度可渗透组织非常易于接受药物并且快速且有效地吸收药物。与注射相比，鼻腔药物递送的痛苦和侵入性更小，从而减少患者的焦虑。通过这种方法，吸收会非常迅速并且通常会绕过首过代谢，从而降低患者间的变异性。进一步地，本发明还提供了含有米诺环素的鼻内装置。
32.米诺环素还可以通过经皮施用进行施用。对于局部递送，可以使用经皮和经粘膜贴剂、乳膏、软膏、凝胶剂、溶液或悬浮液。因此，本发明还提供一种含有米诺环素的经皮贴剂。
33.米诺环素还可以通过舌下施用进行施用。因此，本发明还提供了一种包括米诺环素的舌下片剂。
34.米诺环素也可以与通过除了患者的正常代谢之外的过程减少物质的降解的药剂一起调配，如抗菌剂或可能存在于患者体内或活于患者身上或体内的共生或寄生虫有机体中的蛋白酶抑制剂，并且所述蛋白酶能够降解所述化合物。
35.用于口服施用的液体分散体可以是糖浆、乳液和悬浮液。
36.悬浮液和乳液可以含有例如天然树胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇作为载体。用于肌内注射的悬浮液或溶液可以与活性化合物一起含有药学上可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇(例如，丙二醇)，以及如果需要的话，合适量的盐酸利多卡因。
37.用于注射或输注的溶液可以含有例如无菌水作为载体，或者优选地所述溶液可以呈无菌、水性、等渗盐水溶液的形式。
38.在本发明的实施例中，以有效量施用米诺环素以治疗皮特
‑
霍普金斯综合征的症状。有效剂量对于本领域的技术人员而言将是显而易见的，并且取决于医学从业者将能够确定的许多因素，包含年龄、性别、体重。
39.在优选的实施例中，米诺环素是以1mg到300mg，优选地5mg到300mg，更优选地50mg到300mg，最优选地100mg到200mg的剂量施用的。剂量下限优选地为1mg、2mg、3mg、4mg或
5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg或200mg。剂量上限优选地为300mg、290mg、280mg、270mg、260mg、250mg、240mg、230mg、220mg或210mg。任何上述范围的下限或上限可以彼此组合，并且在本文中公开。优选地，所述剂量为1mg到200mg或50mg到200mg。
40.任何上述剂量可以每天一次、每天两次、每天三次或每天四次施用。
41.在本发明的实施例中，米诺环素每天至少施用一次。优选地，其以单个日剂量的形式施用。优选地，单个日剂量为1mg到300mg，优选地100mg到300mg。优选地，单个日剂量为100mg、200mg或300mg。
42.在本发明的实施例中，米诺环素每日施用两次。优选地，每个剂量为1到150mg或100mg到150mg，其中总日剂量为300mg。
43.可替代地，其可以每天施用三次。优选地，每个剂量为100mg。
44.可替代地，其可以每天施用四次。优选地，每个剂量为75mg。
45.优选地，剂量方案使得米诺环素的总日剂量不超过300mg。
46.应当理解，小儿患者可能需要较低的剂量。例如，约2mg的剂量可能适用于小儿患者。
47.为了治疗皮特
‑
霍普金斯综合征，在慢性剂量方案中使用米诺环素，即慢性、长期治疗。
48.本发明还涉及米诺环素或其药学上可接受的盐在制造用于治疗皮特
‑
霍普金斯综合征的药物中的用途。本发明的此实施例可以具有上述任何优选特征。
49.本发明还涉及一种治疗皮特
‑
霍普金斯综合征的方法，所述方法包括向患者施用米诺环素或其药学上可接受的盐。本发明的此实施例可以具有上述任何优选特征。施用方法可以根据上述任何途径。
50.为了避免疑问，本发明还涵盖在体内反应以得到本发明的化合物的前药。
51.以下研究展示了本发明。
52.研究1
53.皮特
‑
霍普金斯综合征(pths)的特征在于认知功能障碍、宽口和独特的面部特征以及间歇性高过度换气，随后是呼吸暂停(zweier等人,2007)。人类中与tcf4基因的一个拷贝的丢失相关的认知功能障碍(称为单倍剂量不足)导致皮特
‑
霍普金斯综合征，这是一种与显著学习缺陷相关的自闭症相关病症。
54.皮特
‑
霍普金斯综合征(pths)是一种与转录因子tcf4突变/缺失相关的遗传性神经发育病症。tcf4也可能与精神分裂症有关，这表明精确的致病性突变与细胞、突触和行为后果相关。
55.已经开发了tcf4+/
‑
小鼠模型来模拟pths，并且因此评估潜在的治疗。小鼠在海马体依赖性学习和记忆、空间工作记忆、社交、刻板动作、活动过度和日常生活范例中存在缺陷。tcf4+/
‑
小鼠还表现出后肢握力缺陷。
56.动物
57.小鼠购自杰克逊实验室(the jackson laboratory)并且维持在c57bl/6背景上。小鼠在12:12的明亮:黑暗循环中长大，其中随意获取食物和水。对照由tcf4+/+组成。所有
所使用的小鼠对于tcf4突变是杂合的，因为纯合突变导致胚胎/产后致死率。
58.测定设计
59.在所有测试和数据分析期间，实验是随机的并且对基因型和处理不知情。单独的研究人员制备并编码给药溶液，将小鼠分配到研究处理组，向动物进行给药，并且收集行为数据。
60.处理组
61.研究中每种化合物有四个处理组，其中每个处理组使用10只雄性小鼠(全部小鼠均处理14周龄)：组1：用媒剂处理的野生型同窝仔小鼠(wt+veh)；组2：用媒剂处理的tcf4+/
‑
ko小鼠(tcf4+/
‑
+veh)；第3组：wt+药物；和第4组：tcf4+/
‑
+药物。
62.行为和力量测试
63.这包含：
64.1.条件恐惧(学习和记忆的测试)；
65.2.旷场(活动过度的量度)；
66.3.筑巢(日常生活测试)；
67.4.自我理毛(刻板动作的评估)；
68.5.社交/分区测试(社交焦虑的评估)；
69.6.力量测试(后肢力量的测试)。
70.术语“学习和记忆”具有其在本领域中的正常含义。其还可以被称为记忆受损。其是指无法短期或长期地保留信息。其可以包含认知、执行和语言表现、执行功能和视觉记忆困难。其还可以包含工作记忆，也称为短期记忆(即，在处理相同或其它信息的同时临时存储信息)困难和语音记忆(或口头工作记忆)困难。
71.术语“活动过度”具有其在本领域中的正常含义。活动过度可以包含注意力持续时间非常短、对视觉、听觉、触觉和嗅觉刺激的超敏反应、注意力分散性、冲动、躁动和/或过度活动。
72.术语“日常生活测试”具有其在本领域中的正常含义。其还可能意味着执行物种正常事物的能力，包含所执行的任何日常活动，如床上用品、喂养等。
73.术语“自我理毛”具有其在本领域中的正常含义。其还可以意指自我清洁和维持皮肤、毛发、毛皮等的正常外观。通过持续重复行为而表现过度，这可以被称为“刻板动作”。
74.术语“社交焦虑”具有其在本领域中的正常含义。其还可以被称为社交互动困难或社交低。社交焦虑可以包含眼神接触不良、厌恶凝视、开始社交互动的时间延长、社交回避或退缩以及形成同伴关系的挑战。
75.术语“力”具有其在本领域中的正常含义。其还可以意指投入到行动中的力量或能量。
76.1.条件恐惧
77.tcf4+/_小鼠在指示海马体依赖性记忆和学习缺陷的暗示条件恐惧测试的情景下表现出僵直减少。在情景条件恐惧中使用的依赖性量度是在未经调节的刺激(足底电击)与经调节的刺激(特定情景)配对之后的僵直反应。僵直是对恐惧的物种特异性反应，其被定义为“除了呼吸之外不存在移动”。这可以持续数秒至数分钟，这取决于厌恶刺激的力量、次数的次数以及受试者所达到的学习程度。测试涉及将动物置于新环境(暗室)中，提供令人
厌恶的刺激(对爪子进行1秒电击，0.2ma)，并且然后将其去除。
78.2.旷场
79.旷场设备用于测试活动过度。在30分钟试验旷场期间，与wt同窝仔相比，tcf4+/_小鼠在每分钟行进的距离方面显示出活动过度。所述设备是被分成10
×
10cm网格的灰色pvc封闭的50
×9×
30cm竞技场(arena)。在测试之前5
‑
20分钟将小鼠带到实验室。将小鼠置于面向角落的盘角方格(corner square)中并且观察3分钟。对全身进入的方格的数量(自主活动)进行计数。用视频跟踪装置记录小鼠在场周围的移动，持续3分钟(nt4.0版本，viewpoint)。
80.3.筑巢
81.在单独的笼子中进行测试。普通床上用品覆盖地板至深度为0.5cm。每个笼子均供应有“nestlet”，一种5cm2的压制棉絮(ancare)。在黑暗期之前1小时，将小鼠单独置于巢笼中，并且在第二天早上评估结果。以5分量表对筑巢进行评分。
82.得分1：nestlet在很大程度上未受影响(>90％完整)。
83.得分2：nestlet被部分撕毁(50
‑
90％保持完整)。
84.得分3：nestlet大部分被撕碎，但通常没有可鉴定的巢位点：<50％的nestlet。
85.得分4：可鉴定但扁平的巢，<90％的nestlet被撕毁，将材料聚集成扁平巢(所述扁平巢的壁在不到其圆周的50％上高于在其一侧卷起的小鼠高度)。
86.得分5：(接近)完美巢：>90％的nestlet被撕毁，巢是陷坑，所述巢的壁在其圆周的50％以上高于小鼠身高。
87.4.自我理毛
88.相比于比对照小鼠表现出更高水平的刻板行为的wt小鼠，tcf4+/_小鼠自我理毛的次数显著更多。
89.通常，在坐姿中，小鼠将舔其毛皮、用前爪理毛或用任何肢体抓挠。通常，小鼠将会混合所有这些理毛行为。理毛通常遵循由四种行为构成的序列：
90.‑
椭圆划：前爪在鼻子和口吻上方的椭圆不对称移动，大幅度的划动和小幅度的划动交替。
91.‑
单侧划：前爪交替抚摸触须和眼睛。
92.‑
双侧划：前爪从耳朵后开始，并且经过整个脸，两侧对称的大幅度的抚摸。
93.‑
身体舔：舔整个身体，通常从头开始舔到尾部。
94.5.分区测试
95.在三室社交任务中，评估测试小鼠(subject mouse)对新型社交刺激(新型小鼠)的探索。当测试小鼠被提出选择与新型小鼠或空杯待在一起时，三室社交接近任务监测直接的社交接近行为。社交被定义为测试小鼠在含有小鼠的室中所花费的时间比在空室中所花费的时间多。社交新奇偏好被定义为在室中与新型小鼠待在一起的时间更多。所述设备是矩形三室箱子，其中每个室的测量大小为20cm(长度)
×
40.5cm(宽度)
×
22cm(高度)。分隔壁由透明的复杂材料(perplex)制成，带有允许进入每个室的小开口(10cm宽度
×
5cm高度)。三室任务从下方照亮(10勒克斯)。允许小鼠在三个10分钟试验中自由探索三室设备。在试验期间，将一个金属丝杯倒置放置在侧室中的一个侧室中，并且将新型小鼠放置在另一个侧室中的另一个金属丝杯下面(新型小鼠刺激)，使中间室为空。新小鼠在整个试验中
的位置被抵消，以使由于对室位置的偏好而引起的任何潜在混杂最小化。将探索新小鼠所花费的时间记为探索比率。
96.6.力量测试
97.当与wt小鼠相比时，tcf4+/
‑
小鼠的后肢力量(不是前肢)表现出显著缺陷。用握力计(圣地亚哥仪器公司(san diego instruments))测试后肢的神经肌肉功能。小鼠的颈背被套住，尾巴被抓住，并且被举到直立位置。然后，将小鼠朝设备放低，允许其抓握光滑的金属网格(仅后肢)，并且在水平面中向后拉。记录释放抓握时施加在网格上的力。
98.行为数据的统计分析
99.通过双向方差分析(anova)分析数据，随后在适当情况下使用图基多重比较测试(tukey's multiple comparison test)进行测试后比较。数据表示为平均值和平均值的标准误差(sem)。
100.结论
101.如根据以上数据显而易见的，用米诺环素长期治疗tcf4+/
‑
小鼠显著改善了学习和记忆；活动过度；日常生活测试；刻板动作；社交焦虑和力量测试。由于小鼠模型模拟pths，这是米诺环素对pths具有治疗效果的证据。
102.研究2
103.按照上述方案进行剂量反应实验。结果示于图7中。米诺环素挽救了30mg/kg的所有行为测试。